Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

Abstract

מחקרים גנומיים פונקציונליים של המערכת החיסונית דורשים מניפולציות גנטיות הכרוכות הן במחיקת גנים ממוקדים והן בתוספת אלמנטים לחלבונים בעלי עניין. זיהוי פונקציות גנים במודלים של קו התא חשוב לגילוי גנים וחקירה של מנגנונים מהותיים של תאים. עם זאת, מניפולציות גנטיות של תאים חיסוניים כגון תאי T וקווי תאי מקרופאגים באמצעות נוק-אין בתיווך CRISPR/Cas9 קשות בגלל יעילות ההדבקה הנמוכה של תאים אלה, במיוחד במצב של ירידה. כדי לשנות גנים בתאי מערכת החיסון, בחירת עמידות לתרופות וקטורים ויראליים משמשים בדרך כלל להעשרה עבור תאים המבטאים את מערכת CRIPSR/Cas9, אשר בהכרח גורמת להתערבות בלתי רצויה של התאים. במחקר קודם, עיצבנו כתבים פלואורסצנטיים כפולים בשילוב CRISPR / Cas9 שבאו לידי ביטוי ארעי לאחר אלקטרופורציה. פתרון טכני זה מוביל למחיקת גנים מהירה בתאי מערכת החיסון; עם זאת, נוק-אין גנים בתאי מערכת החיסון כגון תאי T ו macrophages ללא שימוש בבחירת התנגדות לסמים או וקטורים ויראליים הוא אפילו יותר מאתגר. במאמר זה, אנו מראים כי באמצעות מיון תאים כדי לסייע בבחירת תאים המבטאים באופן ארעי מבנים CRISPR/Cas9 המתמקדים בלוקוס Rosa26 בשילוב עם פלסמיד תורם, ניתן להשיג נוק-אין גנטי הן בתאי T והן במקרופג'ים ללא העשרה עמידות לסמים. כדוגמה, אנו מראים כיצד לבטא ACE2 אנושי, קולטן של SARS-Cov-2, האחראי על מגיפת Covid-19 הנוכחית, במקרופגים RAW264.7 על ידי ביצוע ניסויים נוק-אין. תאים כאלה נוק-אין גנים ניתן להשתמש נרחב עבור מחקרים מכניים.

Introduction

תאי מערכת החיסון הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים. חסינות מולדת ומסתגלת נדרשים לפינוי זיהומים ותחזוקה של הומאוסטזיסרקמות 1,2. מודלים של קו התאים הם כלים חיוניים להבנת היסודות המולקולריים של מערכת החיסון של היונקים; הם משמשים במבחנה תפקודית בדיקות, כגון אלה מודל הפעלת תאי T אנושי, בקביעת הפונקציה של גורמים גנטיים בהפעלת או שיכוך תגובות חיסוניות3,4. חשוב לציין כי מערכת החיסון של היונקים היא הטרוגנית מאוד, ולא פחות חשוב, מספר עצום של מולקולות לשלוט בידול, הגירה, ותפקוד של תא נתון סוג5,6.

מקובצים באופן קבוע בין-מרחבים קצר פלינדרומי חוזרים (CRISPR)/Cas9 כלי עריכת גנום המאפשרים מניפולציה גנטית של סוגי תאים ספציפיים, המאפשר ביאור תפקודי של גנים בצורה מדויקת7,8. מספר פרוטוקולים שפורסמו תיארו את המסירה של CRISPR/Cas9 בצורה של מתחמי RNA של Cas9-guide המכונים ריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) בתאי HEK293, קווי תאים של Jurkat, תאי T ראשיים9,10, מקרופאגים11,12,13, תאי גזע14, ואחרים15,16. בפרוטוקולים אלה, תיוג גנים מושגת בדרך כלל על ידי היתוך תג פלואורסצנטי לחלבונים אנדוגניים17,18. עם זאת, נעשו ניסיונות מעטים להשתמש בכתבים פלואורסצנטיים כפולים, התואמים למיון תאים בודדים, כדי להקל על ניסויי נוק-אין19,20, במיוחד בתאי מערכת החיסון.

ניתוחים מכניסטיים מעמיקים שמטרתם להבין את תפקודו של גורם גנטי חדשני בתאי החיסון דורשים בדרך כלל מחיקה ספציפית מסוג תאים של גן, ניסויי הצלה גנטיים וזיהוי אידיאלי של האינטראקטיבים שלו. למרות שיטות לאופטימיזציה של מחיקה גנטית של גנים בתאי מערכת החיסוןפורסמו 9,15,21, הרבה פחות שיטות דווחו עבור החדרת אללים knock-in עם פונקציות מגוונות כדי להבין את התגובה החיסונית. לכן, בפרוטוקול זה אנו שואפים לתאר בפירוט פרוטוקול יעיל מאוד לשחזור כדי להביע חלבון של עניין (POI) על locus הנמל הבטוח Rosa26 הן בקווי תאי החיסון האנושיים והן מורין. עיצבנו מערכת כתבים בשני צבעים כדי להעשיר עבור תאים שהודבקו בפלסמידים המבטאים CRISPR/Cas9 (DsRed2) ותבנית דנ"א רקומביננטית (EBFP2), שניתן לבודד על ידי מיון תאים. בעקבות פרוטוקול זה, השגנו שורות נוק-אין מרובות של קו תא T האנושי Jurkat ו מקרופאגים מורין RAW264.7 עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים שנחקרו בצורה גרועה.

כדוגמה, אנו מראים בפרוטוקול זה כיצד להשיג נוק-אין RAW264.7 מקרופאגים מבטאים ביציבות ACE2 אנושי (קולטן של SARS-Cov-2)22. מכיוון שתאי חיסון מולדים מעורבים בפתוגנזה של Covid-1923,24 ו- ACE2 האנושי נחשב לקולטן מרכזי הנדרש לכניסה ויראלית לתאים לפני השכפול, מקרופאגים עם נוק-אין של ACE2 האנושי יכולים לשמש ככלי שימושי למחקרים מכניים של כפל ויראלי בתוך מקרופאגים. במקביל, אנו מציגים גם דוגמה של נוק-אין של גן על locus ROSA26 האנושי להביע את חלבון RASGRP1, אשר הותך במינוח האמינו שלה עם זיקה טווין-סטרפטופט -תג (OST). תאי T הם תאי יעד מרכזיים לטיפולים במערכת החיסון, ומספר גדל והולך של מחקרים התמקדו במניפולציה של התגובה שלהם לסרטן25,26. כמו Rasgrp1 ידוע להיות מולקולת איתות מפתח במורד הזרם של קולטן תא T ואת interactors שלה אינם מנוכרים היטב27, מודל OST-RASGRP1 knock-in מספק את הבסיס לזיהוי אינטראקציות המסדיר את התגובה של תאי T לגידולים וזיהום. יחד, כלים אלה יכולים לשמש למחקרי Covid-19 וגילוי של מולקולות חדשניות אינטראקציה עם Rasgrp1.

Protocol

1. עיצוב ופלסטיד בניית sgRNAs מיקוד Rosa26 לוקוס

  1. RNAs של מדריך עיצוב סביב אתר ההוספה הרצוי
    1. ודא כי אתר ההחדרה עבור העכבר Rosa26 (להלן מוגדר mRosa26) ניסויי נוק-אין ממוקם אינטרון הראשון של mRosa26; אתר זה שימש במחקרים קודמים28,29. לניסויים נוק-אין בתאים אנושיים, ודאו כי אתר ההחדרה שוכן בלוקוס ROSA26 האנושי (להלן hROSA26), שזוהה כהומולוג האנושי של mRosa2630.
    2. השתמש ברצפים הגנומיים של עכבר ומינים אנושיים המתקבלים מ- Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) ודפדפן הגנום אנסמבל (http://www.ensembl.org/index.html), בהתאמה. העתק 50 זוגות בסיס (bp) של הרצף הגנומי של הלוקוס mRosa26 או hROSA26 בכל צד המאגף את אתר הכניסה הרצוי.
    3. מדריך העיצוב RNAs באמצעות כלי האינטרנט המקוון CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. הדבק את רצף הקלט של 100 bp מ- 1.1.2. בחר שני RNAs של מדריך עם ציון ייחודיות גבוה, ציון יעילות גבוהה ופעילות נמוכה מחוץ ליעד. בנוסף, בחר מדריכי RNA עם ציונים גבוהים יותר Doench ולהימנע מאלה המסומנים כמו "לא יעיל"32.
      הערה: כלי עיצוב חלופיים CRISPR הם גם בעלי ערך וזמינים לציבור, למשל כלי העיצוב BENCHling CRISPR (https://benchling.com/crispr). כדי להגדיל את התדירות של תאים שעברו מוטציה בתיווך CRISPR/Cas9, בחר שני RNAs של מנחים קרוב לאתר הכניסה הרצוי כאשר הדבר אפשרי33.
    4. עבור לוקוס mRosa26, השתמש בשני מדריך סמוך RNAs המיועדים mR26-sg1 (5 '- CTCCAGTCTCTCTCTAGAAGAT -3') ו- mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTCTCTCTAGAAAGAC -3')(איור 1A). עבור לוקוס hROSA26, השתמש בשני מדריך סמוך RNAs, כלומר hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACG -3') ו hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3')(איור 1B).
      הערה: פעילויות עריכת הגנום של mR26-sg1 ו- mR26-sg2 ואלה של hR26-sg1 ו- hR26-sg2 הוערכו בתאי RAW264.7 ותאי Jurkat, בהתאמה (ראה קובץ משלים, איור S1).
  2. שיבוט של וקטורים של ביטוי CRISPR המכילים sgRNA המתמקדים בלוקוס Rosa26
    1. לסנתז אוליגוס קדימה ואחורה עבור RNA מדריך אחד (ראה קובץ משלים).
      הערה: עדיף להוסיף נוקלאוטיד 'G' לתחילת רצף המדריכים, המסייע בביטוי המונע על ידי מקדם U6. לדוגמה, כדי לשכפל את mR26-sg1 הנ"ל, אוליגו קדימה הוא CACCGCTCCAGTCTCTCTAGAAGAT ואת אוליגו הפוך הוא AAACATCTCTAGAAAGACTGGAGC. G נוסף באוליגו הקדמי והמשלים שלו באוליגו ההפוך מסומנים באומץ.
    2. שכפול אוליגוס סינתטי המתאים למדריך RNAs לווקטור הביטוי CRISPR all-in-One pX458-DsRed2 שנוצר בעבודה הקודמת שלנו21 (איור 1C) באמצעות הפרוטוקול הכללי לשיבוט gRNA שפותח על ידי המעבדה של ג'אנג (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); עם זאת, לדלג על שלב טיהור הג'ל ולטהר את הווקטור המעוכל באמצעות ערכת טיהור PCR (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: בפרוטוקולים קודמים בוצע טיהור ג'ל של הווקטור מתעכל BbsI; עם זאת, שלב זה גוזל זמן רב. בפרוטוקול הנוכחי, המוצר המעוכל מטוהר באמצעות ערכת טיהור PCR ומשמש ישירות לתגובת קשירת במורד הזרם, אשר בדרך כלל מייצר מושבות חיוביות עם יעילות דומה.
    3. להפוך 10 μL של מוצר קשירה (שלב 1.2.2) לתוך 50 μLשל Escherichia coli DH5α תאים מוסמכים על פי הוראות היצרן. בחר באופן אקראי שלוש מושבות מצלחת אגר LB עם אמפצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ולחסן כל אחד לתוך 3 מ"ל של מדיום LB עם אמפצילין עבור culturing בן לילה.
    4. השתמש 1 מ"ל של תרבות חיידקים לילה עבור רצף סנגר ולשמור על השאר ב 4 °C (75 °F) עד המבנה מאושר להיות נכון: pDsR-mR26-sg1 ו pDsR-mR26-sg2 עבור mRosa26 לוקוס לדפוק ב, ו pDsR-hR26-sg1 ו pDsR-hR26-sg2 עבור לוקוס hROSA26.
    5. הכן ריכוז גבוה של DNA plasmid (כ 2 מיקרוגרם / μL) עם ערכת maxiprep לטיהור של plasmid כיתה transfection (ראה טבלה של חומרים).

2. תכנון ובניית וקטורים פילוח כתבניות רקומבינציה הומולוגיות

  1. עיצוב תבנית תיקון מונחית הומולוגיה
    1. עצבו וקטור פילוח שיבטא את ה-POI באמצעות קלטת ביטוי הממוטבת ממחקר קודם29, הכולל מקדם היברידי CAG, אתר הגבלת AscI המאפשר שיבוט של ה- CDNA של POI, כתב IRES-EBFP2, ואות פוליאדנילציה של הורמון גדילה בקר (bGH-polyA) (איור 1B וקובץ משלים).
    2. עיצוב זרועות ההומולוגיה (HAs) החולקות את ההומולוגיה עם הרצפים הגנומיים של הלוקוס mRosa26 או hROSA26. כלול כ- 1 kb של 5' HA המתאים לרצף הגנומי במעלה הזרם מאתר הכניסה הרצוי משמאל לקלטת הביטוי. באופן דומה, כלול כ- 1 kb של 3' HA המתאים לרצף הגנומי במורד הזרם מאתר הכניסה מימין לקלטת הביטוי.
      הערה: קלטת הביטוי נוספת קרוב ככל האפשר לאתרי המחשוף CRISPR/Cas934. כדי להימנע מחיתוך מחדש של אלל ממוקד על ידי CRISPR/Cas9, לשלב שינויים נוקלאוטיד לתוך רצף המוטיב הסמוך protospacer (PAM) (5'-NGG-3') בווקטור פילוח34,35.
    3. כדי לאפשר ליניאריזציה של וקטור הפילוח, הכנס אתר EcoRI ייחודי במעלה הזרם של 5 ' HA ואתר BamHI ייחודי ממש במורד הזרם של 3 'HA.
    4. יש ספק מסחרי לסנתז את וקטורי פילוח ולייעד אותם כמו pKR26-iBFP ו pKhR26-iBFP עבור mRosa26 ו- hROSA26 knock-in, בהתאמה.
  2. בניית וקטור פילוח כתבנית תיקון מונחית ההומולוגיה
    1. כדי לבטא את POI, להשיג את רצף cDNA (רצף קידוד) מדפדפן הגנום אנסמבל ולבחור את התמליל בעל רצף החלבון הארוך ביותר. לדוגמה, ה- cDNA של הגן האנושי ACE2 הוא ACE2-202 ENST00000427411.2 וה- cDNA של גן RASGRP1 האנושי הוא RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. לסנתז את cDNA של POI בעזרת ספק מסחרי. ניתן גם לשכפל את ה- cDNA באמצעות הגברת PCR (לא מתואר כאן). מקם את הרצף GGCGCGCCACC (5' - 3'), הכולל אתר הגבלת AscI (נוי ונועז) ואתר ייזום התרגום בקונצנזוס Kozak (הדגיש), מיד לפני קודון החניכה ATG של cDNA ואתר הגבלת AscI אחר (5'- GGCGCGCC -3') לאחר קודון העצירה של cDNA.
    3. לעכל את הרצף מסונתז עם AscI ולטהר באמצעות ערכת טיהור PCR המיועדת לטיהור שברי DNA לאחר הגבלת העיכול, בעקבות הוראות היצרנים (ראה טבלת חומרים).
    4. ליגת את ה-cDNA המטוהר לתוך וקטור עמוד השדרה הליניארי pKR26-iBFP או pKhR26-iBFP באמצעות ligase DNA T4 בעקבות הוראות היצרן.
    5. אמת את וקטור הפילוח הסופי, pKR26-POI-iBFP או pKhR26-POI-iBFP, על-ידי רצף. השתמש maxiprep כדי לטהר את המבנים המאומתים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    6. לעכל את וקטור פילוח באמצעות EcoRI או BamHI ולטהר את מוצר העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR על פי הוראות היצרן. אחסן את וקטור הפילוח הליניארי (~ 0.8 מיקרוגרם / μL) ב - 20 °C עד אלקטרופורציה.

3. אלקטרופורציה של קווי מקרופאג' ותאי T

  1. הכנת תרביות תאים לאלקטרופורציה
    1. הכן רוזוול פארק ממוריאל המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) כאמצעי צמיחה מלא עבור תאי Jurkat T. הכן את מדיום הנשר המעודכן (DMEM) של דולבק עם 10% FBS עבור פולחן RAW264.7 מקרופאגים. להשלים את כל מדיה צמיחה מלאה עם פניצילין U /mL ו 100 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין (Pen/ Strep) למעט מדיה המשמשת דגירה לאחר transfection לפני מיון התא.
    2. בצע תת-תרבות של תאי RAW264.7 ו- Jurkat T בהתאם להוראות הספק (ראה טבלת חומרים). בעת תת-תרבות RAW264.7 תאים, השתמש בפתרון טריפסין-EDTA (0.25%) כדי לנתק תאים. השתמש FBS בתוספת עם 10% (v/v) DMSO כאמצעי שימור הקפאה עבור RAW264.7 ותאי Jurkat.
    3. לאסוף תאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות עבור RAW264.7 מקרופאגים ו 90 × גרם במשך 8 דקות עבור תאי Jurkat T. לאחר מכן לשטוף עם 5-10 מ"ל של 1× DPBS (ללא Ca2 + או מ"ג2 + יונים). הסר את ה- DPBS.
    4. resuspend גלולה התא באמצעות 2 מ"ל של 1× DPBS. השתמש 10 μL של תאים לערבב עם נפח שווה של 0.2% טריפן כחול כדי להעריך את ספירת התאים ואת הכדאיות.
      הערה: ודא שתרבית התאים >90% הכדאיות ביום ההדבקה.
    5. לניסוי נוק-אין יחיד, בצע אלקטרופורציה עם 10 טיפים נוקלאופקטיון μL עם חמש חזרות. חשב את הנפח הדרוש עבור 2.0 × 106 תאים ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה. לשטוף את הכדור התא שוב עם 1× DPBS כמתואר בשלב 3.1.3.
      הערה: בעת שימוש 10 טיפים נוקלאופקטיון μL, 4.0 × 105 תאים נדרשים לכל אלקטרופורציה. בהתאם, להכין לפחות 2.0 × 106 תאים לניסוי נוק-אין אחד.
    6. הכן צלחת 24-well עם 0.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלא (מוכן בשלב 3.1.1) לבאר ללא עט / סטרפטוקום וקדם-מלחמה בחממה 37 °C.
  2. אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR/Cas9 וקטור הפילוח
    1. הפעל את מערכת האלקטרופורציה. השתמש בפרמטרים אלקטרופורציה ממוטב במחקר הקודם21: 1,400 V / 20 ms/ 2 פולסים עבור RAW264.7 מקרופאגים ו 1350 V / 20 ms/ 2 פולסים עבור תאי Jurkat T.
    2. חשבונאות לאובדן מדגם עקב pipetting, להכין תערובת אלקטרופורציה 55 μL בצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל המכיל 2.5 מיקרוגרם של כל וקטור CRISPR / Cas9, 2.4 מיקרוגרם של וקטור פילוח ליניארי, ואת חוצץ Resuspension R.
      הערה: כדי לחסוך זמן, תערובת אלקטרופורציה ניתן להכין במהלך צנטריפוגה (שלב 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 תאים (מוכן בשלב 3.1.5) בתערובת אלקטרופורציה 55 μL בשלב 3.2.2.
    4. שאפו את תערובת התא/אלקטרופורציה לשלב 3.2.3 באמצעות קצה נוקלאופקטיון 10 μL עם פיפטה.
      הערה: במהלך pipetting, להימנע החדרת בועות אוויר, אשר עלול לגרום לכשל אלקטרופורציה.
    5. הוסף את הדגימה לצינור מלא 3 מ"ל של Buffer E מערכת אלקטרופורציה.
    6. החל את הפרמטרים אלקטרופורציה עבור שני סוגי התאים כמתואר בשלב 3.2.1.
    7. מעבירים את הדגימה לבאר אחת של צלחת 24-well עם מדיום מחמם מראש מהשלב 3.1.6.
    8. חזור על שלבים 3.2.4-3.2.7 עבור ארבע החזרות האחרות, כמו גם עבור וקטור הפילוח בלבד ופקדי וקטור הביטוי CRISPR בלבד.
      הערה: שנה את קצה הנוקלאופקט ואת הצינור בעת מעבר לסוג תא אחר / DNA פלסמיד.
    9. תרבית התאים transfected עבור 48-72 שעות כדי לאפשר התאוששות לאחר אלקטרופורציה וביטוי של רכיבי CRISPR / Cas9 לפני ניתוח ציטומטריה זרימה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבחון את הביטוי של DsRed2 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד בערוץ אדום ב 24 שעות לאחר transfection.
      הערה: יתרון של ניטור תאי פלורסנט DsRed2 הוא כי היעילות של אלקטרופורציה ניתן להעריך את ההתאמה למיון תאים נוספים ניתן לחזות.

4. מיון תאים כדי לבודד תאים מכניסים

  1. לפני מיון FACS, לשטוף את התאים transfected פעם אחת עם מדיום צמיחה מלא. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 3.1.3 ו resuspened הכדור ב 500 μL של מדיום טרי.
  2. הגדר את סדרן התאים (הממוקם בארון בטיחות ביולוגית) עם זרבובית 85 מיקרומטר וקצב זרימה נמוך. בחר את מצב "תא בודד" למיון ובדיקת היעילות והדיוק של מיון תאים בודדים על-ידי מיון 20-30 תאים לכיסוי של מיקרו-לוחית 96-well. טיפה אחת המותאמת לשפות מקומיות במרכז כל באר מציינת התקנה נכונה של המכשיר.
  3. העבר את מתלה התא מ שלב 4.1 לצינורות FACS סטריליים והוסף כתם תא מת אדום SYTOX לריכוז סופי של 1 ננומטר.
  4. נתח דוגמאות בממיין התאים. SYTOX Red ו- EBFP2 נרגשים מלייזר 405 ננומטר ומזוהים על ידי ערוצי V450/BV421 ו- APC, בהתאמה. DsRed2 מתרגש על ידי לייזר 488 ננומטר ומזוהה על ידי ערוץ PE. השתמש בתאים שאינם מהודבקים ובתאים חיוביים יחידים של EBFP2 ו- DsRed2 כפקדים לפיצוי ספקטרלי.
  5. מיין 10 תאים בודדים לתוך כל באר של מיקרו-לוחית בעלת 96 באר המכילה 150 מיקרו-אל לבאר של מדיום צמיחה מלא שהתחמם מראש. השתמש במיקרו-לוחות עגולים לקווי תאי השעיה פולחניים כגון תאי Jurkat T ומיקרו-לוחות תחתוניים שטוחים עבור מקרופאגים גולמיים חסידים RAW264.7.
    הערה: מיון של 10 תאים לבאר היא אסטרטגיה ממוטבת לשיפור הישרדות התאים ולמזעור מספר המיקרו-לוחות של 96-well שיש לזרוע ומספר הדגימות שצריכות להיות מוקרנות על ידי ציטומטריית זרימה וגנוטיפינג; אם מיון תא אחד בלבד לבאר, זריעה של יותר microplates נדרש כדי להגדיל את הסיכוי להשיג תאים ערוכים כראוי.

5. סינון ואימות של תאים חיוביים

  1. הקרנה עבור תאי נוק-אין מועמדים לפי ציטומטריית זרימה
    1. לדגור על התאים בשלב 4.5 במשך 10-15 ימים ולהוסיף מדיום צמיחה מלא כל 3 ימים כדי להחליף נוזל שאבד באמצעות אידוי. עבור תאי Jurkat T, העבר תאים הגדלים בלוח התחתון העגול 96-well ללוח תחתון שטוח כדי לייעל את התפשטות התאים.
    2. העבר את התאים ממוינים מורחבים ללוחות 48 בארות להרחבה נוספת.
    3. כאשר התאים קרובים למפגש, השתמש במחצית מהתרבות כדי לסנן את ביטוי EBFP2 לפי ציטומטריית זרימה (איור 3). בדרך כלל, מחצית התרבות בצלחת 48-well לאחר צמיחה confluent משווה 0.5-1.0 × 105 תאים, אשר מספיק לניתוח של מדגם אחד על ידי ציטומטריית זרימה.
    4. מעבירים את התאים הנותרים לצלחות של 24 בארות להתפשטות נוספת.
    5. שמור על אוכלוסיות התא המועמדים בעלי אחוז גבוה של תאים חיוביים EBFP2 לניסויים genotyping נוסף.
      הערה: מכיוון ש-10 תאים ממוינים לכל באר של המיקרו-לוח בן 96 הבאר, ייתכן שתאי הנוק-אין יגדלו עם תאים שאינם מבטאים את הגן. לכן, זה נורמלי לבצע סיבוב נוסף של מיון תאים כדי להפריד את התאים EBFP2 חיוביים מהתאים השליליים.
  2. הקרנה עבור תאי נוק-אין של מועמדים לפי PCR ורצף
    1. לאסוף 2 × 105 תאים מועמדים. לחלץ את ה- DNA הגנומי באמצעות ערכת הכנה DNA (ראה טבלה של חומרים).
    2. כדי לוודא שתיקון מדויק מונחה ההומולוגיה (HDR) התרחש בלוקוס mRosa26 ולא באתרים אקראיים בגנום של תאי הנוק-אין של המועמד, בצעו PCR עם פריימרים המשתרעים על פני כל צד של ה- HAs (איור 4). בחר פריימר אחד הממוקם באזור הגנומי מחוץ לווקטור המטרה (אוליגו חיצוני) ועוד פריימר הממוקם בתוך וקטור המטרה (אוליגו פנימי).
      הערה: עיצוב דומה משמש לאימות HDR בלוקוס hROSA26. פריימרים PCR יכול גם להיות מתוכנן בקלות לזיהוי החדרת רצף POI. בנוסף, ניתן לזהות בו זמנית את הגנוטיפים של allele מסוג פראי ונוק-אין באמצעות פי.סי.אר בעל שלושה פריימרים (ראה קובץ משלים, איור S2).
    3. שכפל את מוצרי ה- PCR החיוביים באמצעות ערכת שיבוט מהיר (ראה טבלת חומרים). להפוך את תערובת התגובה לתאים DH5α מוסמכים.
    4. בחר באופן אקראי 8-10 מושבות חיידקים בודדות לכל טרנספורמציה ורצף את מוצרי ה- PCR מהשלב 5.2.3 על ידי רצף סנגר.
  3. אימות של תאי נוק-אין חיוביים על ידי ניתוח חיסוני וטיהור זיקה
    הערה: תאים מועמדים נתונים לניתוח אימונובלוט לאימות החדרת POI, או טיהור זיקה (AP) למחקרים של אינטראקציה חלבון חלבון.
    1. בצע ניתוח אימונובלט בהתאם להוראות יצרן הנוגדנים. ראה טבלת חומרים לקבלת מידע אודות השימוש בנוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים.
    2. נתקוף את lysates של תאי knock-in מבטאים את POI מתויג OST ל- AP באמצעות חרוזי סטרפטין Sepharose בעקבות הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
    3. זהה כימותרפיה באמצעות צלם.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל לביצוע ניסויי נוק-אין בלוקוס mRosa26 באמצעות מקרופאגים RAW264.7 murine, עיצבנו וקטור מיקוד כדי לבטא ACE2 אנושי, קולטן עבור וירוס SARS-Cov-2 (איור 2A). באמצעות עיצוב דומה, יצרנו תאי Jurkat T אנושיים עם נוק-אין של חלבון היתוך RASGRP1 מתויג OST(איור 2C). לאח?...

Discussion

בניסויים שלנו, הדגמנו כיצד לבצע עריכה נוק-אין בתאי מערכת החיסון מעיצוב מבנים ועד הקרנת תאים ואימות באמצעות תאי Jurkat T אנושיים ו macrophages RAW264.7 murine כדוגמאות. הן קווי תא T והן קווי תא מקרופאג' עמידים בפני טרנספקטיון36,37; עם זאת, הבעיה של יעילות נמוכה של משלוח CRISPR / Cas9 נ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של האוניברסיטה הרפואית שינש'יאנג. פיתוח של טכנולוגיה כזו נתמך על ידי מענקי NSFC 81601360 LZ, 81471595 32070898 ל- YL. העבודה נתמכת גם על ידי קרן ועדת החינוך של הנאן מס ' 21IRTSTHN030.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Imager 600Ge Healthcareimaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium saltMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent CellsTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tubeBD Biosciences352003
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology5174at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermoFisher Scientific31430at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfateMP Biomedicals194531
LB agar powderThermoFisher Scientific22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)Eppendorf, or similar
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge TubesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipette tip 0.1-20µlEppendorf, or similar0030 075.005
Pipette tip 2-200µlEppendorf, or similar0030 075.021
Pipette tip 50-1000µlEppendorf, or similar0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitationThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol redThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf, or similar0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177CRISPR Cas9Rosa26ThACE2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved