Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Özet

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Özet

Glioblastomas (GBM), grade IV malign gliomalar, agresif özellikleri nedeniyle en ölümcül insan kanseri türlerinden biridir. Bu tümörlerin genetiğindeki önemli gelişmelere rağmen, GBM hücrelerinin sağlıklı beyin parankimini nasıl istila ettiği iyi anlaşılamamıştır. Özellikle, GBM hücrelerinin peritümoral alanı farklı rotalarla istila ettiği gösterilmiştir; bu makalenin ana ilgisi beyaz madde yolları (WMTs) boyunca rotadır. Tümör hücrelerinin peritumoral sinir hücresi bileşenleri ile etkileşimleri iyi karakterize değildir. Burada nöronların GBM hücre invazyonunun üzerindeki etkisini değerlendiren bir yöntem tanımlanmıştır. Bu makale, GBM kök benzeri hücrelerin nöronlar üzerindeki göçünü analiz ederek WMT invazyonunun taklit edildiği gelişmiş bir ortak kültür in vitro testini sunun. GBM hücrelerinin nöronların varlığındaki davranışları, açık kaynaklı ve serbest erişimli yazılımlarla otomatik bir izleme prosedürü kullanılarak izlenir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar için birçok uygulamanın yanı sıra GBM hücre göçini engelleyebilen farmakolojik ajanların nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için yararlıdır.

Giriş

GBM'ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs¹boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer'in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç². Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM'nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).

Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon^3'ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir⁴. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi^5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3'ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.

Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)^7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.

Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9^,10^,11'de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir¹². Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.

Protokol

Tüm hastalardan (yerel etik kurul yönetmeliklerine göre Norveç'in Bergen kentindeki Haukeland Hastanesi'nden) bilgilendirilmiş yazılı onay alınmıştır. Bu protokol Bordeaux Üniversitesi insan ve hayvan araştırma etik kurullarının yönergelerine uyar. Hamile sıçanlar Bordeaux Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı ve tedavi edildi. E18 zamanlı hamile bir sıçanın ötanazisi CO₂kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan işlemleri kurumsal yönergelere göre yapılmış ve yerel etik kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm ticari ürünlere Malzeme Tablosundaatıfta bulunulmaktadır.

1. Desenli slaytların hazırlanması

1. Mikropatterning için substrat hazırlığı
   1. 18 mm dairesel cam kapakları 5 dakika boyunca hava/plazma aktivasyonu ile tedavi edin. Kapakları 100 μL (3-aminopropil) triethoxysilane ile kapalı bir odaya 1 saat boyunca bir kurutucuya yerleştirin.
   2. 10 mM karbonat tamponunda 100 mg/mL poli (etilen glikol)-süksinimimidyl değer (moleküler ağırlık 5.000 (Peg-SVA)) ile 1 saat boyunca pH > 8 ile kuluçkaya yatırın. Ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın ve kimyasal bir kaputun altında kurulayın.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
   3. Fosfat tamponlu saline (PBS) 14,7 mg/mL'de fotoinitiatör olan 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium klorürü (PLPP) ekleyin.
      NOT: Plpp jelinin konsantre bir formu da kullanılabilir. PEG fırçasını (100 mJ/mm²⁾bozmak için gereken daha kısa ultraviyole (UV) aydınlatma süresi ile sonuçlanır.
2. Fotoinitiator jel biriktirme
   1. Slaytın ortasına biriktirmek için 3 μL PLPP jel ve 50 μL mutlak etanol karışımı hazırlayın. Mutlak etanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi kimyasal bir kaputun altına yerleştirin.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
3. Cam slayt mikropatterning
   1. Kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.
   2. Öngörülen mikropatternlere karşılık gelen görüntüleri yazılıma yükleyin. Bu parametreleri uygulayın: replikasyon 4 x 4 kez, 200 μm aralık, UV dozu 1.000 mJ / mm². Otomatik UV aydınlatma dizisinden sonra PLPP'yi birden fazla PBS yıkama ile durulayın.
      NOT: PLPP jel kullanılmışsa, deiyonize su ile kapsamlı yıkamalarla çıkarın, N₂akışında kurulayın ve 4 °C'de saklayın.
   3. 30 dakika boyunca laminin (PBS'de 50 μg/ mL) ile kuluçkaya yatın. PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın.
      NOT: Saflaştırılmış yeşil floresan proteinin floresan çözeltisi (PBS'de GFP, 10 μg/mL) laminin ile karıştırılarak mikropatternlerin floresan mikroskopisi ile görselleştirilmesi istenebilir.

