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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Abstract

Gli studi di genomica funzionale del sistema immunitario richiedono manipolazioni genetiche che comportano sia la delezione di geni bersaglio che l'aggiunta di elementi alle proteine di interesse. L'identificazione delle funzioni geniche in modelli di linee cellulari è importante per la scoperta e l'esplorazione dei meccanismi intrinseci delle cellule. Tuttavia, le manipolazioni genetiche delle cellule immunitarie come le cellule T e le linee cellulari dei macrofagi utilizzando il knock-in mediato da CRISPR / Cas9 sono difficili a causa della bassa efficienza di trasfezione di queste cellule, specialmente in uno stato quiescente. Per modificare i geni nelle cellule immunitarie, la selezione della resistenza ai farmaci e i vettori virali sono tipicamente utilizzati per arricchire le cellule che esprimono il sistema CRIPSR / Cas9, il che si traduce inevitabilmente in un intervento indesiderato delle cellule. In uno studio precedente, abbiamo progettato due reporter fluorescenti accoppiati a CRISPR / Cas9 che sono stati espressi transitoriamente dopo l'elettroporazione. Questa soluzione tecnica porta a una rapida delezione genica nelle cellule immunitarie; tuttavia, il knock-in genico nelle cellule immunitarie come le cellule T e i macrofagi senza l'uso della selezione della resistenza ai farmaci o dei vettori virali è ancora più impegnativo. In questo articolo, mostriamo che utilizzando lo smistamento cellulare per aiutare la selezione di cellule che esprimono transitoriamente costrutti CRISPR / Cas9 che prendono di mira il locus Rosa26 in combinazione con un plasmide donatore, il knock-in genico può essere ottenuto sia nelle cellule T che nei macrofagi senza arricchimento della resistenza ai farmaci. Ad esempio, mostriamo come esprimere ACE2 umano, un recettore di SARS-Cov-2, responsabile dell'attuale pandemia di Covid-19, nei macrofagi RAW264.7 eseguendo esperimenti knock-in. Tali cellule knock-in geni possono essere ampiamente utilizzate per studi meccanicistici.

Introduzione

Le cellule immunitarie sono fondamentali per la difesa contro gli agenti patogeni. Sia l'immunità innata che quella adattativa sono necessarie per la clearance degli infettanti e il mantenimento dell'omeostasi tissutale1,2. I modelli di linee cellulari sono strumenti essenziali per comprendere i fondamenti molecolari del sistema immunitario dei mammiferi; sono utilizzati in saggi funzionali in vitro, come quelli che modellano l'attivazione delle cellule T umane, e nel determinare la funzione dei fattori genetici nell'attivare o smorzare le risposte immunitarie3,4. È importante notare che il sistema immunitario dei mammiferi è enormemente eterogeneo e, altrettanto importante, un numero enorme di molecole controlla la differenziazione, la migrazione e la funzione di un dato tipo di cellula5,6.

Gli strumenti di editing del genoma CRISPR /Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) consentono la manipolazione genetica di specifici tipi di cellule, che facilita l'annotazione funzionale dei geni in modo preciso7,8. Diversi protocolli pubblicati hanno descritto la somministrazione di CRISPR / Cas9 sotto forma di complessi di RNA Guida Cas9 noti come ribonucleoproteine (RNP) in cellule HEK293, linee cellulari Jurkat, cellule T primarie9,10, macrofagi11,12,13, cellule staminali14e altri15,16. In questi protocolli, il gene tagging è solitamente ottenuto fondendo un tag fluorescente alle proteine endogene17,18. Tuttavia sono stati fatti pochi tentativi di utilizzare due reporter fluorescenti, che sono compatibili con lo smistamento a singola cellula, per facilitare gli esperimenti knock-in19,20, in particolare nelle cellule immunitarie.

Analisi meccanicistiche approfondite volte a comprendere le funzioni di un nuovo fattore genetico nelle cellule immunitarie richiedono generalmente la delezione specifica del tipo cellulare di un gene, esperimenti di salvataggio genetico e idealmente l'identificazione dei suoi interattori. Anche se i metodi per l'ottimizzazione della delezione genetica dei geni nelle cellule immunitarie sono stati pubblicati9,15,21,sono stati segnalati molti meno metodi per introdurre alleli knock-in con funzioni versatili per comprendere la risposta immunitaria. Pertanto, in questo protocollo ci proponiamo di descrivere in dettaglio un protocollo efficiente e altamente riproducibile per esprimere una proteina di interesse (POI) al locus Safe Harbor Rosa26 in linee cellulari immunitarie sia umane che murine. Abbiamo progettato un sistema reporter a due colori per arricchire le cellule trasfettate con plasmidi che esprimono CRISPR/Cas9 (DsRed2) e un modello di DNA ricombinante (EBFP2), che può essere isolato mediante selezione cellulare. Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto più linee knock-in della linea di cellule T umane Jurkat e del macrofago murino RAW264.7 per analisi funzionali di proteine scarsamente studiate.

Ad esempio, mostriamo in questo protocollo come ottenere macrofagi RAW264.7 knock-in che esprimono stabilmente ACE2 umano (un recettore di SARS-Cov-2)22. Poiché le cellule immunitarie innate sono coinvolte nella patogenesi di Covid-1923,24 e l'ACE2 umano è considerato un recettore principale richiesto per l'ingresso virale nelle cellule prima della replicazione, i macrofagi con knock-in di ACE2 umano possono servire come strumento utile per studi meccanicistici di moltiplicazione virale all'interno dei macrofagi. Parallelamente, presentiamo anche un esempio di knock-in di un gene nel locus umano ROSA26 per esprimere la proteina RASGRP1, che è stata fusa al suo terminale amminico con un'affinità Twin-Strep-tag (OST). Le cellule T sono cellule bersaglio chiave nelle terapie immunitarie e un numero crescente di studi si è concentrato sulla manipolazione della loro reattività al cancro25,26. Poiché Rasgrp1 è noto per essere una molecola di segnalazione chiave a valle del recettore delle cellule T e i suoi interattori non sono ben chiariti27, il modello knock-in OST-RASGRP1 fornisce le basi per identificare gli interattori che regolano la risposta delle cellule T ai tumori e alle infezioni. Presi insieme, questi strumenti possono essere utilizzati per gli studi Covid-19 e la scoperta di nuove molecole che interagiscono con Rasgrp1.

