JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم هذا البروتوكول المراسلات الفلورية وفرز الخلايا لتبسيط التجارب في الماكروفاج وخطوط الخلايا التائية. وتستخدم اثنين من البلازميدات لهذه التجارب المبسطة في طرق، وهي CRISPR/Cas9- وDsRed2 التعبير عن البلازميد وplasmid المانحة إعادة التركيب متجانسة التعبير عن EBFP2، والتي يتم دمجها بشكل دائم في مكان Rosa26 في الخلايا المناعية.

Abstract

تتطلب دراسات الجينوم الوظيفية للجهاز المناعي التلاعب الجيني الذي ينطوي على حذف الجينات المستهدفة وإضافة عناصر إلى البروتينات ذات الاهتمام. تحديد وظائف الجينات في نماذج خط الخلية مهم لاكتشاف الجينات واستكشاف الآليات الجوهرية للخلايا. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني للخلايا المناعية مثل الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة باستخدام CRISPR / Cas9 بوساطة طرق في صعبة بسبب انخفاض كفاءة العدوى من هذه الخلايا ، وخاصة في حالة هادئة. لتعديل الجينات في الخلايا المناعية، يتم استخدام اختيار مقاومة الأدوية والنواقل الفيروسية عادة لإثراء الخلايا التي تعبر عن نظام CRIPSR/Cas9، مما يؤدي حتما إلى تدخل غير مرغوب فيه للخلايا. في دراسة سابقة، قمنا بتصميم المراسلين الفلوريين المزدوجين إلى جانب CRISPR/Cas9 التي تم التعبير عنها بشكل عابر بعد الصعق الكهربائي. هذا الحل التقني يؤدي إلى حذف الجينات بسرعة في الخلايا المناعية; ومع ذلك ، فإن طرق الجينات في الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية والكوافير دون استخدام اختيار مقاومة الأدوية أو ناقلات الفيروسات هو أكثر تحديا. في هذه المقالة، نظهر أنه باستخدام فرز الخلايا للمساعدة في اختيار الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن بنيات CRISPR/Cas9 التي تستهدف مكان Rosa26 بالاشتراك مع بلازميد المانح، يمكن تحقيق طرق الجينات في كل من الخلايا التائية وال الضامة دون إثراء مقاومة للأدوية. وكمثال على ذلك، نعرض كيفية التعبير عن ACE2 البشري، وهو مستقبل للسارس-كوف-2، المسؤول عن وباء كوفيد-19 الحالي، في الضامة RAW264.7 من خلال إجراء تجارب طرق. يمكن استخدام هذه الخلايا الجينية على نطاق واسع للدراسات الميكانيكية.

Introduction

الخلايا المناعية حاسمة للدفاع ضد مسببات الأمراض. مطلوبة على حد سواء المناعة الفطرية والتكيفية لإزالة المصابات والحفاظ على التوازن النسيج1،2. نماذج خط الخلية هي أدوات أساسية لفهم الأسس الجزيئية للجهاز المناعي الثدييات. يتم استخدامها في المقايسات الوظيفية في المختبر ، مثل تلك التي تصمم تنشيط الخلايا التائية البشرية ، وفي تحديد وظيفة العوامل الوراثية في تنشيط أو تخفيف الاستجابات المناعية3،4. من المهم ملاحظة أن جهاز المناعة الثديي غير متجانس بشكل كبير ، وبنفس القدر من الأهمية ، يتحكم عدد كبير من الجزيئات في التمايز والهجرة ووظيفة نوع الخلية المحدد5،6.

تتجمع بانتظام قصيرة باليندروميك يكرر (CRISPR) / Cas9 أدوات تحرير الجينوم تسمح للتلاعب الجيني لأنواع الخلايا المحددة، مما يسهل التعليق الوظيفي للجينات بطريقة دقيقة7،8. وقد وصفت العديد من البروتوكولات المنشورة تسليم CRISPR / Cas9 في شكل مجمعات الحمض النووي الريبي Cas9 دليل المعروفة باسم ريبونوكليوبروتس (RNPs) في خلايا HEK293، خطوط الخلايا جوركات، الخلايا التائيةالأولية 9،10،الضامة11،12،13،الخلايا الجذعية14،وغيرها15،16. في هذه البروتوكولات ، يتم عادة وضع علامات الجينات عن طريق دمج علامة الفلورسنت إلى البروتينات الذاتية17،18. ومع ذلك بذلت محاولات قليلة لاستخدام المراسلين الفلورسنت المزدوج، والتي تتوافق مع فرز خلية واحدة، لتسهيل التجارب طرق في19،20،لا سيما في الخلايا المناعية.