2. Nöronların ve GBM hücrelerinin ortak kültür için hazırlanması

1. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların kültürü
   1. Embriyonik (E18) sıçanların hipokampuslarını parçalara parçalara parçalar ve dokuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethaneslfonic acid (HEPES)/penisilin-streptomisin çözeltisine 15 mL'lik bir tüpte aktarın. Hipokampusu kurutmadan fazla çözeltiyi çıkarın.
   2. Penisilin (10.000 birim/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) ve 1 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. HBSS/HEPES/penisilin-streptomisin çözeltisi ile 2x yıkayın ve dokunun bu çözeltide 2-3 dakika kalmasını sağla.
   3. Her doku ile 10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, köpürmeyi en aza indirmeye özen göstererek, iki alev cilalı Pasteur pipet kullanarak dokuyu ayrıştırın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun uygulanabilirliğini değerlendirin. Nöronları aşağıda belirtildiği gibi mikropatterned kapak örtüleri üzerine plakalayın.
      NOT: Ekstraksiyondan sonra hücre canlılık oranı %85-90'dır.
2. Mikropatterned kapaklarda nöronlar için hücre kültürü
   1. PBS ile mikropatterned cam slaytları yeniden sulandırın ve komple nöronal hücre kültürü ortamını kuluçkaya yatırın.
   2. E18 Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen hipokampal nöronları, %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobakal ortamda (NBM) cm² başına 50.000 hücre yoğunluğunda doğrudan mikropatterned cam kapak sapının üzerine tohum atın. Mikropatterned nöronları 48 saat boyunca inkübatöre (37 °C, % 5 CO₂₎yerleştirin.
      NOT: ~6 saat sonra, primer hipokampal nöronlar laminin mikropatternlerine bağlı olarak görülebilir.
3. Nöronlar üzerinde insan GBM kök benzeri hücrelerin ortak kültürü
   NOT: Bu çalışma için, membran GFP pozitif ve nükleer-domates hasta kaynaklı GBM hücreleri daha önce yayınlanan protokollere göre yetiştirilmiştir¹⁰.
   1. Küresel şekilli hücreler süspansiyonda büyüdükçe, süspansiyonu 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Küreselleri 5 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca hücre ayrıştırma reaktifinin 0,5 mL'si ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosunabakın).
   2. 4,5 mL tam NBM ekleyin (B27 takviyesi, heparin, fibroblast büyüme faktörü 2, penisilin ve streptomisinin daha önce açıklandığı gibi⁸ile tamamlanır) ve otomatik sayım tekniği kullanarak hücreleri sayın.
   3. NBM'deki mikropatterned nöronal kültürün üzerinde %3 at serumu ile zenginleştirilmiş 1.000 GBM hücre tohum. Plakayı 37 °C, %5 CO₂ve %95 nemde kuluçkaya yatırın.

3. Canlı hücre görüntüleme

1. GBM hücre tohumlamadan hemen sonra, numuneyi termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Yazılımda çok boyutlu bir alım araç kutusu kullanarak birden fazla pozisyonu kaydetmek için motorlu bir aşama ile donatılmış mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Sıcaklık (37 °C) ve gaz kontrollü (%5_CO2) ortamda 20x hedefle 12 saat boyunca her 5 dakikada bir parlak alan ve epifluoresans GFP/Domates görüntüleri elde edin.

4. Görüntü analizi

NOT: Fiji kullanılarak, iki boyutlu (2D) görüntü yığını yarı otomatik olarak ev yapımı ve kullanıcı dostu bir araç kullanılarak (bu adreste mevcuttur: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), IJ1 makro dilinde yazılmıştır (Şekil 2A). Otomatik iş akışı ve yordamlar Şekil 2B'de özetlenmiştir.

1. Nöronal ağ analizi (Şekil 2Bi)
   1. Yığının bir görüntüsünü seçin. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığıve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Ağ aracını sağ tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Ağ aracını sol tıklatın.
      1. Seçili görüntüyü çoğaltın ve üç renk kanalına bölün (Kırmızı-Gri-Yeşil).
      2. Gri kanalı (brightfield) seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı geliştirmek için kontrast uzatma geliştirme (CSE) gerçekleştirin. Kenar Bul komutu altında zaten gruplanmış olan 2D sinyal işleme konvolüzyon işlemini gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü (SED) kullanın.
      3. Çift filtreleme (F) için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Siyah pikseller (hücre alanı) ve beyaz pikseller (arka plan) içeren ikili bir resim (BIN-gri) elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları yürüterek Maskeye (CM) dönüştürün. Hücre alanını basit bir ağa (NET) iskeletleştirin (Sk) ve küçük, ağ bağlantısı olmayan parçacıkları kaldırarak net görüntüdeki parçacıkları (EP) filtreleyin.
      4. Kırmızı ve yeşil kanallar (çekirdek ve membran) için çift filtrelemegerçekleştirin, uyarlanmış eşik yöntemini kullanarak Maske'ye dönüştürün ve BIN-green'in Parçacıkları Çözümle komutuyla hücre morfolojisini belirlemesine izin verin.
      5. İlgi alanlarını (ROI) kullanarak tüm kanalları OR (birleştirme) işleciyle birleştirin ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirin.
2. Tek hücreli hareketlilik analizi (Şekil 2Bii)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak için Tek Hücre İzleme aracına sağ tıklayın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, İz türü = Çekirdek veya Zar, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Z projeksiyonu = Maksimum yoğunluk, Toplam Dilimler..., Gauss Bulanıklığı ve Ortanca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Tek Hücreli İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın. Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturacak yığına bir Z projeksiyonu uygulayın (T yığını). Çift filtre uygula ve hücrelerin bıraktığı izleri maskele'ye dönüştür. Bin-kırmızı/yeşil görüntüye küçük parçacıkları kaldırın.
      2. Yatırım getirisini kullanarak, hücre izlemenin her konturunun öğesini seçin ve sonraki adımlar için bu ön işleme adımını atlamak üzere Seçenekler iletişim kutusunda Kenar algılamayı atla kutusunu işaretleyin.
      3. Kırmızı kanalı(İz türü = Çekirdek) özgün yığında yalıtın. Bir yatırım getirisi seçin ve dış alanı kaldırın. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve Maske'ye (BIN-red) dönüştürün. Her binarized çekirdeğin centroid X/Y konumunu belirleyin.
   3. Elektronik tablo yazılımı¹³için zaten yayımlanmış bir makro kullanarak, bu hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplayın.
3. Çok hücreli izleme analizi (Şekil 2Biii)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için İzleme aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın.
      2. Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi iki katınaçıkarın ve Maske 'ye dönüştürün.
      3. Görüntü Hesaplayıcısı'nıkullanarak kanalları birleştirin ... ve operatörü ile komut vererek, yalnızca zarlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakır.
         NOT: Fiji'deki birkaç eklenti, bu ikili önceden işlenmiş görüntüdeki birkaç hücrenin X/Y konumunu aynı anda belirlemek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
   3. Daha önce açıklanan makro¹³'ü kullanarak, bu hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirme oranını, yönlülük oranını ve ortalama hızı hesaplayın.
4. Sinir paspasında küresel göç (Şekil 2Biv)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için Ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Geçiş aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Geçiş aracını sol tıklatın.
      1. Kırmızı kanalı kaldırın.
      2. Yeşil ve gri kanalları bölün.
      3. Gri kanal için, nöronal paspasın konturunu manuel olarak çizin ve alanını ölçün.
      4. Yeşil kanal için, yığını çift filtreleyin ve Maske 'ye dönüştürün. Desenin (BIN) dışındaki alanı kaldırın ve her görüntü için binarized hücre alanını belirleyin.
         NOT: Yukarıda açıklanan parametreler, ilgi çekici simgeye sol tıklayarak değerleri değiştirerek kalibre edilir. Bu işlem manuel olarak yapılabilir. Ancak, çok sayıda görüntü (satın alma başına yaklaşık yüz), kanallar (genellikle 3 kanal) ve işleme adımları için otomatik veya yarı otomatik bir araç tercih edilir.

Sonuçlar

Protokol bölümünde açıklandığı gibi floresan GBM hücreleri ile birlikte kültürlenen desenli nöronlar hazırlandı ve izleme deneyleri yapıldı. GBM hücreleri nöronlara göç ederken şekillerini hızla değiştirdi (Şekil 1B: panel 6 ve Video 1). Hücreler rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göç etti (Video 1). Floresan GBM hücreleri ve floresan olmayan nöronlar kolayca ayırt edilebilir ve bu, protokol bö...

Tartışmalar

Glioblastomas, farklı modlar kullanarak parenkimayı kapsamlı bir şekilde istila eder: WMTs^18'dekan damarlarını çevreleyen ortak seçenek, interstisyel istila veya istila . Bu ikinci mod, literatürde WMT istilası ile ilgili uygun in vitro veya in vivo modelleri bulma zorluğu nedeniyle iyi karakterize değildir. Burada, kültürlü kemirgen nöronlarının laminin kaplı yüzeylerde desenli olduğu ve nöronların üzerine floresan GBM kök benzeri hücrelerin tohum edild...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells