JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية تتبع الخلايا التائية غير الغازية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجسم الحي باستخدام منصة متاحة سريريا.

Abstract

أظهرت الخلايا التائية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR) نتائج غير مسبوقة في التجارب السريرية المحورية للمرضى الذين يعانون من أورام الخلايا البائية الخبيثة أو الورم النقوي المتعدد (MM). ومع ذلك ، فإن العديد من العقبات تحد من فعالية وتحظر الاستخدام الواسع النطاق لعلاجات الخلايا التائية CAR بسبب سوء الاتجار والتسلل إلى مواقع الأورام وكذلك عدم الثبات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن السمية التي تهدد الحياة، مثل متلازمة إطلاق السيتوكين أو السمية العصبية، هي الشواغل الرئيسية. يتيح التصوير الفعال والحساس وتتبع الخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها وتوصيف الجسم الحي ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود الحالية للعلاج بالخلايا التائية CAR. تصف هذه الورقة منهجية دمج سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) في الخلايا التائية CAR والتصوير بالخلايا التائية CAR باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار [18F] رباعي فلوروبورات البوزيترون ([18F]TFB-PET) في النماذج قبل السريرية. يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى والجينات المستهدفة بالإضافة إلى تلك المستخدمة في هذه الدراسة.

Introduction

العلاج بالخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR T) هو نهج سريع الظهور ويحتمل أن يكون علاجيا في الأورام الخبيثة الدموية1،2،3،4،5،6. تم الإبلاغ عن نتائج سريرية غير عادية بعد العلاج بالخلايا التائية CAR T (CART19) الموجه بواسطة CD19 أو مستضد نضج الخلايا البائية (BCMA) 2. أدى ذلك إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على خلايا CART19 لسرطان الغدد الليمفاوية العدواني للخلايا البائية (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4 ، tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ، و lisocabtagene maraleucel)7 ، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (Tisa-Cel) 5,8 ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (brexucabtagene autoleuce)9 ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي (Axi-Cel)10 . في الآونة الأخيرة ، وافقت إدارة الأغذية والعقاقير على العلاج بالخلايا التائية CAR الموجهة من BCMA في المرضى الذين يعانون من الورم النقوي المتعدد (MM) (idecabtagene vicleucel)11. علاوة على ذلك ، فإن العلاج بالخلايا التائية CAR لسرطان الدم اللمفاوي المزمن (CLL) في مرحلة متأخرة من التطور السريري ومن المتوقع أن يحصل على موافقة إدارة الأغذية والعقاقير في غضون السنوات الثلاث المقبلة1.

على الرغم من النتائج غير المسبوقة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، فإن استخدامه على نطاق واسع محدود بنسبة 1) عدم كفاية توسع الخلايا التائية CAR في الجسم الحي أو سوء الاتجار إلى مواقع الورم ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الاستجابة الدائمة12،13 و 2) تطور الأحداث الضائرة التي تهدد الحياة ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS)14،15 . السمات المميزة ل CRS لا تشمل فقط تنشيط المناعة مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة من السيتوكينات الالتهابية / chemokines ولكن أيضا انتشار الخلايا التائية الضخمة بعد ضخ الخلايا التائية CAR 15,16. وبالتالي ، فإن تطوير استراتيجية معتمدة من الدرجة السريرية لتصوير الخلايا التائية CAR في الجسم الحي سيسمح ل 1) تتبع الخلايا التائية CAR في الوقت الفعلي في الجسم الحي بمراقبة الاتجار بها إلى مواقع الأورام والكشف عن الآليات المحتملة للمقاومة ، و 2) مراقبة توسع الخلايا التائية CAR وربما التنبؤ بسميتها مثل تطور CRS.

السمات السريرية ل CRS الخفيفة هي ارتفاع درجة الحرارة والتعب والصداع والطفح الجلدي والإسهال وألم المفاصل والألم العضلي والشعور بالضيق. في CRS الأكثر شدة ، قد يصاب المرضى بعدم انتظام دقات القلب / انخفاض ضغط الدم ، وتسرب الشعيرات الدموية ، وضعف القلب ، والفشل الكلوي / الكبدي ، والتخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية 17،18. بشكل عام ، ثبت أن درجة ارتفاع السيتوكينات ، بما في ذلك الإنترفيرون غاما ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ، والإنترلوكين (IL)-10 ، و IL-6 ، ترتبط بشدة الأعراض السريرية17،19. ومع ذلك ، فإن التطبيق المكثف لمراقبة السيتوكين في المصل "في الوقت الفعلي" للتنبؤ ب CRS أمر صعب بسبب التكلفة العالية والتوافر المحدود. لاستغلال الخصائص المفيدة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، يمكن استخدام التصوير غير الغازي للخلايا التائية بالتبني للتنبؤ بالفعالية والسمية والانتكاس بعد ضخ الخلايا التائية CAR.

طور العديد من الباحثين استراتيجيات لاستخدام التصوير القائم على النويدات المشعة مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أو التصوير المقطعي المحوسب بانبعاثات فوتون واحد (SPECT) ، والذي يوفر دقة عالية وحساسية عالية20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ل في الجسم الحي تصور ورصد الاتجار بالخلايا التائية CAR. ومن بين استراتيجيات التصوير القائمة على النويدات المشعة، تم تطوير سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) كطريقة حساسة لتصوير الخلايا والفيروسات باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني 31,32. يعد تصوير الخلايا التائية NIS+CAR باستخدام [18F]TFB-PET تقنية حساسة وفعالة ومريحة لتقييم وتشخيص توسع الخلايا التائية CAR والاتجار بها وسميتها30. يصف هذا البروتوكول 1) تطوير الخلايا التائية NIS + CAR من خلال النقل المزدوج بفعالية عالية و 2) منهجية لتصوير الخلايا التائية NIS + CAR مع [18F] TFB-PET يتم استخدام الخلايا التائية BCMA-CAR ل MM كنموذج إثبات للمفهوم لوصف NIS كمراسل لتصوير الخلايا التائية CAR. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه المنهجيات على أي علاج آخر بالخلايا التائية CAR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتبع البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (مايو كلينك)، ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في Mayo Clinic.

1. NIS+ BCMA-CAR إنتاج الخلايا التائية

ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (IRB 17-008762) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC Bios00000006.04).

  1. إنتاج BCMA-CAR ، NIS ، و LUCIFERASE-GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) - المشفرة lentiviruses.
    ملاحظة: تم تصنيع بنية BCMA-CAR من الجيل الثاني من جديد (انظر جدول المواد) واستنساخها إلى ناقل فيروسي من الجيل الثالث تحت سيطرة محرك معامل استطالة - 1 ألفا (EF-1α). تضمن بناء BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) تحفيز التكلفة 4-1BB وجزء متغير أحادي السلسلة (scFv) مشتق من استنساخ الأجسام المضادة BCMA المضادة للإنسان C11D5.333,34. يخضع NIS لسيطرة المحرك الأولي EF-1α ويرتبط بجين مقاومة البيروميسين عبر الببتيدات ذاتية الشق (P2A). يستخدم الناقل الفيروسي الذي يشفر luciferase-GFP (انظر جدول المواد) لنقل الخلايا السرطانية ، والتي تعبر بعد ذلك عن GFP و luciferase.
    1. تحضير بلازميدات ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 ميكروغرام) ، PBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 ميكروغرام) ، و pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 ميكروغرام).
      ملاحظة: يحتوي PBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro و pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro على جين مقاومة البيروميسين. لذلك ، يمكن اختيار الخلايا المحولة NIS- أو luciferase-GFP مع 1 ميكروغرام / مل أو 2 ميكروغرام / مل من ثنائي هيدروكلوريد البيروميسين ، كما هو موضح سابقا14,35.
    2. البذور 20 × 106 من 293T الخلايا في قارورة T175 وحضانت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تأكد من أن الخلايا التائية 293T موزعة بالتساوي على القارورة عند التقاء 70-90٪ عن طريق التصور المباشر تحت المجهر.
    3. قم بإعداد مزيج رئيسي من 15 ميكروغرام من متجه التعبير (على سبيل المثال ، CAR أو NIS أو الحمض النووي الخطي luciferase-GFP) ، و 7 ميكروغرام من متجه المغلف (VSV-G) ، و 18 ميكروغرام من متجه التعبئة (كمامة ، pol ، rev ، و tat). قم بتخفيف مزيج الحمض النووي الرئيسي في 4.5 مل من وسط النقل ، ثم أضف 111 ميكرولتر من كاشف ما قبل التعقيد (الخليط A).
    4. تحضير أنبوب جديد، وتخفيف 129 ميكرولتر من كاشف نقل الدهون في 4.5 مل من وسط النقل (الخليط B).
    5. امزج المخلوطين A و B ونفض الأنبوب لخلط المحتويات. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. بعد الحضانة ، ما عليك سوى شفط الخلية الفائقة دون فصل الخلايا وإضافة 16 مل من وسط النمو الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامين. ثم ، أضف خليط المخلوطين A و B على خلايا 293T قطرة. أخيرا ، احتضن الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    7. في اليومين 1 و 2 بعد النقل ، قم بحصاد supernatant من 293T ، وقم بالدوران عند 900 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بالتصفية من خلال مرشح نايلون 0.45 ميكرومتر. ركز الترشيح عند 24 و 48 ساعة بواسطة الطرد المركزي الفائق عند 112,700 × جم لمدة 2 ساعة ، وقم بالتجميد عند -80 درجة مئوية.
  2. خارج الجسم الحي عزل الخلايا التائية (الشكل 1)
    ملاحظة: قم بإجراء جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة تدفق صفحي باستخدام تقنية التعقيم ومعدات الحماية الشخصية. يتم حصاد خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من دم المتبرع المتطوعين الأصحاء الذي يتم جمعه أثناء الفصادة36. تم إجراء فحص مسببات الأمراض على الخلايا البشرية المستخدمة في هذه الدراسة.
    1. استخدم تقنية تدرج الكثافة القياسية لعزل PBMCs.
      1. أضف بلطف 15 مل من وسط تدرج الكثافة (كثافة 1.077 جم / مل) (يحتوي على ألفا دي غلوكوبيرانوسيد ، بيتا دي فروكتوفورانوسيل هوموبوليمر ، و 3-(أسيتيلامينو) -5-(أسيتيل ميثيل أمينو) -2،4،6-ملح أحادي الصوديوم حمض ثلاثي الدودوبنزويك) إلى أنبوب فصل متدرج بكثافة 50 مل دون إنشاء فقاعات هواء (انظر جدول المواد).
      2. لتجنب محاصرة الخلايا، قم بتخفيف عينة الدم باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، 0.2 جم/لتر من كلوريد البوتاسيوم، 0.2 جم/لتر من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة، 8 جم/لتر من كلوريد الصوديوم، و1.15 جم/لتر من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة) يحتوي على 2٪ FBS بنسبة حجم 1:1. انقل الدم المخفف بلطف فوق وسط تدرج الكثافة دون كسر الواجهة بين الاثنين. تدور لأسفل عند 1200 × غرام لمدة 10 دقائق في RT.
        ملاحظة: يمكن استخدام أنبوب فصل متدرج الكثافة 50 مل لعزل 4-17 مل من عينة الدم. لا يتطلب أنبوب فصل التدرج بكثافة 50 مل (انظر جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول "إيقاف تشغيل الفرامل" أثناء الطرد المركزي. ومع ذلك ، عند استخدام أنابيب 50 مل القياسية ، يجب إيقاف تشغيل الفرامل وتتطلب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة.
      3. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، واغسله باستخدام PBS + 2٪ FBS عن طريق ملء ما يصل إلى 50 مل ، ثم قم بالدوران لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق في RT.
      4. استنشاق supernatant ، وإعادة تعليق الخلايا الحبيبية في 50 مل من PBS + 2٪ FBS. احسب عدد الخلايا ، ثم قم بالدوران لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق في RT. كرر الخطوة السابقة لما مجموعه 2 غسلة.
    2. شفط السوبرناتانت ، وإعادة تعليق الخلايا الحبيبية إلى تركيز 50 × 106 خلية / مل مع PBS + 2٪ FBS.
    3. قم بإجراء عزل الخلايا التائية من PBMCs باستخدام مجموعة خرز مغناطيسي ذات اختيار سلبي.
      ملاحظة: تتضمن مجموعة الاختيار السلبي المثالية حبات مغناطيسية متصلة بالأجسام المضادة ضد المستضدات المعبر عنها على خلايا أخرى غير الخلايا التائية. تحتوي المجموعة شائعة الاستخدام على أجسام مضادة مقترنة بالخرز المغناطيسي ضد CD15 و CD14 و CD34 و CD36 و CD56 و CD123 و CD235a و CD19 و CD16 (انظر جدول المواد).
      1. انقل PBMCs إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع سعة 14 مل. بعد ذلك ، ضع PBMCs وكوكتيل الأجسام المضادة للاختيار السلبي في فاصل خلايا آلي بالكامل ، وقم بإجراء عزل الخلايا التائية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. تحفيز الخلايا التائية وتوسيع الخلايا التائية (الشكل 1)
    1. لزراعة الخلايا التائية المعزولة، قم بإعداد وسط تمدد الخلايا التائية (TCM) المصنوع من وسط الخلايا المكونة للدم الخالي من المصل مع 10٪ من ألبومين المصل البشري و 1٪ من البنسلين-الستربتومايسين-الجلوتامين14. بعد عزل الخلايا التائية ، عد الخلايا والثقافة بتركيز 2 × 106 خلية / مل مع الطب الصيني التقليدي.
    2. اغسل الخرز المضاد ل CD3 / CD28 ثلاث مرات باستخدام TCM قبل الزراعة باستخدام الخلايا التائية.
      1. اخلطي القارورة التي تحتوي على الخرز عن طريق الدوران. بعد ذلك ، قم بماصة الحجم المطلوب من الخرز (3: 1 حبة: خلية) (على سبيل المثال ، عند تحفيز 1.0 × 106 خلية من الخلايا التائية ، استخدم 3.0 × 106 من الخرز المضاد ل CD3 / CD28) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم (1.5 مل) وأعد تعليقه في 1 مل من TCM.
    3. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع الخرز على مغناطيس لمدة 1 دقيقة ، وقم بشفط السوبرناتانت. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق الخرز المغسول في 1 مل من TCM. كرر الخطوتين السابقتين لما مجموعه 3 غسلات.
    4. أعد تعليق الخرز في 1 مل من TCM وانقلها إلى الخلايا التائية. ثم ، قم بتخفيف الخلايا التائية إلى تركيز نهائي من 1.0 × 106 خلية / مل مع TCM. انقل تعليق الخلايا التائية / الخرز إلى صفيحة 6 بئر معالجة بالأنسجة وضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  4. معايرة فيروسات lentiviruses (الشكل 2)
    1. تحضير الخلايا التائية لفحص المعايرة بالتحليل الحجمي. تأكد من توفر ما يقرب من 1.0 × 106 خلية لمعايرة نوع واحد من الفيروسات.
    2. تحفيز الخلايا التائية كما هو موضح في القسم 1.3.2.
    3. اللوحة 1.0 × 105 خلايا من الخلايا التائية المحفزة في صفيحة 96 بئرا (لوحة العيار 1) وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة (الشكل 2A). عزل وتحفيز الخلايا التائية كما هو موضح في القسم 1.2.
    4. قم بإعداد لوحة تخفيف (لوحة 96 بئرا) بإضافة 100 ميكرولتر من TCM إلى آبار الأعمدة المعينة وآبار التحكم غير المحولة (الشكل 2B).
    5. قم بإذابة قارورة واحدة من جزيئات الفيروسات اللينتيفيروسية على الجليد وقم بماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتخلط جيدا. نقل 50 ميكرولتر من الخارق للفيروس إلى آبار العمود 6 من صفيحة البئر 96 (التخفيف 3) (الشكل 2B). ماصة لأعلى ولأسفل لتخلط جيدا.
    6. إجراء التخفيفات التسلسلية (التخفيف التسلسلي 2 أضعاف): نقل 50 ميكرولتر من البئر A6 إلى البئر B6 ثم 50 ميكرولتر من البئر B6 إلى البئر C6 ؛ كرر حتى G6. ثم أضف 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى لوحة عيار (الشكل 2B).
    7. احتضن صفيحة العيار عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة ، وحدد النسب المئوية للخلايا الإيجابية CAR أو NIS أو GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2C).
      1. اغسل الآبار عن طريق تدوير لوحة عيار مرتين عند 650 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
      2. قم بتلطيخ الخلايا التائية المحولة كما هو موضح في الخطوات من 1.5.3 إلى 1.5.9.
      3. حدد العيار استنادا إلى النسب المئوية للخلايا الموجبة CAR-أو NIS-أو GFP باستخدام الصيغة (1):
        العيار = النسبة المئوية للخلايا التائية BCMA-CAR+ أو NIS+ × عدد الخلايا التائية عند النقل × التخفيف / الحجم المحدد (1)
  5. نقل فيروسات lentivirus و NIS+توسع الخلايا التائية BCMA-CAR
    1. بعد أربعة وعشرين إلى 48 ساعة من تحفيز الخلايا التائية ، قم بإجراء نقل فيروسي على الخلايا التائية المحفزة (يجب أن تشكل الخلايا التائية مجموعات).
      1. قم بإذابة فيروسات lentiviruses المجمدة التي تشفر CAR أو NIS عند 4 درجات مئوية.
      2. امزج الخلايا التائية المحفزة جيدا لتفتيت العناقيد ، وأضف ببساطة فيروسا مذابا حديثا عند تعدد العدوى (MOI) من 5.0 (عند تحويل 1.0 × 106 خلايا T ، استخدم 5.0 × 106 من lentivirons). احتضان الخلايا المحولة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2.
      3. في الأيام 3 و 4 و 5 ، عد الخلايا التائية المحولة باستخدام مقياس خلايا الدم 37 أو عداد الخلايا الآلي بالكامل 38 واضبط تركيز الخلية على 1.0 × 106 خلية / مل عن طريق إضافة TCM طازج ودافئ مسبقا. بالنسبة للخلايا التائية المحولة من NIS والتي تحمل جين مقاومة البيروميسين ، عالج الخلايا ب 1 ميكروغرام / مل من ثنائي هيدروكلوريد البيروميسين في الأيام 3 و 4 و 5.