Protocollo

1. Progettazione e costruzione di plasmidi di sgRNA destinati al locus Rosa26

  1. Guida alla progettazione RNA intorno al sito di inserimento desiderato
    1. Assicurarsi che il sito di inserimento per gli esperimenti knock-in del topo Rosa26 (di seguito designato come mRosa26) si trovi nel primo introne di mRosa26; questo sito è stato utilizzato in studi precedenti28,29. Per gli esperimenti knock-in in cellule umane, assicurarsi che il sito di inserimento risieda nel locus rosa26 umano (di seguito denominato hROSA26), che è stato identificato come l'omologo umano di mRosa2630.
    2. Utilizzare le sequenze genomiche di topi e specie umane ottenute rispettivamente da Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) e Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html). Copiare 50 paia di basi (bp) della sequenza genomica del locus mRosa26 o hROSA26 su ciascun lato che fiancheggia il sito di inserzione desiderato.
    3. Guida alla progettazione di RNA utilizzando lo strumento web online CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Incollare i 100 bp della sequenza di input da 1.1.2. Seleziona due RNA guida con un punteggio di specificità elevato, un punteggio di efficienza elevato e una bassa attività fuori bersaglio. Inoltre, scegli le guide di RNA con punteggi Doench più alti ed evita quelli etichettati come "Inefficienti"32.
      NOTA: anche gli strumenti di progettazione CRISPR alternativi sono preziosi e disponibili pubblicamente, ad esempio lo strumento di progettazione Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Per aumentare la frequenza delle cellule mutate knock-in mediate da CRISPR/Cas9, selezionare due RNA guida vicino al sito di inserimento desiderato quando possibile33.
    4. Per il locus mRosa26, utilizzare due RNA guida adiacenti designati come mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') e mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAAAGAC -3') (Figura 1A). Per il locus hROSA26, utilizzare due RNA guida adiacenti, vale a dire hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') e hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figura 1B).
      NOTA: Le attività di modifica del genoma di mR26-sg1 e mR26-sg2 e quelle di hR26-sg1 e hR26-sg2 sono state valutate rispettivamente nelle cellule RAW264.7 e nelle cellule Jurkat (Vedi File Supplementare, Figura S1).
  2. Clonazione di vettori di espressione CRISPR contenenti sgRNA destinati al Locus Rosa26
    1. Sintetizzare oligo in avanti e inversi per un RNA guida (Vedi file supplementare).
      NOTA: è preferibile aggiungere un nucleotide 'G' all'inizio della sequenza guida, che aiuta con l'espressione guidata dal promotore U6. Ad esempio, per clonare il suddetto mR26-sg1, l'oligo forward è CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT e l'oligo inverso è AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. La G aggiuntiva nell'oligo forward e il suo complemento nell'oligo inverso sono indicati in grassetto.
    2. Clonare oligo sintetici corrispondenti agli RNA guida nel vettore di espressione CRISPR all-in-one pX458-DsRed2 generato nel nostro precedente lavoro21 (Figura 1C) utilizzando il protocollo generale per la clonazione di gRNA sviluppato dal Laboratorio di Zhang (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); tuttavia, saltare la fase di purificazione del gel e purificare il vettore digerito utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Nei protocolli precedenti, è stata eseguita la purificazione in gel del vettore digerito da BbsI; tuttavia, questo passaggio richiede molto tempo. Nel presente protocollo, il prodotto digerito viene purificato utilizzando un kit di purificazione PCR e utilizzato direttamente per la reazione di legatura a valle, che generalmente produce colonie positive con efficienza comparabile.
    3. Trasformare 10 μL del prodotto di legatura (fase 1.2.2) in 50 μL di cellule competentiEscherichia coli DH5α secondo le istruzioni del produttore. Scegli casualmente tre colonie da una piastra di agar LB con ampicillina (100 μg / mL) e inocula ciascuna in 3 ml di lb medio con ampicillina per la coltivazione durante la notte.
    4. Utilizzare 1 mL della coltura batterica notturna per il sequenziamento Sanger e mantenere il resto a 4 °C fino a quando il costrutto non è confermato corretto: pDsR-mR26-sg1 e pDsR-mR26-sg2 per mRosa26 locus knock-in, e pDsR-hR26-sg1 e pDsR-hR26-sg2 per il locus hROSA26.
    5. Preparare un'alta concentrazione di DNA plasmidico (circa 2 μg/μL) con un kit maxiprep per la purificazione del plasmide di grado trasfezione (vedi Tabella dei materiali).