تتطلب التحليلات الميكانيكية المتعمقة التي تهدف إلى فهم وظائف عامل وراثي جديد في الخلايا المناعية بشكل عام حذف جين معين من نوع الخلية ، وتجارب الإنقاذ الجيني ، وتحديد تفاعله بشكل مثالي. على الرغم من أن أساليب التحسين من الحذف الجيني للجينات في الخلايا المناعية قد نشرت9،15،21، تم الإبلاغ عن طرق أقل بكثير لإدخال أليليس طرق في وظائف متعددة لفهم الاستجابة المناعية. لذلك، نهدف في هذا البروتوكول إلى وصف بروتوكول فعال وقابل للاستنساخ بشكل كبير للتعبير عن بروتين مهم (POI) في مكان الميناء الآمن Rosa26 في كل من خطوط الخلايا المناعية البشرية والمرينية. صممنا نظام مراسلة من لونين لإثراء الخلايا المصابة بلازميدات تعبر عن CRISPR/Cas9 (DsRed2) وقالب الحمض النووي المؤتلف (EBFP2) ، والذي يمكن عزله عن طريق فرز الخلايا. بعد هذا البروتوكول، حصلنا على عدة خطوط طرق في خط الخلية التائية البشرية جوركات ومورين macrophage RAW264.7 للتحليلات الوظيفية للبروتينات درس بشكل سيئ.

كمثال على ذلك، نعرض في هذا البروتوكول كيفية الحصول على الضامة RAW264.7 التي تعبر بشكل ثابت عن ACE2 البشري (مستقبلات سارس-كوف-2)22. لأن الخلايا المناعية الفطرية تشارك في الإمراض من Covid-1923،24 ويعتبر ACE2 الإنسان كم مستقبلات رئيسية مطلوبة للدخول الفيروسي إلى الخلايا قبل النسخ المتماثل ، يمكن أن تكون الضامة مع طرق في ACE2 الإنسان بمثابة أداة مفيدة للدراسات الميكانيكية للتكاثر الفيروسي داخل الضامة. بالتوازي، نقدم أيضا مثالا على طرق في جين في مكان ROSA26 الإنسان للتعبير عن البروتين RASGRP1، الذي تم تنصهر في نهاية الأمينية مع تقارب التوأم ستريب العلامة (OST). الخلايا التائية هي الخلايا المستهدفة الرئيسية في العلاجات المناعية، وقد ركز عدد متزايد من الدراسات على التلاعب في استجابتها للسرطان25،26. كما Rasgrp1 ومن المعروف أن جزيء الإشارات الرئيسية المصب لمستقبلات الخلايا التائية والتفاعل لها ليست واضحة جيدا27، وOSST -RASGRP1 ضرب في نموذج يوفر الأساس لتحديد interactors تنظيم استجابة الخلايا التائية للأورام والعدوى. ويمكن استخدام هذه الأدوات معا لدراسات كوفيد-19 واكتشاف جزيئات جديدة تتفاعل مع Rasgrp1.

Protocol

1. تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 لوكو

  1. دليل التصميم RNAs حول موقع الإدراج المطلوب
    1. تأكد من أن موقع الإدراج ل Rosa26 الماوس (فيما يلي يسمى mRosa26) تجارب knock-in يقع في intron الأول من mRosa26; وقد استخدم هذا الموقع في الدراسات السابقة28،29. للتجارب طرق في الخلايا البشرية، وضمان أن موقع الإدراج يقيم في مكان ROSA26 الإنسان (يشار إليها فيما بعد باسم hROSA26)،والتي تم تحديدها على أنها المثلية البشرية من mRosa2630.
    2. استخدم التسلسلات الجينومية للفأرة والأنواع البشرية التي تم الحصول عليها من معلوماتية الجينوم الماوس (http://www.informatics.jax.org/) ومتصفح الجينوم Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) ، على التوالي. نسخ 50 زوجا أساسيا (bp) من التسلسل الجينومي لموقع mRosa26 أو hROSA26 على كل جانب يحيط بموقع الإدراج المطلوب.
    3. تصميم دليل RNAs باستخدام أداة الويب على الانترنت CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. لصق 100 نقطة أساس من تسلسل الإدخال من 1.1.2. حدد اثنين من RNAs دليل مع درجة عالية التحديد، ودرجة كفاءة عالية، وانخفاض النشاط خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، اختر أدلة الجيش الملكي النيبالي مع أعلى Doench عشرات وتجنب تلك التي وصفت بأنها "غير فعالة"32.
      ملاحظة: أدوات تصميم CRISPR البديلة هي أيضا قيمة ومتاحة للجمهور، على سبيل المثال أداة تصميم Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). لزيادة وتيرة CRISPR/Cas9 بوساطة ضرب في الخلايا المتحولة، حدد اثنين من RNAs دليل قريب من موقع الإدراج المطلوب عندما يكون ذلك ممكنا33.
    4. بالنسبة إلى موقع mRosa26، استخدم اثنين من الرناسات الإرشادية المجاورة المعينة على أنها mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTCTAGAAGAT -3') و mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3')(الشكل 1A). بالنسبة إلى الموضع hROSA26، استخدم اثنين من الرناسات الإرشادية المجاورة، وهما hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGACACGCG -3') وhR26-sg2 (5'- AATCGAGAGGACTCGACA -3')(الشكل 1B).
      ملاحظة: تم تقييم أنشطة تحرير الجينوم من mR26-sg1 و mR26-sg2 وتلك hR26-sg1 و hR26-sg2 في خلايا RAW264.7 وخلايا جوركات، على التوالي (انظر الملف التكميلي، الشكل S1).
  2. استنساخ ناقلات التعبير CRISPR التي تحتوي على SgRNA استهداف مكان Rosa26
    1. توليف إلى الأمام وعكس oligos لدليل واحد الجيش الملكي النيبالي (انظر ملف تكميلي).
      ملاحظة: من الأفضل إضافة نويدات "G" إلى بداية تسلسل الدليل، مما يساعد على التعبير الذي يحركه مروج U6. على سبيل المثال، لاستنساخ mR26-sg1 المذكورة أعلاه، وإلى الأمام القلة هو CACCGCTCCAGTCTCTAGAAGAT والقلة العكسي هو AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. ويشار إلى G إضافية في أوليغو إلى الأمام ومكملها في أوليغو العكسي في جريئة.
    2. استنساخ oligos الاصطناعية المقابلة لدليل RNAs في الكل في واحد CRISPR التعبير المتجه pX458-DsRed2 ولدت في عملنا السابق21 (الشكل 1C)باستخدام البروتوكول العام لاستنساخ الحمض النووي الريبي التي وضعتها مختبر تشانغ (https://www.addgene.org/crispr/zhang/)؛ ومع ذلك، تخطي خطوة تنقية هلام وتنقية ناقلات هضم باستخدام عدة تنقية PCR (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: في البروتوكولات السابقة، تم تنفيذ تنقية هلام المتجه المهضوم BbsI؛ ومع ذلك، تستغرق هذه الخطوة وقتا طويلا. في هذا البروتوكول، يتم تنقية المنتج المهضوم باستخدام عدة تنقية PCR ويستخدم مباشرة لرد فعل الربط المصب، والتي تنتج عموما مستعمرات إيجابية مع كفاءة مماثلة.
    3. تحويل 10 ميكرولتر من المنتج ربط (الخطوة 1.2.2) إلى 50 ميكرولتر من الخلاياالمختصة إشريكيا القولونية DH5α وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اختيار عشوائيا ثلاث مستعمرات من لوحة أجار LB مع أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) وتطعيم كل إلى 3 مل من المتوسط LB مع أمبيسلين لغرس بين عشية وضحاها.
    4. استخدام 1 مل من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها لتسلسل سانجر والحفاظ على بقية في 4 درجة مئوية حتى يتم تأكيد بناء ليكون صحيحا: pDsR-mR26-sg1 وpDSR-mR26-sg2 ل mRosa26 مكان طرق في، وpDSR-hR26-sg1 وpDSR-hR26-sg2 لجراد hROSA26.
    5. إعداد تركيز عال من الحمض النووي البلازميد (حوالي 2 ميكروغرام / ميكرولتر) مع مجموعة ماكسيبريب لتنقية البلازميد من الدرجة transfection (انظر جدول المواد).

2. تصميم وبناء استهداف ناقلات قوالب إعادة التركيب متجانسة

  1. تصميم قالب إصلاح موجهة homology
    1. تصميم متجه استهداف للتعبير بشكل أساسي عن POI باستخدام كاسيت تعبير محسن من دراسة سابقة29، والتي تشمل مروج هجين CAG ، وموقع تقييد AscI يسمح باستنساخ cDNA من POI ، ومراسل IRES-EBFP2 ، وإشارة هرمون النمو البقري polyadenylation (bGH-polyA) (الشكل 1B والملف التكميلي).
    2. تصميم أسلحة التماثل (HAs) التي تشترك في علم الأوهام مع التسلسلات الجينومية للجراد mRosa26 أو hROSA26. تضمين ~ 1 كيلوبايت من 5 'HA المقابلة لتسلسل الجينوم المنبع من موقع الإدراج المطلوب إلى يسار كاسيت التعبير. وبالمثل، قم بتضمين ~ 1 كيلوبايت من 3 'HA المقابلة لتسلسل الجينوم المصب من موقع الإدراج إلى يمين كاسيت التعبير.
      ملاحظة: يتم إدراج كاسيت التعبير أقرب ما يمكن إلى مواقع الانقسام CRISPR/Cas934. لتجنب إعادة قطع الأليل المستهدف بواسطة CRISPR/Cas9 ، قم بدمج تغييرات النيوكليوتيدات في تسلسل الزخارف المجاورة ل protospacer (PAM) (5'NGG-3') في متجه الاستهداف34،35.
    3. للسماح الخطية من المتجه استهداف، إدراج موقع EcoRI فريدة من نوعها فقط المنبع من 5 'HA وموقع BamHI فريدة من نوعها فقط المصب من 3 'HA.
    4. يكون بائع تجاري توليف المتجهات استهداف وتعيينها pKR26-iBFP وpKhR26-iBFP ل mRosa26 و hROSA26 طرق في، على التوالي.
  2. إنشاء متجه استهداف كقالب إصلاح موجه بالهومولوجيا
    1. للتعبير عن POI، احصل على تسلسل cDNA (تسلسل الترميز) من متصفح الجينوم Ensembl واختر النص الذي يمتلك أطول تسلسل بروتين. على سبيل المثال، cDNA من الجين ACE2 الإنسان هو ACE2-202 ENST00000427411.2 وcDNA من الجين RASGRP1 الإنسان هو RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. توليف cDNA من POI بمساعدة بائع تجاري. ومن الممكن أيضا استنساخ cDNA عن طريق تضخيم PCR (غير موضح هنا). ضع تسلسل GGCGCGCCACC (5' - 3') ، والذي يتضمن موقع تقييد AscI (مائل وجريء) وموقع بدء الترجمة التوافقية Kozak (مسطر) ، مباشرة قبل بدء ATG codon من cDNA وموقع تقييد AscI آخر (5'- GGCGCGCC -3') بعد وقف codon من cDNA.
    3. هضم تسلسل توليفها مع ASCI وتنقية باستخدام مجموعة تنقية PCR مصممة لتنقية شظايا الحمض النووي بعد تقييد الهضم، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة (انظر جدول المواد).
    4. Ligate إدراج cDNA المنقى في ناقلات العمود الفقري الخطية AscI pKR26-iBFP أو pKhR26-iBFP باستخدام T4 الحمض النووي ليغانيس اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    5. تحقق من موجه الاستهداف النهائي pKR26-POI-iBFP أو pKhR26-POI-iBFP، عن طريق التسلسل. استخدام maxprep لتنقية البنى التحقق وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    6. هضم المتجه المستهدف باستخدام EcoRI أو BamHI وتنقية منتج الهضم باستخدام عدة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخزين متجه الاستهداف الخطي (~ 0.8 ميكروغرام/ميكرولتر) عند -20 درجة مئوية حتى الكهرومporation.

3. الكهرومربوجين من الماكروفاج وخطوط الخلية تي

  1. إعداد ثقافات الخلايا للكهرومporation
    1. إعداد معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) كوسيلة نمو كاملة لخلايا جوركات T. إعداد دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) مع 10 ٪ FBS لزراعة الضامة RAW264.7. تكملة جميع وسائل الإعلام نمو كامل مع 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل streptomycin (القلم / ستريب) باستثناء وسائل الإعلام المستخدمة لاحتضان ما بعد العدوى قبل فرز الخلية.
    2. إجراء زراعة فرعية لخلايا RAW264.7 وJukat T وفقا لتعليمات المورد (انظر جدول المواد). عند إجراء زراعة فرعية لخلايا RAW264.7، استخدم محلول التريبسين-EDTA (0.25٪) استخدام FBS تكملها مع 10٪ (v/v) DMSO كوسيلة لالتبريد لRAW264.7 وخلايا جوركات.
    3. جمع الخلايا في 250 × غرام لمدة 5 دقائق لRAW264.7 الضامة و 90 × غرام لمدة 8 دقائق لخلايا T جوركات. ثم يغسل مع 5-10 مل من 1× DPBS (دون Ca2 + أو ملغ2 + الأيونات). إزالة DPBS.
    4. إعادة إنفاق بيليه الخلية باستخدام 2 مل من 1× DPBS. استخدام 10 ميكرولتر من الخلايا وتخلط مع حجم متساو من 0.2٪ تريبان الأزرق لتقدير عدد الخلايا وقابلية البقاء.
      ملاحظة: تأكد من أن ثقافة الخلية قد >90٪ صلاحية في يوم من transfection.
    5. لإجراء تجربة واحدة، قم بإجراء الكهربوسيفيشن مع 10 نصائح للنيوكليوفكشن 10 ميكرولتر مع خمسة تكرارات. حساب حجم اللازمة ل2.0 × 106 خلايا والكريه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه الخلية مرة أخرى مع 1× DPBS كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.
      ملاحظة: عند استخدام 10 ميكرولتر نصائح النيوكليوفكشن، هناك حاجة إلى 4.0 × 105 خلايا لكل كهربائي. وبناء على ذلك، إعداد ما لا يقل عن 2.0 × 106 خلايا لتجربة واحدة طرق في.
    6. إعداد لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل من متوسط النمو الكامل (أعدت في الخطوة 3.1.1) لكل بئر دون القلم / ستريب وprewarm في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. الكهرومربوكهربائية لمكونات CRISPR/Cas9 وناقل الاستهداف
    1. قم بتشغيل نظام الكهرومporation. استخدام معلمات الكهربوكتروبوين الأمثل في دراسة سابقة21: 1400 V/20 ms/2 البقول لRAW264.7 الضامة و 1350 V/20 مللي ثانية / 2 نبض لخلايا جوركات T.
    2. مع مراعاة فقدان العينة بسبب الأنابيب، قم بإعداد خليط كهربية 55 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل يحتوي على 2.5 ميكروغرام من كل ناقل CRISPR/Cas9، و2.4 ميكروغرام من متجه الاستهداف الخطي، وحاجز Resuspension Buffer R.
      ملاحظة: لتوفير الوقت، يمكن تحضير خليط الكهربوجين أثناء الطرد المركزي (الخطوة 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 خلايا (أعدت في الخطوة 3.1.5) في خليط 55 ميكرولتر الكهربائي من الخطوة 3.2.2.
    4. يستنشق خليط الخلية/الكهربورات من الخطوة 3.2.3 باستخدام طرف النيوكليوفكشن 10 ميكرولتر مع ماصة.
      ملاحظة: أثناء الأنابيب، تجنب إدخال فقاعات الهواء، والتي قد تسبب فشل الكهرومporation.
    5. أضف العينة إلى أنبوب مملوء ب 3 مل من المخزن المؤقت E من مجموعة الكهرومporation.
    6. تطبيق معلمات الكهربومايشن نوعي الخلية كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.
    7. نقل العينة إلى بئر واحد من لوحة 24 جيدا مع المتوسطة prewarmed من الخطوة 3.1.6.
    8. كرر الخطوات 3.2.4-3.2.7 للتكرار الأربعة الأخرى وكذلك موجه الاستهداف فقط وناقل التعبير CRISPR يتحكم فقط.
      ملاحظة: تغيير طرف النوى وأنبوب عند التبديل إلى نوع خلية مختلفة / الحمض النووي البلازميد.
    9. زراعة الخلايا المصابة لمدة 48-72 ساعة للسماح بالاسترداد بعد الكهرومربوز والتعبير عن مكونات CRISPR/Cas9 قبل تحليل قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). فحص التعبير عن DsRed2 باستخدام المجهر الفلوري مجهزة قناة حمراء في 24 ساعة بعد العدوى.
      ملاحظة: من فوائد مراقبة خلايا الفلورسنت DsRed2 أنه يمكن تقدير كفاءة الكهرومporation ويمكن التنبؤ بمدى ملاءمة المزيد من فرز الخلايا.

4. فرز الخلية لعزل المفترضة ضرب في الخلايا

  1. قبل فرز FACS، اغسل الخلايا المصابة مرة واحدة مع متوسط النمو الكامل. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 3.1.3 وإعادة إنفاق بيليه في 500 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
  2. تعيين فرز الخلية (الموجود في خزانة السلامة الحيوية) مع فوهة 85 ميكرومتر ومعدل تدفق منخفض. حدد وضع "الخلية المفردة" لفرز واختبار كفاءة ودقة فرز الخلية الواحدة عن طريق فرز 20-30 خلية على غلاف لوحة صغيرة 96 جيدا. قطرة واحدة مترجمة في وسط كل بئر يشير إلى الإعداد السليم للأداة.
  3. نقل تعليق الخلية من الخطوة 4.1 إلى أنابيب FACS العقيمة وإضافة SYTOX الأحمر بقعة الخلية الميتة إلى تركيز نهائي من 1 nM.
  4. تحليل عينات على sorter الخلية. SYTOX الأحمر وEBFP2 متحمسون من قبل ليزر 405 نانومتر والكشف عنها من قبل V450/BV421 وقنوات APC، على التوالي. DsRed2 متحمس من قبل ليزر 488 نانومتر والكشف عنها من قبل قناة PE. استخدام الخلايا غير المصابة وEBFP2- و DsRed2-واحد الخلايا الإيجابية كعناصر تحكم للتعويض الطيفي.
  5. فرز 10 خلايا واحدة في كل بئر من لوحة صغيرة 96 جيدا تحتوي على 150 ميكروغرام لكل بئر من المتوسط النمو الكامل قبل الحارة. استخدم لوحات صغيرة مستديرة أسفل لزراعة خطوط الخلايا المعلقة مثل خلايا Jurkat T واللوحات الدقيقة السفلية المسطحة لل الضامة RAW264.7 الملتصقة.
    ملاحظة: فرز 10 خلايا لكل بئر هو استراتيجية محسنة لتحسين بقاء الخلية وتقليل عدد اللوحات الدقيقة التي تحتاج إلى بذر وعدد العينات التي تحتاج إلى فحص عن طريق قياس التدفق الخلوي وال جينوتيبينج؛ إذا كان فرز خلية واحدة فقط لكل بئر، بذر أكثر microplates مطلوب لزيادة فرصة الحصول على خلايا تحريرها بشكل صحيح.

5. فحص والتحقق من صحة إيجابية ضرب في الخلايا

  1. فحص الخلايا المرشحة عن طريق قياس التدفق الخلوي
    1. احتضان الخلايا من الخطوة 4.5 لمدة 10-15 يوما وإضافة متوسط النمو الكامل كل 3 أيام ليحل محل السائل المفقود من خلال التبخر. بالنسبة لخلايا Jurkat T ، نقل الخلايا المزروعة في الجزء السفلي المستدير من لوحة 96 جيدا إلى لوحة سفلي مسطحة لتحسين انتشار الخلايا.
    2. نقل الخلايا المفرزة الموسعة إلى لوحات 48 بئرا لمزيد من التوسع.
    3. عندما تكون الخلايا قريبة من الالتقاء، استخدم نصف الثقافة لفحص تعبير EBFP2 عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3). عادة، نصف الثقافة في لوحة 48 جيدا بعد نمو التقاء يعادل 0.5-1.0 × 105 خلايا، وهو ما يكفي لتحليل عينة واحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    4. نقل الخلايا المتبقية إلى لوحات 24 بئرا لمزيد من الانتشار.
    5. الحفاظ على مجموعات الخلايا المرشحة التي تمتلك نسبة عالية من الخلايا الإيجابية EBFP2 لمزيد من تجارب الإبادة الجماعية.
      ملاحظة: نظرا لفرز 10 خلايا في كل بئر من اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا، فمن الممكن أن تنمو الخلايا المقتحمة مع الخلايا التي لا تعبر عن الجين الضربة القاضية. لذلك، فمن الطبيعي إجراء جولة إضافية من فرز الخلايا لفصل الخلايا الإيجابية EBFP2 من الخلايا السلبية.
  2. فحص المرشح ضرب في الخلايا عن طريق PCR والتسلسل
    1. جمع 2 × 105 خلايا مرشح. استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام مجموعة الإعدادية الحمض النووي (انظر جدول المواد).
    2. للتحقق من أن إصلاح موجهة homology دقيقة (HDR) قد حدث في مكان MRosa26 بدلا من مواقع عشوائية في الجينوم من الخلايا المرشحة ضرب في, أداء PCR مع التمهيديات التي تمتد على كل جانب من HAs (الشكل 4). اختر التمهيدي الموجود في منطقة الجينوم خارج متجه الاستهداف (أوليغو خارجي) والتمهيدي الآخر الموجود داخل متجه الاستهداف (أوليغو داخلي).
      ملاحظة: يتم استخدام تصميم مشابه للتحقق من HDR في الموضع hROSA26. كما يمكن تصميم مبرمجات PCR بسهولة للكشف عن إدراج تسلسل POI. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن الأنماط الجينية الأليلية البرية من النوع والضربات القاضية في وقت واحد باستخدام PCR ثلاثية التمهيدي (انظر الملف التكميلي، الشكل S2).
    3. استنساخ منتجات PCR إيجابية باستخدام مجموعة استنساخ سريع (انظر جدول المواد). تحويل خليط التفاعل إلى خلايا DH5α المختصة.
    4. اختيار عشوائيا 8-10 المستعمرات البكتيرية الفردية لكل تحويل وتسلسل منتجات PCR من الخطوة 5.2.3 بواسطة تسلسل سانجر.
  3. التحقق من صحة الخلايا الإيجابية عن طريق تحليل اللوت المناعي وتنقية التقارب
    ملاحظة: تخضع الخلايا المرشحة لتحليل مناعة للتحقق من إدراج مؤشر البوي، أو تنقية التقارب (AP) لدراسات التفاعل بين البروتين والبروتين.
    1. إجراء تحليل مناعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للأجسام المضادة. انظر جدول المواد للحصول على معلومات بشأن استخدام الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية.
    2. موضوع lysates من الخلايا طرق في التعبير عن POI OST الموسومة إلى AP باستخدام حبات سيبهاروز ستريب-تاكتين اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. الكشف عن chemiluminescence باستخدام الصور.

النتائج

بعد البروتوكول المذكور أعلاه لإجراء تجارب طرق في موقع mRosa26 باستخدام الضامة RAW264.7 مورين، صممنا متجه استهداف للتعبير عن ACE2 الإنسان، وهو مستقبل لفيروس سارس-كوف-2(الشكل 2A). باستخدام تصميم مماثل، ونحن ولدت الإنسان الخلايا T Jurkat مع طرق في من البروتين الانصهار RASGRP1 الموسومة OST

Discussion

في تجاربنا، أظهرنا كيفية إجراء التحرير طرق في الخلايا المناعية من تصميم بناء لفحص الخلايا طرق في والتحقق من صحة باستخدام خلايا T جوركات الإنسان وال الضامة RAW264.7 مورين كأمثلة. كل من الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة مقاومة لالعابر36،37؛ ومع ذلك ، يمكن التغلب ?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر مرفق التدفق الخلوي الأساسي لجامعة شينشيانغ الطبية. وقد تم دعم تطوير هذه التكنولوجيا من خلال منح NSFC 81601360 إلى LZ 81471595 32070898 إلى YL. ويدعم هذا العمل أيضا مؤسسة هينان لجنة التعليم رقم 21IRTSTHN030.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Imager 600Ge Healthcareimaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium saltMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent CellsTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tubeBD Biosciences352003
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology5174at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermoFisher Scientific31430at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfateMP Biomedicals194531
LB agar powderThermoFisher Scientific22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)Eppendorf, or similar
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge TubesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipette tip 0.1-20µlEppendorf, or similar0030 075.005
Pipette tip 2-200µlEppendorf, or similar0030 075.021
Pipette tip 50-1000µlEppendorf, or similar0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitationThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol redThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf, or similar0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177 CRISPR Cas9 Rosa26 hACE2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved