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摘要

该协议使用荧光记者和细胞分拣来简化巨噬细胞和T细胞系的敲击实验。两个质粒用于这些简化的敲击实验，即CRISPR/Cas9-和DsRed2表达质粒和同源重组供体质粒表达EBFP2，这是永久整合在 Rosa26 点在免疫细胞。

摘要

免疫系统的功能基因组学研究需要基因操作，包括删除目标基因和在感兴趣的蛋白质中添加元素。细胞系模型中基因功能的识别对于基因的发现和细胞内在机制的探索具有重要意义。然而，使用CRISPR/Cas9介质敲击的免疫细胞（如T细胞和巨噬细胞系）的基因操作是困难的，因为这些细胞的转染效率低，尤其是在静止状态下。为了改变免疫细胞中的基因，耐药性选择和病毒载体通常用于丰富表达CRIPSR/Cas9系统的细胞，这不可避免地导致细胞的不良干预。在之前的研究中，我们设计了双荧光记者耦合到CRISPR/Cas9，在电透后短暂表达。这种技术解决方案可导致免疫细胞中快速基因缺失:然而，基因敲击免疫细胞，如T细胞和巨噬细胞，而不使用耐药性选择或病毒载体是更具挑战性的。在本文中，我们表明，通过使用细胞分拣来帮助选择暂时表达CRISPR/Cas9结构的目标 Rosa26 细胞群结合供体质粒，基因敲击可以在T细胞和巨噬细胞中实现，而无需耐药性浓缩。例如，我们通过进行敲击实验，在RAW264.7巨噬细胞中展示如何表达人类ACE2，SARS-Cov-2的受体，它负责当前Covid-19大流行。这种基因敲击细胞可以广泛用于机械研究。

引言

免疫细胞对防御病原体至关重要。先天免疫和适应性免疫是需要清除感染剂和维持组织平衡1，2。细胞系模型是了解哺乳动物免疫系统分子基本原理的重要工具:它们用于体外功能测定，如模拟人体T细胞活化，以及确定遗传因素在激活或抑制免疫反应中的功能3，4。需要注意的是，哺乳动物的免疫系统是极其异质的，同样重要的是，大量的分子控制着特定细胞类型5、6的分化、迁移和功能。

聚类定期间歇性短白细胞重复（CRISPR）/Cas9基因组编辑工具允许特定细胞类型的基因操作，从而促进基因的功能注释以精确的方式7，8。一些已发表的协议描述了CRISPR/Cas9的交付形式Cas9导引RNA复合物称为核糖核蛋白（RNP）在HIK293细胞，Jurkat细胞系，原发T细胞9，10，巨噬细胞11，12，13，干细胞14，和其他15，16。在这些协议中，基因标记通常是通过将荧光标签与内源性蛋白质17、18融合来实现的。然而，很少尝试使用双荧光记者，这是兼容的单细胞排序，以促进敲击实验19，20，特别是在免疫细胞。

旨在理解免疫细胞中新基因因子功能的深入机械分析通常需要细胞类型特定地删除基因、基因拯救实验以及理想地识别其相互作用物。尽管在免疫细胞中优化基因缺失的方法已经公布9，15，21，但关于引入具有多功能的敲击等位基因来理解免疫反应的方法却少得多。因此，在这个协议中，我们旨在详细描述一个高效和高度可重复的协议，以表达一个蛋白质的兴趣在安全港点Rosa26在人类和穆林免疫细胞线。我们设计了一个双色报告系统，用于丰富用质粒表示CRISPR/Cas9（DsRed2）和重组DNA模板（EBFP2）的细胞，这些模板可以通过细胞分拣进行分离。根据这个协议，我们获得了人类T细胞系Jurkat和穆林巨噬细胞RAW264.7的多个敲击线，用于对研究不善的蛋白质进行功能分析。

例如，我们在此协议中展示如何获得可敲击 RAW264.7 巨噬细胞，稳定地表达人类ACE2（SARS-Cov-2的受体）22。由于先天免疫细胞参与Covid-1923、24和人类ACE2的发病机制，被认为是病毒在复制前进入细胞所需的主要受体，具有人类ACE2的微噬细胞可以作为巨噬细胞内病毒增殖的机械研究的有用工具。同时，我们还介绍了一个基因在人类ROS26位点敲击来表达RASGRP1蛋白的例子，该蛋白在其氨基终点与亲和力双链球菌标签（OST）融合在一起。T细胞是免疫疗法中的关键靶细胞，越来越多的研究集中在对癌症的反应上。由于Rasgrp1是T细胞受体下游的关键信号分子，其相互作用因素27日没有得到很好的阐明，OST-RASGRP1的敲击模型为识别调节T细胞对肿瘤和感染反应的相互作用者奠定了基础。综合起来，这些工具可用于Covid-19的研究和发现与Rasgrp1相互作用的新分子。

研究方案

1. 以 罗莎26 蝗虫为目标的 sgRNA 的设计和普拉斯米德构造

  1. 围绕所需插入站点的设计指南 RNA
    1. 确保鼠标Rosa26（以下简称mRosa26）的插入点位于mRosa26的第一个内电路:这个网站已经用于以前的研究28，29。对于人体细胞的敲击实验，确保插入位点位于人类ROSA26位点（以下简称hROSA26），该位点已被确定为mRosa2630的人类同源。
    2. 分别使用从小鼠基因组信息学（http://www.informatics.jax.org/）和Ensembl基因组浏览器（http://www.ensembl.org/index.html）获得的老鼠和人类物种的基因组序列。复制mRosa26 或 hROSA26点两侧所需的插入位点两侧的基因组序列的 50 个碱基对 （bp）。
    3. 设计指南RNA使用在线网络工具CRISPR（http://crispor.tefor.net/）31。将输入序列的 100 bp 从 1.1.2 中粘贴。选择两个具有高特异性分数、高效率分数和低目标活动的引导性 RNA。此外，选择具有较高 Doench 分数的 RNA 指南，避免那些标有"低效"32的指南。
      注:替代CRISPR设计工具也是有价值的和公开的，例如长凳CRISPR设计工具（https://benchling.com/crispr）。要增加CRISPR/Cas9介导的内嵌变异细胞的频率，请尽可能选择两个靠近所需插入位点的引导RNA。
    4. 对于mRosa26蝗虫，请使用两个相邻的指南 RNA，指定为 mR26-sg1 （5'- CTCCATCTCTAGAGAGAAT -3'） 和 mR26-sg2 （5'- CGCCTCTCTAGAAC -3'） （图 1A）。对于hROSA26蝗虫，请使用两个相邻的指南 RNA，即 hR26-sg1 （5'- GGCGAGACACCG -3'） 和 hR26-sg2 （5'- AATGAGAAGACACCA-3'） （图 1B）。
      注:分别在RAW264.7细胞和Jurkat细胞中评估了mR26-sg1和mR26-sg2的基因组编辑活动（见补充文件，图S1）。
  2. 以 罗莎26 蝗虫为目标的含有 sgRNA 的 CRISPR 表达载体克隆
    1. 合成一个指南RNA的向前和向后寡头（见 补充文件）。
      注:最好在指南序列的开头添加"G"核苷酸，这有助于由 U6 发起人驱动的表达方式。例如，要克隆上述 mR26-sg1，前方寡头是 CACCGCTCCATCTCTAGAGAGAAT，反向寡头是 AACATTCTAGAAGGGC。前寡头中的附加 G 及其在反向寡头中的补充以粗体表示。
    2. 克隆合成寡头对应指南RNA到一体式CRISPR表达载体pX458-DsRed2生成在我们以前的工作21（图1C）使用一般协议的gRNA克隆由张的实验室（https://www.addgene.org/crispr/zhang/）:但是，跳过凝胶纯化步骤，使用 PCR 净化套件净化消化的载体（参见材料表）。
      注:在以前的协议中，对BbsI消化的载体进行了凝胶净化:但是，此步骤非常耗时。在本协议中，消化的产品使用 PCR 纯化套件进行净化，并直接用于下游结结反应，通常产生具有类似效率的正菌落。
    3. 根据制造商的说明，将 10 μL 的粘合产品（步骤 1.2.2）转换为 50 μL的 Escherichia 大肠杆菌 DH5® 合格电池。随机从带安培素（100 μg/mL）的LB琼脂板中挑选三个菌落，并将每个菌落接种到3 mL的LB介质中，用安培素在一夜之间培养。
    4. 使用 1 mL 的隔夜细菌培养物进行桑格测序，并将其余的保持在 4 °C，直到结构被确认为正确:pDsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR26-sg2 用于 mRosa26 蝗虫敲击， 和 pdsr - hr26 - sg1 和 pdsr - hr - sg2 用于 hrosa26 点。
    5. 准备高浓度的质粒 DNA （约 2 微克 / μL），配上套件，用于净化转染级质粒（见 材料表）。

2. 设计和建造目标矢量作为同源重组模板

  1. 设计同源定向修复模板
    1. 设计一个目标载体，构成表达POI使用从以前的研究29优化的表达盒，其中包括一个CAG混合促进器，一个AscI限制站点允许克隆的POI的cDNA，IRES-EBFP2记者，和牛生长激素聚腺基化（bGH-polyA）信号（图1B 和 补充文件）。
    2. 设计与 mRosa26 或 hROSA26 位的基因组序列共享同源的同源臂 （HAs）。包括 +1 kb 的 5' HA 对应上游基因组序列从所需的插入站点到表达盒的左侧。同样，包括从插入位到表达盒右侧的下游基因组序列对应的 3' HA 的 +1 kb。
      注:表情盒插入尽可能接近 CRISPR / Cas9 网站34 。为了避免CRISPR/Cas9重新切割目标等位基因，将核苷酸变化纳入目标向量34、35的原空间相邻主题（PAM）序列（5'-NGG-3'）中。
    3. 要允许目标载体的线性化，请在 5' HA 上游插入一个独特的 EcoRI 站点，在 3' HA 的下游插入一个独特的 BamHI 站点。
    4. 让商业供应商合成目标矢量，并指定它们分别为 mRosa26 和 hROSA26 敲击的 pKR26-iBFP 和 pKhR26-iBFP。
  2. 构建目标矢量作为同源定向修复模板
    1. 要表达 POI，请从 Ensembl 基因组浏览器获取 cDNA 序列（编码序列），并选择具有最长蛋白质序列的脚本。例如，人类 ACE2 基因的cDNA是ACE2-202 ENST00000427411.2，人类 RASGRP1 基因的cDNA是RASGRP1 ENSG00000172575。
    2. 在商业供应商的帮助下合成 POI 的 cDNA。也可以通过 PCR 放大（此处未描述）克隆 cDNA。将序列GGCGCGCCACC （5' - 3'） 放在 cDNA 停止后立即放置序列 GGCG CGCCACC （5' - 3'），其中包括 AscI 限制站点（意体和粗体）和 Kozak 共识翻译启动站点（下划线），紧接着是 CDNA 的 ATG 启动 codon 和另一个 AscI 限制站点 （5'- GGCGCC-3'）。
    3. 根据制造商的说明（参见 材料表），使用 PCR 净化套件消化 AscI 的合成序列，并使用 PCR 净化套件进行净化，用于在限制消化后净化 DNA 片段。
    4. 根据制造商的说明，使用 T4 DNA 韧带将纯化 cDNA 插入 AscI 线性骨干载体 pKR26-iBFP 或 pKhR26-iBFP 中。
    5. 通过测序验证最终目标向量 pKR26-POI-iBFP 或 pKhR26-POI-iBFP。使用 maxiprep 根据制造商的协议对经过验证的构造进行净化。
    6. 使用 EcoRI 或 BamHI 消化目标载体，并根据制造商的说明使用 PCR 净化套件净化消化产品。将线性定位矢量（+0.8 μg/μL）存储在 -20 °C 下，直到电化。

3. 巨噬细胞和 T 细胞线的电电

  1. 为电位准备细胞培养物
    1. 准备罗斯韦尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 补充 10% 胎儿牛血清 （FBS） 作为完整的生长介质为 Jurkat T 细胞。准备杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 与 10% FBS 培养 RAW264.7 巨噬细胞。补充所有完整的生长介质与100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Pen/Strep），除了用于细胞分拣前感染后孵化的介质。
    2. 根据供应商的说明（参见 材料表），对 RAW264.7 和 Jurkat T 细胞进行亚培养。在亚培养 RAW264.7 细胞时，使用 trypsin-EDTA 溶液（0.25%）分离细胞。使用 FBS 补充 10% （v/v） DMSO 作为 RAW264.7 和 Jurkat 细胞的冷冻保存介质。
    3. 以 250 × g 收集细胞，5 分钟用于 RAW264.7 巨噬细胞，90 × g 收集 8 分钟用于 Jurkat T 细胞。然后用 5-10 mL 的 1× DPBS 清洗（没有 Ca2+ 或 Mg2+ 离子）。删除 DPBS。
    4. 使用 2 mL 的 1× DPBS 重新使用细胞颗粒。使用 10 μL 的细胞，并与等量的 0.2% 试穿蓝色混合，以估计细胞计数和生存能力。
      注意:确保细胞培养在转染当天具有>90%的生存能力。
    5. 对于单个敲击实验，使用 10 μL 核感染提示进行电击，并重复 5 次。计算2.0×106 个细胞所需的体积，并通过离心颗粒细胞。再次用第 3.1.3 步中描述的 1× DPBS 清洗细胞颗粒。
      注:使用 10 微升核素尖时，每次电击需要 4.0 ×10 5 个细胞。因此，准备至少2.0×106 个细胞进行一次敲击实验。
    6. 准备一个24井板与0.5mL的完全生长介质（准备在步骤3.1.1）每井没有笔/链球和预热在37°C孵化器。
  2. CRISPR/Cas9 组件的电化和目标矢量
    1. 打开电镀系统。使用先前研究中优化的电聚参数21: 1，400 V/20 ms/2 脉冲，用于 RAW264.7 巨噬细胞和 1350 V/20 ms/2 脉冲，用于 Jurkat T 细胞。
    2. 考虑管道造成的样品损失，在无菌的 1.5 mL 微中心管中准备 55 微电位混合物，其中每个 CRISPR/Cas9 载体 2.5 μg，线性瞄准矢量 2.4 μg，以及悬浮缓冲器 R。
      注:为了节省时间，在离心过程中可以准备电化混合物（第3.1.5步）。
    3. 从第 3.2.2 步开始，在 55 微升电聚混合物中重复 2.0 × 106 个电池（在步骤 3.1.5 中准备）。
    4. 使用带移液器的 10 μL 核素尖端从第 3.2.3 步吸气细胞/电聚混合物。
      注意:在管道输送过程中，避免引入可能导致电击故障的气泡。
    5. 将样品添加到从电镀套件中装满 3 mL 缓冲器 E 的管子中。
    6. 应用第 3.2.1 步中描述的两种细胞类型的电电电位参数。
    7. 将样品从第 3.1.6 步转移到 24 井板的一口井中，并预制介质。
    8. 重复步骤 3.2.4-3.2.7 用于其他四个重复以及仅针对目标矢量和 CRISPR 表达向量仅控制。
      注意:切换到不同的细胞类型/质粒DNA时，更改核感染尖端和管。
    9. 将转染细胞培养为 48-72 小时，以便在流细胞学分析或荧光激活细胞分拣 （FACS） 之前，在 CRISPR/Cas9 组件的电电和表达后进行恢复。使用荧光显微镜检查 DsRed2 的表达，该显微镜在感染后 24 小时配备红色通道。
      注:监测DsRed2荧光细胞的一个好处是，可以估计电电效率，并预测进一步细胞分拣的适宜性。

4. 细胞分类以隔离假定敲入细胞

  1. 在 FACS 排序之前，用完整的生长介质清洗一次受感染的细胞。通过离心离心的颗粒细胞，如第 3.1.3 步所述，并将颗粒重新悬回 500 μL 的新鲜介质中。
  2. 设置具有 85 μm 喷嘴和低流量的细胞分拣器（位于生物安全柜中）。选择"单细胞"模式进行排序，通过将 20-30 个细胞排序到 96 井微板的盖上来分类并测试单个单元格分拣效率和精度。每个井中央的一滴定位指示仪器的正确设置。
  3. 将细胞悬浮从第 4.1 步转移到无菌 FACS 管中，并将 SYTOX 红死细胞污渍添加到 1 nM 的最终浓度。
  4. 分析细胞分拣器上的样品。SYTOX Red 和 EBFP2 分别被 405 nm 激光激发，并被 V450/BV421 和 APC 通道检测到。DsRed2 被 488 nm 激光激发，并被 PE 通道检测到。使用未转染的细胞和EBFP2-和DsRed2单个阳性细胞作为光谱补偿的对照组。
  5. 将10个单细胞排序到每口96井微板的井中，每口预热完全生长介质含有150微升。使用圆形底部微板培养悬架细胞线，如 Jurkat T 细胞和平底微板，用于粘附 RAW264.7 巨噬细胞。
    注:每口井对10个细胞进行排序是提高细胞存活率和尽量减少需要播种的96井微板数量以及需要通过流细胞学和基因型筛选的样本数量的优化策略:如果每口井只排序一个细胞，则需要播种更多的微板，以增加获得正确编辑的细胞的机会。

5. 积极敲击细胞的筛选和验证

  1. 通过流细胞学筛选候选敲击细胞
    1. 将细胞从第4.5步孵育10-15天，每3天添加一次完整的生长介质，以取代蒸发后失去的液体。对于 Jurkat T 细胞，将生长在圆底 96 井板中的细胞转移到平底板，以优化细胞增殖。
    2. 将扩展的分拣单元转移到 48 井板以进行进一步扩展。
    3. 当细胞接近汇合时，使用一半的培养基通过流细胞测量屏蔽EBFP2表达（图3）。通常，汇合生长后48井板中一半的培养物等同于0.5-1.0×105 个细胞，这足以通过流细胞学分析一个样本。
    4. 将剩余的细胞转移到24井板，以进一步增殖。
    5. 保持候选细胞群拥有高比例的EBFP2阳性细胞，以进行进一步的基因分型实验。
      注:由于10个细胞被分类到96井微板的每一口井中，因此敲击细胞有可能与不表达敲击基因的细胞一起生长。因此，进行另一轮细胞分拣，将EBFP2阳性细胞与负细胞分离是正常的。
  2. 通过 PCR 和测序筛选候选敲击单元
    1. 收集 2 × 105 个候选单元格。使用DNA准备包提取基因组DNA（见 材料表）。
    2. 为了验证精确的同源定向修复 （HDR） 发生在 mRosa26 位点，而不是在候选敲击细胞基因组中的随机位点，执行 PCR 与底漆跨越 HA 的每一侧（图 4）。选择位于目标向量（外部寡头）外的基因组区域的一个底漆和位于目标向量（内部寡头）内的另一个底漆。
      注:类似的设计用于验证HROSA26点的 HDR。PCR 引物也可轻松设计用于检测 POI 序列的插入。此外，野生类型和敲击等位基因型可以同时检测使用三引线PCR（见补充文件，图S2）。
    3. 使用快速克隆套件克隆正 PCR 产品（参见 材料表）。将反应混合物转换为 DH5+ 称职细胞。
    4. 随机选择8-10个单独的细菌菌落每个转换和序列PCR产品从步骤5.2.3桑格测序。
  3. 通过免疫膨胀分析和亲和力纯化验证正敲击细胞
    注:候选细胞接受免疫膨胀分析，以验证POI的插入，或亲和纯化（AP）用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究。
    1. 根据抗体制造商的说明执行免疫膨胀分析。有关使用原发性抗体和二级抗体的信息，请参阅 材料表 。
    2. 根据制造商的说明（参见 材料表），使用链球菌-泰斯汀·塞法罗斯珠将表达 OST 标记 POI 的敲击细胞的解质置于 AP 中。
    3. 使用成像仪检测化疗。

结果

按照上述协议，使用木乃伊RAW264.7巨噬细胞在 mRosa26 靶点进行敲击实验，我们设计了一个靶向载体来表达人类ACE2，SARS-Cov-2病毒的受体（图2A）。使用类似的设计，我们生成了人类Jurkat T细胞与OST标记RASGRP1融合蛋白（图2C）的敲击。在转染三个质粒后，其中两个用于表示 CRISPR/Cas9 （DsRed2; pdsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR-sg2 用于 mRosa26 敲击; pdsR-hR26-sg1 和 ...

讨论

在我们的实验中，我们演示了如何使用人类 Jurkat T 细胞和 Murine RAW264.7 巨噬细胞进行免疫细胞的敲击编辑，从结构设计到敲击细胞筛选和验证。T细胞和巨噬细胞系都耐转染36，37:然而，CRISPR/Cas9交付效率低下的问题可以通过荧光记者的辅助和细胞分拣来克服。本协议适用于基因抢救实验和蛋白质-蛋白质相互作用实验，但不能应用于调控DNA序列的研究，?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢新乡医科大学的流细胞学核心设施。国家自然科学基金向LZ、81471595和32070898提供81601360支持了这种技术的发展。这项工作也得到了河南省教委第21号IRTSTHN030基金会的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Imager 600Ge Healthcareimaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium saltMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent CellsTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tubeBD Biosciences352003
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology5174at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermoFisher Scientific31430at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfateMP Biomedicals194531
LB agar powderThermoFisher Scientific22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)Eppendorf, or similar
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge TubesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipette tip 0.1-20µlEppendorf, or similar0030 075.005
Pipette tip 2-200µlEppendorf, or similar0030 075.021
Pipette tip 50-1000µlEppendorf, or similar0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitationThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol redThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf, or similar0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799

参考文献

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