2. Progettazione e costruzione di vettori di targeting come modelli di ricombinazione omologa

  1. Progettare un modello di riparazione diretto all'omologia
    1. Progettare un vettore di targeting per esprimere costitutivamente il POI utilizzando una cassetta di espressione ottimizzata da uno studio precedente29, che include un promotore ibrido CAG, un sito di restrizione AscI che consente la clonazione del cDNA del POI, un reporter IRES-EBFP2 e un segnale di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino (bGH-polyA) (Figura 1B e file supplementare).
    2. Progettare bracci di omologia (HA) che condividono l'omologia con le sequenze genomiche del locus mRosa26 o hROSA26. Includere ~1 kb di 5' HA corrispondenti alla sequenza genomica a monte dal sito di inserimento desiderato a sinistra della cassetta di espressione. Allo stesso modo, includere ~1 kb del 3' HA corrispondente alla sequenza genomica a valle dal sito di inserimento a destra della cassetta di espressione.
      NOTA: la cassetta di espressione viene inserita il più vicino possibile ai siti di scissione CRISPR/Cas934. Per evitare il ritaglio dell'allele mirato da parte di CRISPR/Cas9, incorporare i cambiamenti nucleotidici nella sequenza del motivo adiacente al protospacer (PAM) (5'-NGG-3') nel vettore di targeting34,35.
    3. Per consentire la linearizzazione del vettore di targeting, inserire un sito EcoRI unico appena a monte del 5' HA e un unico sito BamHI appena a valle del 3' HA.
    4. Chiedere a un fornitore commerciale di sintetizzare i vettori di targeting e designarli come pKR26-iBFP e pKhR26-iBFP per mRosa26 e hROSA26 knock-in, rispettivamente.
  2. Costruire un vettore di targeting come modello di riparazione diretto all'omologia
    1. Per esprimere il POI, ottenere la sequenza di cDNA (sequenza codificante) dal browser del genoma di Ensembl e scegliere la trascrizione che possiede la sequenza proteica più lunga. Ad esempio, il cDNA del gene ACE2 umano è ACE2-202 ENST00000427411.2 e il cDNA del gene RASGRP1 umano è RASGRP1 ENSGG00000172575.
    2. Sintetizzare il cDNA del POI con l'aiuto di un fornitore commerciale. È anche possibile clonare il cDNA tramite amplificazione PCR (non descritta qui). Posizionare la sequenza GGCGCGCCACC (5' - 3'), che include un sito di restrizione AscI (corsivo e grassetto) e un sito di iniziazione della traduzione del consenso Kozak (sottolineato), immediatamente prima del codone di avvio ATG del cDNA e un altro sito di restrizione AscI (5'- GGCGCGCC -3') dopo il codone di arresto del cDNA.
    3. Digerire la sequenza sintetizzata con AscI e purificare utilizzando un kit di purificazione PCR progettato per purificare i frammenti di DNA dopo la digestione di restrizione, seguendo le istruzioni dei produttori (vedi Tabella dei materiali).
    4. Ligare il cDNA purificato inserire nel vettore backbone linearizzato AscI pKR26-iBFP o pKhR26-iBFP utilizzando T4 DNA ligasi seguendo le istruzioni del produttore.
    5. Verificare il vettore di targeting finale, pKR26-POI-iBFP o pKhR26-POI-iBFP, mediante sequenziamento. Utilizzare maxiprep per purificare i costrutti verificati secondo il protocollo del produttore.
    6. Digerire il vettore di targeting utilizzando EcoRI o BamHI e purificare il prodotto di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Conservare il vettore di targeting linearizzato (~0,8 μg/μL) a -20 °C fino all'elettroporazione.

3. Elettroporazione di macrofagi e linee cellulari T

  1. Preparare colture cellulari per l'elettroporazione
    1. Preparare il Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) come mezzo di crescita completo per le cellule T Jurkat. Preparare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di FBS per la coltivazione di macrofagi RAW264.7. Integrare tutti i mezzi di crescita completi con 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep) ad eccezione dei mezzi utilizzati per l'incubazione post-trasfezione prima della selezione cellulare.
    2. Eseguire la sottoculturazione delle celle T RAW264.7 e Jurkat secondo le istruzioni del fornitore (vedere Tabella dei materiali). Quando si subculturano le cellule RAW264.7, utilizzare la soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) per staccare le cellule. Utilizzare FBS integrato con DMSO al 10% (v/v) come mezzo di crioconservazione per le cellule RAW264.7 e Jurkat.
    3. Raccogliere cellule a 250 × g per 5 minuti per i macrofagi RAW264.7 e 90 × g per 8 minuti per le cellule T Jurkat. Quindi lavare con 5-10 ml di 1× DPBS (senza ioni Ca2+ o Mg2+). Rimuovere il DPBS.
    4. Risuspenare il pellet cellulare utilizzando 2 mL di 1× DPBS. Utilizzare 10 μL di cellule e mescolare con un volume uguale di 0,2% di tripano blu per stimare il numero di cellule e la vitalità.
      NOTA: Assicurarsi che la coltura cellulare abbia una vitalità >90% il giorno della trasfezione.
    5. Per un singolo esperimento knock-in, eseguire l'elettroporazione con punte di nucleofezione da 10 μL con cinque ripetizioni. Calcola il volume necessario per 2,0 × 106 celle e pellet le celle per centrifugazione. Lavare nuovamente il pellet cellulare con 1× DPBS come descritto al punto 3.1.3.
      NOTA: quando si utilizzano punte di nucleofezione da 10 μL, sono necessarie 4,0 ×10 5 celle per elettroporazione. Di conseguenza, preparare almeno 2,0 × 106 cellule per un esperimento knock-in.
    6. Preparare una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di terreno di coltura completo (preparato nella fase 3.1.1) per pozzetti senza penna/streptococco e preriscaldare in un incubatore a 37 °C.
  2. Elettroporazione dei componenti CRISPR/Cas9 e del vettore di targeting
    1. Accendere il sistema di elettroporazione. Utilizzare parametri di elettroporazione ottimizzati in uno studio precedente21:impulsi 1.400 V/20 ms/2 per macrofagi RAW264.7 e impulsi 1350 V/20 ms/2 per cellule T Jurkat.
    2. Tenendo conto della perdita di campione dovuta al pipettaggio, preparare una miscela di elettroporazione da 55 μL in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL contenente 2,5 μg di ciascun vettore CRISPR/Cas9, 2,4 μg del vettore di targeting linearizzato e il resuspension Buffer R.
      NOTA: Per risparmiare tempo, la miscela di elettroporazione può essere preparata durante la centrifugazione (fase 3.1.5).
    3. Spese 2.0 × 106 celle (preparate nella fase 3.1.5) nella miscela di elettroporazione da 55 μL dalla fase 3.2.2.
    4. Aspirare la miscela cella/elettroporazione dal punto 3.2.3 utilizzando una punta nucleofettiva da 10 μL con una pipetta.
      NOTA: durante il pipettaggio, evitare di introdurre bolle d'aria, che potrebbero causare guasti di elettroporazione.
    5. Aggiungere il campione a un tubo riempito con 3 ml di Buffer E dal kit di elettroporazione.
    6. Applicare i parametri di elettroporazione per i due tipi di celle come descritto al punto 3.2.1.
    7. Trasferire il campione in un pozzo della piastra a 24 pozzi con mezzo preriscaldato dal punto 3.1.6.
    8. Ripetere i passaggi 3.2.4-3.2.7 per le altre quattro ripetizioni, nonché per i soli controlli del vettore di destinazione e solo del vettore di espressione CRISPR.
      NOTA: Modificare la punta e il tubo di nucleofezione quando si passa a un diverso tipo di cellula/DNA plasmidico.
    9. Coltura delle cellule trasfettate per 48-72 ore per consentire il recupero dopo elettroporazione ed espressione dei componenti CRISPR / Cas9 prima dell'analisi della citometria a flusso o della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Esaminare l'espressione di DsRed2 utilizzando un microscopio fluorescente dotato di un canale rosso a 24 ore dopo la trasfezione.
      NOTA: Un vantaggio del monitoraggio delle celle fluorescenti DsRed2 è che l'efficienza dell'elettroporazione può essere stimata e l'idoneità per un ulteriore smistamento delle celle può essere prevista.

4. Ordinamento delle cellule per isolare le cellule putative Knock-in

  1. Prima della cernita FACS, lavare le cellule trasfettate una volta con un mezzo di crescita completo. Celle a pellet mediante centrifugazione come descritto al punto 3.1.3 e ripresa del pellet in 500 μL di mezzo fresco.
  2. Impostare la selezionatrice di celle (situata in un armadio di biosicurezza) con un ugello da 85 μm e una bassa portata. Selezionare la modalità "cella singola" per lo smistamento e testare l'efficienza e la precisione dello smistamento a cella singola ordinando 20-30 celle sul coperchio della micropiastra a 96 pozzeli. Una goccia localizzata al centro di ogni pozzo indica la corretta configurazione dello strumento.
  3. Trasferire la sospensione cellulare dalla fase 4.1 in tubi FACS sterili e aggiungere SYTOX Red Dead Cell Stain ad una concentrazione finale di 1 nM.
  4. Analizzare i campioni sul selezionatore di celle. SYTOX Red e EBFP2 sono eccitati da un laser a 405 nm e rilevati rispettivamente dai canali V450/BV421 e APC. DsRed2 è eccitato da un laser a 488 nm e rilevato dal canale PE. Utilizzare cellule non trasfettate e cellule EBFP2 e DsRed2-single positive come controlli per la compensazione spettrale.
  5. Ordinare 10 singole cellule in ciascun pozze pozzo di una micropiastra a 96 pozzette contenente 150 μL per pozzetta di terreno di crescita completo preriscaldato. Utilizzare micropiasche a fondo rotondo per la coltivazione di linee cellulari in sospensione come le cellule T Jurkat e micropiasche a fondo piatto per macrofagi RAW264.7 aderenti.
    NOTA: l'ordinamento di 10 cellule per pozzetti è una strategia ottimizzata per migliorare la sopravvivenza cellulare e ridurre al minimo il numero di micropiasche a 96 pozzetti che devono essere seminate e il numero di campioni che devono essere sottoposti a screening mediante citometria a flusso e genotipizzazione; se si ordina solo una cellula per pozzedo, è necessaria la semina di più micropiasche per aumentare la possibilità di ottenere celle correttamente modificate.

5. Screening e convalida delle cellule knock-in positive

  1. Screening per le cellule knock-in candidate mediante citometria a flusso
    1. Incubare le cellule dal passaggio 4.5 per 10-15 giorni e aggiungere un mezzo di crescita completo ogni 3 giorni per sostituire il liquido perso per evaporazione. Per le cellule T Jurkat, trasferire le cellule cresciute nella piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti in una piastra a fondo piatto per ottimizzare la proliferazione cellulare.
    2. Trasferire le celle ordinate espanse su piastre a 48 pozzetti per un'ulteriore espansione.
    3. Quando le cellule sono vicine alla confluenza, utilizzare metà della coltura per lo screening dell'espressione di EBFP2 mediante citometria a flusso (Figura 3). Normalmente, metà della coltura in una piastra a 48 pozzetti dopo la crescita confluente equivale a 0,5-1,0 × 105 cellule, che è adeguata per l'analisi di un campione mediante citometria a flusso.
    4. Trasferire le cellule rimanenti in piastre a 24 pozzi per un'ulteriore proliferazione.
    5. Mantenere le popolazioni cellulari candidate in possesso di un'alta percentuale di cellule EBFP2-positive per ulteriori esperimenti di genotipizzazione.
      NOTA: Poiché 10 cellule sono ordinate in ciascun pozze pozzo della micropiastra a 96 pozzene, è possibile che le cellule knock-in crescano con cellule che non esprimono il gene knock-in. Pertanto, è normale eseguire un ulteriore ciclo di ordinamento delle cellule per separare le cellule EBFP2-positive dalle celle negative.
  2. Screening per le cellule knock-in candidate mediante PCR e sequenziamento
    1. Raccogliere 2 × 105 cellule candidate. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di preparazione del DNA (vedi Tabella dei materiali).
    2. Per verificare che la riparazione precisa diretta all'omologia (HDR) si sia verificata nel locus mRosa26 piuttosto che in siti casuali nel genoma delle cellule knock-in candidate, eseguire la PCR con primer che coprono ciascun lato degli HA (Figura 4). Scegli un primer situato nella regione genomica al di fuori del vettore di targeting (oligo esterno) e un altro primer situato all'interno del vettore di targeting (oligo interno).
      NOTA: un design simile viene utilizzato per verificare l'HDR nel locus hROSA26. I primer PCR possono anche essere facilmente progettati per rilevare l'inserimento della sequenza POI. Inoltre, i genotipi di alleli wild-type e knock-in possono essere rilevati simultaneamente utilizzando la PCR a tre primer (Vedi file supplementare, Figura S2).
    3. Clonare i prodotti PCR positivi utilizzando un kit di clonazione rapida (vedi Tabella dei materiali). Trasformare la miscela di reazione in cellule competenti DH5α.
    4. Scegli casualmente 8-10 singole colonie batteriche per trasformazione e sequenzia i prodotti PCR dal passaggio 5.2.3 mediante sequenziamento Sanger.
  3. Validazione di cellule knock-in positive mediante analisi immunoblot e purificazione dell'affinità
    NOTA: Le cellule candidate sono sottoposte ad analisi immunoblot per la validazione dell'inserimento del POI, o purificazione dell'affinità (AP) per studi di interazione proteina-proteina.
    1. Eseguire l'analisi immunoblot secondo le istruzioni del produttore di anticorpi. Vedere tabella dei materiali per informazioni sull'uso di anticorpi primari e anticorpi secondari.
    2. Sottoporre i lasati delle celle knock-in che esprimono il POI con tag OST ad AP utilizzando perle di sefarosio Strep-Tactin seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    3. Rileva la chemiluminescenza utilizzando un imager.

Risultati

Seguendo il protocollo sopra descritto per eseguire esperimenti knock-in presso il locus mRosa26 utilizzando macrofagi murini RAW264.7, abbiamo progettato un vettore di targeting per esprimere ACE2 umano, un recettore per il virus SARS-Cov-2 (Figura 2A). Utilizzando un design simile, abbiamo generato cellule T Jurkat umane con knock-in della proteina di fusione RASGRP1 con tag OST (Figura 2C). Dopo la trasfezione di tre plasmidi, due dei quali sono stat...

Discussione

Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato come eseguire l'editing knock-in nelle cellule immunitarie dalla progettazione del costrutto allo screening e alla convalida delle cellule knock-in utilizzando cellule T Jurkat umane e macrofagi RAW264.7 murini come esempi. Sia le linee cellulari delle cellule T che delle macrofaghe sono resistenti alla trasfezione36,37; tuttavia, il problema della bassa efficienza della consegna CRISPR / Cas9 può essere superato con l'...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo la struttura principale della citometria a flusso della Xinxiang Medical University. Lo sviluppo di tale tecnologia è stato sostenuto da sovvenzioni NSFC 81601360 a LZ, 81471595 e 32070898 a YL. Il lavoro è anche sostenuto dalla Fondazione del Comitato Educativo dell'Henan n. 21IRTSTHN030.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Imager 600Ge Healthcareimaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium saltMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent CellsTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tubeBD Biosciences352003
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology5174at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermoFisher Scientific31430at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfateMP Biomedicals194531
LB agar powderThermoFisher Scientific22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)Eppendorf, or similar
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge TubesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipette tip 0.1-20µlEppendorf, or similar0030 075.005
Pipette tip 2-200µlEppendorf, or similar0030 075.021
Pipette tip 50-1000µlEppendorf, or similar0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitationThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol redThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf, or similar0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799

Riferimenti

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

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