Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Özet

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Özet

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücreleri, B hücreli maligniteleri veya multipl miyelom (MM) olan hastalar için önemli klinik çalışmalarda benzeri görülmemiş sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, çok sayıda engel etkinliği sınırlamakta ve CAR T hücre tedavilerinin yaygın kullanımını, tümör bölgelerine kötü kaçakçılık ve infiltrasyonun yanı sıra in vivo kalıcılık eksikliği nedeniyle yasaklamaktadır. Ayrıca, sitokin salınım sendromu veya nörotoksisite gibi hayatı tehdit eden toksisiteler önemli endişelerdir. CAR T hücrelerinin verimli ve hassas görüntülenmesi ve izlenmesi, T hücresi kaçakçılığının, genişlemesinin ve in vivo karakterizasyonunun değerlendirilmesini sağlar ve CAR T hücre tedavisinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu yazıda sodyum iyodür sempatizanının (NIS) CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve preklinik modellerde [^18F]tetrafloroborat-pozitron emisyon tomografisi ([^18F]TFB-PET) kullanılarak CAR T hücre görüntülemesi için metodoloji anlatılmaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışmada kullanılanlara ek olarak diğer CAR yapılarına ve hedef genlere uygulanabilir.

Giriş

Kimerik antijen reseptörü T (CAR T) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde hızla ortaya çıkan ve potansiyel olarak küratif bir yaklaşımdır1,2,3,4,5,6. CD19 yönelimli CAR T (CART19) veya B hücre olgunlaşma antijeni (BCMA) CAR T hücre tedavisinden sonra olağanüstü klinik sonuçlar ^{bildirilmiştir2}. Bu, agresif B hücreli lenfoma (aksikabagen ciloleucel (Axi-Cel)⁴, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)³ ve lisocab....

Protokol

Protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini takip etmektedir.

1. NIS ⁺ BCMA-CAR T hücre üretimi

NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB 17-008762) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.

1. BCMA-CAR, NIS ve lusiferaz-yeşil floresan protein (GFP) kodlayan lentivirüslerin üretimi.
   NOT: İkinci nesil BCMA-CAR yapısı de novo olarak sentezlendi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir uzama fak....

Sonuçlar

Şekil 1 , NIS + BCMA ^- CAR T hücreleri oluşturma adımlarını göstermektedir. 0. günde, PBMC'leri izole edin ve ardından negatif seleksiyonla T hücrelerini izole edin. Daha sonra, T hücrelerini anti-CD3 / CD28 boncuklarla uyarın. 1. günde, T hücrelerini hem NIS hem de BCMA-CAR lentivirüsleri ile dönüştürün. 3, 4 ve 5. günlerde, T hücrelerini sayın ve konsantrasyonu 1.0 × ¹⁰⁶ / mL olarak ayarlamak için medya ile besleyin. NIS ile dönüştürülmü.......

Tartışmalar

Bu yazıda NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve [^18F]TFB-PET aracılığıyla infüze edilmiş CAR T hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kavramın kanıtı olarak, NIS ⁺ BCMA-CAR T hücreleri çift iletim yoluyla üretildi. Son zamanlarda, NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesinin CAR T hücresi fonksiyonlarını ve etkinliğini in vivo olarak bozmadığını ve CAR T hücresi kaçakçılığına ve ^{genişlemes.......}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 Gauge needle	Covidien	8881250206
28 gauge insulin syringe	BD	329461
96 well plate	Corning	3595
Anti-human (ETNL) NIS	Imanis	REA009	ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7	BioLegend	357507	Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421	BioLegend	304032	Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7	BioLegend	103116	Flow antibody
Anti-rabbit IgG	R&D	F0110	Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation	IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5	Beckman Coulter	C04652	flow cytometer
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips	BD	309646
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)	Gibco	14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951	negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner	Siemens Medical Solutions USA, Inc.	10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid	Piramal Critical Care	66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System	PerkinElmer	CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile	Thermo Scientific	450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile	Thermo Scientific	450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson laboratory	05557
OPM-2	DSMZ	CRL-3273	multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)	Addgene	80389	lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
PMOD software	PMOD	PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived	Innovative Research	IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)	Gibco	21870-076
SepMate-50 (IVD)	STEMCELL Technologies	85450	density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
T175 flask	Corning	353112
Terrell (isoflurane, USP)	Piramal Critical Care Inc	66794-019-10
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q