    2. في اليوم 6 ، قم بإزالة الخرز المضاد ل CD3 / CD28 من الخلايا التائية المحولة (من الخطوة 1.3.4) عن طريق الخلط جيدا لتفتيت مجموعات الخلايا التائية ووضعها في مغناطيس لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، ما عليك سوى وضع الخلايا التائية المحولة التي تم جمعها مرة أخرى في الثقافة بتركيز 1.0 × 106 خلية / مل. بعد إزالة الخرز من الخلايا التائية ، قم بتقييم التعبير عن CAR و NIS عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: نظرا لأن الجزء المتغير أحادي السلسلة من BCMA-CAR مشتق من الماوس ، فيمكن تلطيخه بالماعز المضاد للماوس IgG (H + L) المقترن ب Alexa Fluor 647. يمكن الكشف عن NIS باستخدام ETNL المضاد للإنسان [الببتيد الاصطناعي المقابل ل aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. يتعرف هذا الجسم المضاد على المحطة C الخلوية ل NIS. لذلك ، يجب اختراق الخلايا التائية قبل الحضانة بجسم مضاد مضاد ل NIS مضاد للإنسان.
    3. قم بإجراء تلطيخ سطح BCMA-CAR باستخدام الماعز المضاد للماوس IgG (H + L).
      1. خذ أليكوت من الثقافة (على سبيل المثال ، 50000 خلية تائية) واغسلها باستخدام مخزن مؤقت للتدفق (PBS ، 1٪ FBS ، و 1٪ أزيد الصوديوم). بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وقم بتلطيخ الخلايا ب 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للفئران للكشف عن تعبير CAR و 0.3 ميكرولتر من الأحياء المائية الميتة لاستبعاد الخلايا الميتة.
      2. احتضن لمدة 15 دقيقة في الظلام في RT ، واغسل الخلايا بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وطرد الخلايا مركزيا عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. بعد تلطيخ CAR السطحي ، قم بإصلاح الخلايا وتغلغلها عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من وسط التثبيت (PBS مع 4.21٪ من الفورمالديهايد) واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على عامل نفاذ للخلايا مثل الصابونين (650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية).
    5. أعد تعليق الخلايا الثابتة/المتخلل في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتقطع. ثم ، أضف 0.3 نانوغرام من الأجسام المضادة المضادة ل ETNL NIS المضادة للإنسان في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق واحتضنها لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    6. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتضن الخلايا ب 2.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب في 50 ميكرولتر من مخزن التدفق المؤقت لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، واغسل الخلايا بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. وأخيرا، أعد التعليق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتحديد كفاءة النقل (الشكل 3A، B).
    8. في اليوم 8 ، عد الخلايا التائية وقم بتدويرها عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا التائية ذات الوسط المتجمد (90٪ FBS + 10٪ dimethylsulfoxide [DMSO]) بتركيز 10 × 106 / مل ، ثم انقل 1 مل لكل منها إلى الكريوفيالات الموسومة.
    9. ضع القوارير في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة (وبحلول اليوم 10) ، انقل الخلايا التائية إلى النيتروجين السائل.
      ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على إنتاج الخلايا التائية NIS+ CAR. يمثل الشكل 3D أمثلة على توسع الخلايا التائية خارج الجسم الحي من ثلاثة متبرعين مختلفين.

2. NIS+ BCMA-CAR T CELL IMAGING مع [ 18F] TFB-PET scan

ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة Mayo Clinic المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC A00001767-16) وIRB وIBC (Bios00000006.04). OPM-2 هو خط خلية BCMA+ MM ، والذي يستخدم غالبا كخط خلية مستهدف لخلايا BCMA-CAR T 39,40.

  1. إنشاء خلايا luciferase + BCMA + OPM-2.
    1. زرع 500,000 خلية OPM-2 في صفيحة 24 بئر معالجة بزراعة الأنسجة. إذابة فيروس lentivirus ترميز luciferase-GFP عند 4 درجات مئوية.
    2. أضف الفيروس المذاب حديثا في MOI من 3.0 إلى خلايا OPM-2 واخلطه جيدا عن طريق السحب. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
    3. بعد ثمان وأربعين ساعة من النقل ، أضف 2 ميكروغرام / مل من البيروميسين لتحديد الخلايا المحولة. بعد أربعة أيام من النقل ، قم بتقييم الخلايا الإيجابية GFP (لوسيفيراز إيجابية) عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 3E).
  2. إنشاء نماذج الماوس BCMA + OPM-2 xenograft (الشكل 4).
    1. عد خلايا luciferase + OPM-2 وقم بتدويرها لأسفل مرتين لإزالة جميع وسائط زراعة الخلايا. أعد تعليق خلايا OPM-2 بتركيز 10 × 106 خلية / مل باستخدام PBS.
    2. في اليوم -21 ، حقن 100 ميكرولتر (1.0 × 106 خلايا) من خلايا luciferase + OPM-2 في ذيول الفئران NOD-scid IL2rγnull (NSG) التي تعاني من نقص المناعة من 8 إلى 12 أسبوعا (الشكل 4).
    3. في اليوم 20 بعد حقن الخلايا OPM-2 (اليوم -1 من حقن الخلايا التائية CAR) ، تحقق من عبء الورم عن طريق تصوير التلألؤ الحيوي (BLI) (الشكل 4).
      ملاحظة: تشكل خلايا OPM-2 ورما بطيئا النمو ، والذي يستغرق عادة 2-3 أسابيع للتطعيم.
    4. إدارة 10 ميكرولتر / غرام من D-luciferin إلى الفئران xenograft OPM-2 عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP). بعد 10 دقائق ، قم بإجراء BLI على الفئران تحت 2٪ من غاز الأيزوفلوران (الشكل 5A). بعد التأكد من تطعيم الورم ، قم بتوزيع الفئران عشوائيا وفقا لعبء الورم.
    5. في اليوم -1 من حقن الخلايا التائية CAR ، قم بإذابة الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR ، وإزالة وسط التجميد عن طريق الطرد المركزي (300 × جم ، 8 دقائق ، 4 درجات مئوية). ثم ، تقوم الخلايا بإعادة تعليق الخلايا مع TCM عند 2.0 × 106 خلية / مل وتحضن بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
    6. في اليوم 0 ، عد وطرد مركزي الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR (300 × جم ، 8 دقائق ، 4 درجات مئوية). أعد تعليق الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR عند 50 × 106 خلايا/مل باستخدام PBS.
    7. إدارة 100 ميكرولتر (5.0 × 106 خلايا) من الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR عن طريق حقن الوريد الذيل إلى الفئران XENOGRAFT OPM-2. في اليومين 7 و 15 ، صور الفئران باستخدام فحص PET.
  3. NIS+BCMA-CAR T Cell في الجسم الحي التصوير باستخدام نموذج الماوس xenograft BCMA+OPM-2.
    1. قم بوزن الفئران قبل التصوير ، وقم بإزالة أي علامات أذن معدنية للقضاء على القطع الأثرية المتعلقة بالمعادن.
    2. إعداد [18F] TFB كما هو موضح سابقا41.
      ملاحظة: [18F] يجب إنتاج TFB في يوم استخدامه. يجب أن يكون النقاء الكيميائي الإشعاعي >99٪ والنشاط المولي >5 جيجابايت/مليمول.
    3. حقن 9.25 ميجا بايت في الساعة [18F] TFB عن طريق الوريد عن طريق حقن الوريد الذيلي. اسمح بفترة امتصاص ~ 40 دقيقة لتوزيع المقتفي الإشعاعي في الجسم ومسح الدم.
    4. تخدير الفأر باستخدام استنشاق الأيزوفلوران (2٪).
      ملاحظة: Isoflurane هو المخدر المستنشق المفضل لأنه يحتوي على بداية سريعة وموثوقة وتعافي.
    5. قبل تخدير الماوس ، قم بتنظيف جميع أسطح آلة التخدير باستخدام منظفات مطهرة.
    6. ضع الماوس داخل غرفة الحث. أدر قرص المبخر إلى 2٪ وانتظر حتى يصبح الماوس راقدا وغير مستجيب في غضون 1-2 دقيقة.
    7. راقب الماوس لتجنب التخدير غير الكافي أو الاكتئاب المفرط لوظائف الجهاز التنفسي. باختصار ، قرصة إصبع القدم لتأكيد التخدير غير الكافي.
      ملاحظة: معدل التنفس الطبيعي يصل إلى 180 / دقيقة ، ومعدل الانخفاض المقبول هو 50٪.
    8. ضع مرهم العيون لتجنب تجفيف القرنية والصدمات.
    9. احصل على صور PET/CT بعد 45 دقيقة من الحقن باستخدام الماوس المخدر في محطة عمل تصوير PET/CT صغيرة (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، احصل على صور PET ثابتة لمدة 15 دقيقة متبوعة بالحصول على صور CT لمدة 5 دقائق مع دوران 360 درجة و 180 إسقاطا عند 500 μA و 80 keV و 200 مللي ثانية.
  4. تحليل بيانات التصوير المكتسبة
    1. تحليل الصور باستخدام برنامج معالجة الصور PET (الشكل 5B والفيديو التكميلي S1).
    2. تحديد حجم الفائدة (VOI).
    3. احسب قيمة الامتصاص الموحدة (SUV) باستخدام الصيغة (2).
      SUV في VOI = تركيز النشاط في VOI (MBq / mL) × وزن الجسم (g) / الجرعة المدارة (MBq) (2)
  5. تأكيد تهريب الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR إلى مواقع الأورام باستخدام قياس التدفق الخلوي
    1. بعد تصوير [18F] TFB-PET ، ضع الماوس مرة أخرى في القفص. بعد التوقف عن التخدير ، راقب الحيوانات حتى تصبح قادرة على الحركة الهادفة وتأكد من حصولها على الطعام والماء.
    2. راقب الفئران حتى اضمحلال الحقن [18F] TFB. بمجرد عدم إمكانية اكتشاف النظائر المشعة ، قم بالقتل الرحيم للفئران باستخدام CO2.
    3. للقتل الرحيم ، ضع الفئران في القفص (لا يزيد عن 5 فئران لكل قفص).
    4. تعريض الفئران ل CO2 حتى التوقف التام عن التنفس في حوالي 5-10 دقائق.
      ملاحظة: يجب أن تكون طريقة القتل الرحيم هذه متسقة مع إرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات (طبعة 2020).
    5. لضمان وفاة الفئران ، قم بإجراء خلع عنق الرحم عن طريق الإمساك بالجزء الخلفي من الرأس وقاعدة ذيل الحيوان ، ثم سحب اليدين بعيدا / بعيدا عن بعضهما البعض.
    6. حصاد نخاع العظم للتأكد من أن الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR تنتقل بكفاءة إلى موقع الورم.
    7. انقل عظم الفخذ والساق المحصود إلى صفيحة من 6 آبار تحتوي على 5 مل من وسط زراعة الخلايا. قم بإزالة العضلات والأوتار من عظم الفخذ والساق ، وببساطة قم بقطع كلا الطرفين (فوق المفاصل) من عظم الفخذ والساق.
    8. املأ حقنة الأنسولين بوسط زراعة الخلايا ، واغسل نخاع العظم على صفيحة 6 آبار. بالنسبة لعظم الفخذ ، استخدم إبر 22 جم ومحاقن 5 مل لأن قطر عظم الفخذ أكبر من قطر الساق.
    9. استخدم الطرف المسطح من المكبس لطحن نخاع العظام. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ، وقم بتصفية نخاع العظم الأرضي. ثم ، املأ الأنبوب بمخزن التدفق المؤقت ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. شفط supernatant ، وإعادة تعليق نخاع العظم مع 5 مل من المخزن المؤقت للتدفق. انقل 200 ميكرولتر من نخاع العظم إلى صفيحة 96 بئرا. قم بطرد الجهاز المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بصب السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق.
    11. وصمة عار نخاع العظم مع تدفق الأجسام المضادة ضد 0.25 ميكروغرام من الفأر CD45 ، 0.03 ميكروغرام من CD45 البشري ، 0.06 ميكروغرام من CD3 البشري ، 0.24 ميكروغرام من BCMA البشري ، و 0.3 ميكرولتر من أكوا الحية / الميتة. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    12. الطرد المركزي للصفيحة عند 300 × غرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وقم بتشغيله على مقياس التدفق الخلوي (الشكل 5C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمثل الشكل 1 خطوات توليد الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR. في اليوم 0 ، اعزل PBMCs ثم اعزل الخلايا التائية عن طريق الاختيار السلبي. ثم ، قم بتحفيز الخلايا التائية باستخدام حبات مضادة ل CD3 / CD28. في اليوم 1 ، قم بتحويل الخلايا التائية مع كل من NIS و BCMA-CAR lentiviruses. في الأيام 3 و 4 و 5 ، عد الخلاي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصف هذه الورقة منهجية لدمج NIS في الخلايا التائية CAR وتصوير الخلايا التائية CAR المشبعة في الجسم الحي من خلال [18F]TFB-PET. كدليل على المفهوم ، تم إنشاء الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR عبر النقل المزدوج. لقد أبلغنا مؤخرا أن دمج NIS في الخلايا التائية CAR لا يضعف وظائف الخلايا التائية CAR وفعالي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

SSK هي مخترعة براءات اختراع في العلاج المناعي CAR مرخصة لشركة Novartis (من خلال اتفاقية بين Mayo Clinic وجامعة بنسلفانيا ونوفارتيس) وMettaforge (من خلال Mayo Clinic). RS و MJC و SSK هم مخترعون على براءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة ل Humanigen. تتلقى SSK تمويلا بحثيا من Kite و Gilead و Juno و Celgene و Novartis و Humanigen و MorphoSys و Tolero و Sunesis و Leahlabs و Lentigen. تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال خط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ومؤسسة بريدولين (RS). تم إنشاء الأشكال 1 و 2 و 4 باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973(2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064(2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209(2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180 CAR T cell NIS 18F TFB PET

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved