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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Zusammenfassung

T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um chimäre Antigenrezeptoren (CAR) zu exprimieren, haben in zulassungsrelevanten klinischen Studien für Patienten mit B-Zell-Malignomen oder multiplem Myelom (MM) beispiellose Ergebnisse gezeigt. Zahlreiche Hindernisse schränken jedoch die Wirksamkeit ein und verbieten den weit verbreiteten Einsatz von CAR-T-Zelltherapien aufgrund des schlechten Handels und der Infiltration in Tumorstellen sowie der mangelnden Persistenz in vivo. Darüber hinaus sind lebensbedrohliche Toxizitäten wie das Zytokinfreisetzungssyndrom oder die Neurotoxizität ein großes Problem. Effiziente und empfindliche Bildgebung und Verfolgung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung des Transports, der Expansion und der In-vivo-Charakterisierung von T-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zelltherapie. Dieses Papier beschreibt die Methodik für den Einbau des Natriumiodid-Symporters (NIS) in CAR-T-Zellen und für die CAR-T-Zellbildgebung mittels [18F]tetrafluoroborat-Positronen-Emissionstomographie ([18F]TFB-PET) in präklinischen Modellen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können zusätzlich zu den für diese Studie verwendeten auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden.

Einleitung

Die Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Zelltherapie ist ein sich schnell entwickelnder und potenziell heilender Ansatz bei hämatologischen Malignomen1,2,3,4,5,6. Außergewöhnliche klinische Ergebnisse wurden nach CD19-gerichteter CAR T (CART19) oder B-Zellreifungsantigen (BCMA) CAR T-Zelltherapie2 berichtet. Dies führte zur Zulassung von CART19-Zellen für aggressive B-Zell-Lymphome (Axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, Tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 und Lisocabtagene maraleucel)7, akute lymphatische Leukämie (Tisa-Cel)5,8, Mantelzelllymphom (brexucabtagene autoleuce)9 und follikuläres Lymphom (Axi-Cel)10 . Zuletzt genehmigte die FDA die BCMA-gerichtete CAR-T-Zelltherapie bei Patienten mit multiplem Myelom (MM) (Idecabtagen-Vikleucel)11. Darüber hinaus befindet sich die CAR-T-Zelltherapie bei chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) in der späten klinischen Entwicklung und wird voraussichtlich innerhalb der nächsten drei Jahre die FDA-Zulassung erhalten1.

Trotz der beispiellosen Ergebnisse der CAR-T-Zelltherapie ist ihre weit verbreitete Anwendung begrenzt durch 1) unzureichende In-vivo-CAR-T-Zellexpansion oder schlechten Transport zu Tumorstellen, was zu niedrigeren Raten dauerhafter Reaktion führt12,13 und 2) die Entwicklung lebensbedrohlicher unerwünschter Ereignisse, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms (CRS)14,15 . Zu den Kennzeichen von CRS gehören nicht nur die Immunaktivierung, die zu erhöhten Spiegeln von entzündlichen Zytokinen / Chemokinen führt, sondern auch eine massive T-Zell-Proliferation nach CAR-T-Zell-Infusion15,16. Daher würde die Entwicklung einer validierten, klinischen Strategie zur Abbildung von CAR-T-Zellen in vivo 1) CAR-T-Zell-Tracking in Echtzeit in vivo ermöglichen , um ihren Transport zu Tumorstellen zu überwachen und potenzielle Resistenzmechanismen aufzudecken, und 2) die Überwachung der CAR-T-Zellexpansion und möglicherweise die Vorhersage ihrer Toxizitäten wie die Entwicklung von CRS.

Klinische Merkmale von leichtem CRS sind hohes Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Durchfall, Arthralgie, Myalgie und Unwohlsein. Bei schwererem CRS können Patienten Tachykardie/Hypotonie, Kapillarleck, Herzfunktionsstörungen, Nieren- / Leberversagen und eine disseminierte intravaskuläre Koagulation entwickeln17,18. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass der Grad der Erhöhung von Zytokinen, einschließlich Interferon-gamma, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Interleukin (IL)-10 und IL-6, mit der Schwere der klinischen Symptome korreliert17,19. Die umfangreiche Anwendung der "Echtzeit" -Serumzytokinüberwachung zur Vorhersage von CRS ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit schwierig. Um die vorteilhaften Eigenschaften der CAR-T-Zelltherapie zu nutzen, kann die nicht-invasive Bildgebung von adoptiven T-Zellen potenziell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität und den Rückfall nach der CAR-T-Zellinfusion vorherzusagen.

Mehrere Forscher haben Strategien entwickelt, um radionuklidbasierte Bildgebung mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) zu verwenden, die eine hohe Auflösung und hohe Empfindlichkeit bietet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 für die In-vivo-Visualisierung und Monitoring des CAR-T-Zell-Handels. Unter diesen Radionuklid-basierten Bildgebungsstrategien wurde der Natriumiodid-Symporter (NIS) als empfindliche Modalität zur Abbildung von Zellen und Viren mithilfe von PET-Scans entwickelt31,32. Die NIS+CAR-T-Zellbildgebung mit [18F]TFB-PET ist eine empfindliche, effiziente und praktische Technologie zur Beurteilung und Diagnose der Ausdehnung, des Handels und der Toxizität von CAR-T-Zellen30. Dieses Protokoll beschreibt 1) die Entwicklung von NIS+CAR T-Zellen durch duale Transduktion mit hoher Wirksamkeit und 2) eine Methodik zur Bildgebung von NIS+CAR T-Zellen mit [18F]TFB-PET-Scan. BCMA-CAR-T-Zellen für MM werden als Proof-of-Concept-Modell verwendet, um NIS als Reporter für CAR-T-Zell-Imaging zu beschreiben. Diese Methoden können jedoch auf jede andere CAR-T-Zelltherapie angewendet werden.

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Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board der Imsengco Clinic, des Institutional Biosafety Committee und des Institutional Animal Care and Use Committee der Imsengco Clinic.

1. NIS+ BCMA-CAR T-Zell-Produktion

HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB 17-008762) und des Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04) der Mayo Clinic.

  1. Produktion von BCMA-CAR, NIS und Luciferase-grün fluoreszierendem Protein (GFP)-kodierenden Lentiviren.
    HINWEIS: Ein BCMA-CAR-Konstrukt der zweiten Generation wurde de novo synthetisiert (siehe Tabelle der Materialien) und unter der Kontrolle eines Dehnungsfaktor-1-alpha (EF-1α)-Promotors zu einem lentiviralen Vektor der dritten Generation geklont. Das BCMA-CAR-Konstrukt (C11D5.3-41BBz) umfasste eine 4-1BB-Kostimulation und ein einkettiges variables Fragment (scFv), das von einem antihumanen BCMA-Antikörperklon C11D5.333,34 abgeleitet wurde. Das NIS steht unter der Kontrolle des EF-1α-Promotors und bindet über selbstspaltende Peptide (P2A) an das Puromycin-Resistenzgen. Der lentivirale Vektor, der für Luciferase-GFP kodiert (siehe Materialtabelle), wird verwendet, um Tumorzellen zu transduzieren, die dann GFP und Luciferase exprimieren.
    1. Herstellung von lentiviralen Vektorplasmiden: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) und pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      HINWEIS: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro und pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro enthalten das Puromycin-Resistenzgen. Daher können NIS- oder Luciferase-GFP-transduzierte Zellen mit 1 μg/ml oder 2 μg/ml Puromycindihydrochlorid ausgewählt werden, wie zuvor beschrieben14,35.
    2. Samen Sie 20 × 106 von 293T-Zellen in einem T175-Kolben und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C mit 5% CO2. Bestätigen Sie, dass 293T-Zellen gleichmäßig auf dem Kolben mit 70-90% Konfluenz verteilt sind, indem Sie sie direkt unter dem Mikroskop visualisieren.
    3. Bereiten Sie eine Mastermischung aus 15 μg des Expressionsvektors (z. B. CAR, NIS oder lineare Luciferase-GFP-DNA), 7 μg des Hüllkurvenvektors (VSV-G) und 18 μg des Verpackungsvektors (Gag, Pol, Rev und Tat) vor. Verdünnen Sie die DNA-Mastermischung in 4,5 ml des Transfektionsmediums und fügen Sie dann 111 μL des präkomplexierenden Reagenzes (Mischung A) hinzu.
    4. Bereiten Sie ein neues Röhrchen vor und verdünnen Sie 129 μL des liposomalen Transfektionsreagenzes in 4,5 ml des Transfektionsmediums (Mischung B).
    5. Kombinieren Sie die Mischungen A und B und streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen. 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    6. Nach der Inkubation einfach den Zellüberstand aspirieren, ohne die Zellen zu lösen, und 16 ml eines Wachstumsmediums hinzufügen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin enthält. Dann fügen Sie die Mischung der Mischungen A und B auf 293T-Zellen tropfenweise hinzu. Zum Schluss inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 24 h.
    7. An den Tagen 1 und 2 nach der Transfektion den Überstand von 293T ernten, bei 900 × g für 10 min nach unten drehen und durch einen 0,45 μm Nylonfilter filtern. Das Filtrat wird bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei 112.700 × g für 2 h konzentriert und bei -80 °C eingefroren.
  2. Ex-vivo T-Zell-Isolierung (Abbildung 1)
    HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturarbeiten in einem Laminar-Flow-Schrank mit aseptischer Technik und persönlicher Schutzausrüstung durch. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden aus gesundem freiwilligem Spenderblut gewonnen, das während der Apherese gesammelt wurde36. Das Pathogen-Screening wurde an menschlichen Zellen durchgeführt, die in dieser Studie verwendet wurden.
    1. Verwenden Sie die Standard-Dichtegradiententechnik, um PBMCs zu isolieren.
      1. Vorsichtig 15 ml Dichtegradientenmedium (Dichte von 1,077 g/ml) (enthaltend alpha-D-glucopyranosid, beta-D-Fructofuranosylhomopolymer und 3-(Acetylamino)-5-(Acetylmethylamino)-2,4,6-Triodobenzoesäuremononatriumsalz) zu einem 50 ml Dichtegradiententrennrohr hinzufügen, ohne Luftblasen zu erzeugen (siehe Materialtabelle).
      2. Um Zellfänge zu vermeiden, verdünnen Sie die Blutprobe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,2 g / L Kaliumchlorid, 0,2 g / L Kaliumphosphat monobasisch, 8 g / L Natriumchlorid und 1,15 g / L Natriumphosphat dibasisch), die 2% FBS bei einem Volumenverhältnis von 1: 1 enthält. Übertragen Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium, ohne die Grenzfläche zwischen den beiden zu unterbrechen. Drehen Sie sich bei 1.200 × g für 10 Minuten bei RT ab.
        HINWEIS: Ein 50 ml Dichtegradiententrennrohr kann zur Isolierung von 4-17 ml einer Blutprobe verwendet werden. Das in diesem Protokoll verwendete 50-ml-Dichtegradiententrennrohr (siehe Materialtabelle) erfordert keine "Bremse aus" während der Zentrifugation. Wenn jedoch Standard-50-ml-Schläuche verwendet werden, muss die Bremse ausgeschaltet sein und erfordert eine 30-minütige Zentrifugation.
      3. Übertragen Sie den Überstand in ein neues konisches 50-ml-Rohr, waschen Sie es mit PBS + 2% FBS, indem Sie bis zu 50 ml füllen, und drehen Sie es dann bei 300 × g für 8 Minuten bei RT nach unten.
      4. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die pelletierten Zellen in 50 ml PBS + 2% FBS. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und drehen Sie dann bei 300 × g für 8 Minuten bei RT nach unten. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für insgesamt 2 Wäschen.
    2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen auf eine Konzentration von 50 × 106 Zellen / ml mit PBS + 2% FBS.
    3. Führen Sie eine T-Zell-Isolierung von PBMCs mit einem Magnetperlen-Kit mit negativer Auswahl durch.
      HINWEIS: Ein ideales negatives Auswahlkit enthält magnetische Perlen, die an Antikörper gegen Antigene gebunden sind, die auf anderen Zellen als T-Zellen exprimiert werden. Ein häufig verwendetes Kit enthält Antikörper, die an magnetische Perlen gegen CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 und CD16 konjugiert sind (siehe Materialtabelle).
      1. Übertragen Sie PBMCs in ein 14 ml Polystyrol-Rundbodenrohr. Legen Sie dann die PBMCs und den Antikörpercocktail mit negativer Selektion in einen vollautomatischen Zellseparator und führen Sie eine T-Zell-Isolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
  3. T-Zell-Stimulation und T-Zell-Expansion (Abbildung 1)
    1. Um die isolierten T-Zellen zu kultivieren, bereiten Sie T-Zell-Expansionsmedium (TCM) vor, das mit serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium hergestellt wird, ergänzt mit 10% menschlichem Serumalbumin und 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin14. Nach der T-Zell-Isolierung zählen Sie die Zellen und die Kultur in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml mit TCM.
    2. Waschen Sie Anti-CD3/CD28-Perlen dreimal mit TCM, bevor Sie mit T-Zellen kultivieren.
      1. Mischen Sie die Durchstechflasche mit den Perlen durch Wirbeln. Dann pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Perlen (3:1 Perlen:Zelle) (z. B. wenn Sie 1,0 × 106 Zellen von T-Zellen stimulieren, verwenden Sie 3,0 × 106 Anti-CD3/CD28-Perlen) in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) und resuspendieren Sie in 1 ml TCM.
    3. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit den Perlen für 1 min auf einen Magneten und saugen Sie den Überstand ab. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in 1 ml TCM. Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte für insgesamt 3 Wäschen.
    4. Suspendieren Sie die Perlen in 1 ml TCM und übertragen Sie sie auf die T-Zellen. Dann verdünnen Sie die T-Zellen auf eine Endkonzentration von 1,0 × 106 Zellen / ml mit TCM. Übertragen Sie die T-Zell-/Perlensuspension auf eine gewebekulturbehandelte 6-Well-Platte und legen Sie sie in den Inkubator (37 °C, 5% CO2).
  4. Titration von Lentiviren (Abbildung 2)
    1. Bereiten Sie T-Zellen für den Titrationsassay vor. Stellen Sie sicher, dass etwa 1,0 x 106 Zellen verfügbar sind, um einen Virustyp zu titrieren.
    2. Stimulieren Sie T-Zellen wie in Abschnitt 1.3.2 beschrieben.
    3. Platte 1,0 × 105 Zellen stimulierter T-Zellen in einer 96-Well-Platte (Titerplatte) und inkubieren bei 37 °C, 5% CO2 für 24 h (Abbildung 2A). Isolieren und stimulieren Sie die T-Zellen wie in Abschnitt 1.2 beschrieben.
    4. Bereiten Sie eine Verdünnungsplatte (96-Well-Platte) vor, indem Sie 100 μL TCM in die Vertiefungen der vorgesehenen Säulen und die nicht transduzierten Kontrollvertiefungen geben (Abbildung 2B).
    5. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit lentiviralen Partikeln auf Eis auf und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um sie gut zu mischen. Übertragen Sie 50 μL des Virusüberstands in die Vertiefungen der Spalte 6 der 96-Well-Platte (Verdünnung 3) (Abbildung 2B). Pipette auf und ab, um gut zu mischen.
    6. Führen Sie serielle Verdünnungen durch (2-fache serielle Verdünnung): Übertragen Sie 50 μL von Bohrloch A6 auf Bohrloch B6 und dann 50 μL von Bohrloch B6 auf Bohrloch C6; Wiederholen Sie den Vorgang bis G6. Fügen Sie dann 50 μL des verdünnten Virus zur Titerplatte hinzu (Abbildung 2B).
    7. Inkubieren Sie die Titerplatte bei 37 °C, 5% CO2 für 48 h und bestimmen Sie die Prozentsätze der CAR-, NIS- oder GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2C).
      1. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie die Titerplatte zweimal bei 650 × g bei 4 °C für 3 min nach unten drehen.
      2. Färben Sie die transduzierten T-Zellen wie in den Schritten 1.5.3 bis 1.5.9 beschrieben.
      3. Bestimmen Sie die Titer basierend auf den Prozentsätzen der CAR-, NIS- oder GFP-positiven Zellen mit der Formel (1):
        Titer = Prozentsatz der BCMA-CAR+ oder NIS+ T-Zellen × T-Zellzahl bei Transduktion × die spezifische Verdünnung / das spezifische Volumen (1)
  5. Transduktion von Lentiviren und NIS+BCMA-CAR T-Zell-Expansion
    1. Vierundzwanzig bis 48 h nach der T-Zellstimulation führen Sie eine lentivirale Transduktion an stimulierten T-Zellen durch (T-Zellen sollten Cluster bilden).
      1. Tauen Sie die gefrorenen Lentiviren, die CAR oder NIS kodieren, bei 4 °C auf.
      2. Mischen Sie die stimulierten T-Zellen gut, um die Cluster aufzubrechen, und fügen Sie einfach frisch aufgetaute Viren bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 5,0 hinzu (verwenden Sie beim Transduzieren von 1,0 × 106 T-Zellen 5,0 × 106 Lentiveisen). Inkubieren Sie die transduzierten Zellen bei 37 °C, 5% CO2.
      3. Zählen Sie an den Tagen 3, 4 und 5 die transduzierten T-Zellen mit einem Hämatoktometer37 oder einem vollautomatischen Zellzähler38 und passen Sie die Zellkonzentration durch Zugabe von frischem, vorgewärmtem TCM auf 1,0 × 106 Zellen/ml an. Für NIS-transduzierte T-Zellen, die das Puromycin-Resistenzgen tragen, behandeln Sie die Zellen an den Tagen 3, 4 und 5 mit 1 μg/ml Puromycindihydrochlorid.
    2. Entfernen Sie an Tag 6 die Anti-CD3/CD28-Perlen von den transduzierten T-Zellen (aus Schritt 1.3.4), indem Sie gut mischen, um die T-Zell-Cluster aufzubrechen und sie für 1 min in einen Magneten zu legen. Dann legen Sie einfach die gesammelten transduzierten T-Zellen in einer Konzentration von 1,0 × 106 Zellen / ml wieder in Kultur. Nachdem Sie die Kügelchen aus den T-Zellen entfernt haben, beurteilen Sie die Expression von CAR und NIS durch Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: Da das einkettige variable Fragment des BCMA-CAR von der Maus abgeleitet ist, kann es mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) gefärbt, das mit Alexa Fluor 647 konjugiert ist. NIS kann mit anti-humanem ETNL [synthetisches Peptid entsprechend aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)] nachgewiesen werden. Dieser Antikörper erkennt den zytosolischen C-Terminus von NIS. Daher müssen T-Zellen vor der Inkubation mit einem antihumanen NIS-Antikörper permeabilisiert werden.
    3. Führen Sie eine Oberflächenfärbung von BCMA-CAR mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) durch.
      1. Nehmen Sie ein Aliquot der Kultur (z. B. 50.000 T-Zellen) und waschen Sie es mit einem Durchflusspuffer (PBS, 1% FBS und 1% Natriumazid). Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μL Flusspuffer und färben Sie die Zellen mit 1 μL Ziegen-Anti-Maus-Antikörper zum Nachweis der CAR-Expression und 0,3 μL lebendem totem Aqua zum Ausschluss toter Zellen.
      2. 15 min im Dunkeln bei RT inkubieren, die Zellen mit 150 μL Durchflusspuffer waschen und die Zellen bei 650 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren.
    4. Nach der Oberflächen-CAR-Färbung fixieren und durchpermeabilisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μL Fixationsmedium (PBS mit 4,21% Formaldehyd) und inkubieren Sie für 20 min bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 μL eines Puffers, der ein Zellpermeabilisierungsmittel wie Saponin enthält (650 × g für 3 min bei 4 °C).
    5. Resuspendieren Sie die fixierten/permeabilisierten Zellen in 50 μL eines permeabilisierenden Puffers. Dann fügen Sie 0,3 ng antihumanen ETNL-NIS-Antikörper in 50 μL Flusspuffer hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei 4 ° C.
    6. 150 μL Durchflusspuffer hinzufügen und die Zellen bei 650 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Inkubieren Sie die Zellen mit 2,5 μL sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper in 50 μL Flusspuffer für 30 min bei 4 °C, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 150 μL Flusspuffer und zentrifugieren Sie bei 650 × g für 3 min bei 4 °C.
    7. Schließlich resuspendieren Sie in 200 μL Flusspuffer und führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen (Abbildung 3A, B).
    8. Zählen und schleudern Sie an Tag 8 die T-Zellen bei 300 × g für 8 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die T-Zellen mit Gefriermedium (90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid [DMSO]) in einer Konzentration von 10 × 106 / ml und übertragen Sie dann jeweils 1 ml auf markierte Kryo.
    9. Stellen Sie die Durchstechflaschen für 48 h in einen Gefrierschrank von -80 °C. Nach 48 h (und am Tag 10) die T-Zellen in flüssigen Stickstoff überführen.
      HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie eine Übersicht über die Produktion von NIS+ CAR-T-Zellen. Abbildung 3D zeigt Beispiele für die Ex-vivo-T-Zell-Expansion von drei verschiedenen Spendern.

2. NIS+ BCMA-CAR T-Zellbildgebung mit [ 18F]TFB-PET-Scan

HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Imsengco Clinic (IACUC A00001767-16), IRB und IBC (Bios00000006.04). OPM-2 ist eine BCMA+ MM-Zelllinie, die häufig als Zielzelllinie für BCMA-CAR-T-Zellen verwendet wird39,40.

  1. Etablieren Sie Luciferase+ BCMA+ OPM-2-Zellen.
    1. Samen Sie 500.000 OPM-2-Zellen in einer mit Gewebekulturen behandelten 24-Well-Platte. Auftauen des Lentivirus, das für Luciferase-GFP bei 4 °C kodiert.
    2. Fügen Sie das frisch aufgetaute Virus bei einem MOI von 3,0 zu OPM-2-Zellen hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    3. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion fügen Sie 2 μg / ml Puromycin hinzu, um die transduzierten Zellen auszuwählen. Vier Tage nach der Transduktion werden die GFP-positiven Zellen (Luciferase-positiv) durch Durchflusszytometrie beurteilt (Abbildung 3E).
  2. Erstellen Sie BCMA+ OPM-2 Xenograft-Mausmodelle (Abbildung 4).
    1. Zählen Sie Luciferase+ OPM-2-Zellen und drehen Sie sie zweimal herunter, um das gesamte Zellkulturmedium zu entfernen. Resuspendieren Sie die OPM-2-Zellen in einer Konzentration von 10 × 106 Zellen/ml mit PBS.
    2. Injizieren Sie am Tag -21 100 μL (1,0 × 106 Zellen) Luciferase+ OPM-2-Zellen in die Schwänze von 8 bis 12 Wochen alten immungeschwächten NOD-scid IL2rγnull (NSG)-Mäusen (Abbildung 4).
    3. Überprüfen Sie am Tag 20 nach der OPM-2-Zellinjektion (Tag -1 der CAR-T-Zell-Injektion) die Tumorlast mittels Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) (Abbildung 4).
      HINWEIS: OPM-2-Zellen bilden einen langsam wachsenden Tumor, dessen Transplantation normalerweise 2-3 Wochen dauert.
    4. Verabreichung von 10 μL/g D-Luciferin an OPM-2-Xenograft-Mäuse durch intraperitoneale (IP) Injektion. Nach 10 min BLI an den Mäusen unter 2% Isoflurangas durchführen (Abbildung 5A). Nach Bestätigung der Tumortransplantation randomisieren Sie die Mäuse entsprechend der Tumorbelastung.
    5. Am Tag -1 der CAR-T-Zell-Injektion NIS+BCMA-CAR-T-Zellen auftauen und das Gefriermedium durch Zentrifugation (300 × g, 8 min, 4 °C) entfernen. Dann resuspendieren die Zellen mit TCM bei 2,0 × 106 Zellen/ml und inkubieren über Nacht (37 °C, 5% CO2).
    6. Zählen und zentrifugieren Sie am 0. Tag die NIS+BCMA-CAR T-Zellen (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspendieren Sie die NIS+BCMA-CAR T-Zellen bei 50 × 106 Zellen/ml mit PBS.
    7. Verabreichung von 100 μL (5,0 × 106 Zellen) NIS+BCMA-CAR-T-Zellen durch Tail-Veneninjektion an die OPM-2-Xenograft-Mäuse. Stellen Sie sich an den Tagen 7 und 15 die Mäuse mit einem PET-Scan vor.
  3. NIS+BCMA-CAR-T-Zelle in vivo Bildgebung mit BCMA+OPM-2 Xenograft-Mausmodell.
    1. Wiegen Sie die Mäuse vor der Bildgebung und entfernen Sie alle Metallohrmarken, um metallbezogene Artefakte zu beseitigen.
    2. Bereiten Sie [18F]TFB wie zuvor beschrieben vor41.
      HINWEIS: [18F]TFB muss am Tag seiner Verwendung hergestellt werden. Die radiochemische Reinheit sollte >99% und die molare Aktivität >5 GBq/mmol betragen.
    3. 9,25 MBq [18F]TFB intravenös über die Injektion der Heckvene injizieren. Erlauben Sie eine Aufnahmezeit von ~ 40 Minuten, damit der Radiotracer im Körper verteilt wird und das Blut gereinigt wird.
    4. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran-Inhalation (2%).
      HINWEIS: Isofluran ist das bevorzugte inhalative Anästhetikum, da es schnell und zuverlässig einsetzt und sich erholt.
    5. Reinigen Sie vor der Betäubung der Maus alle Oberflächen des Anästhesiegeräts mit Desinfektionsmittelneinigern.
    6. Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer. Drehen Sie das Vaporizer-Zifferblatt auf 2% und warten Sie, bis die Maus innerhalb von 1-2 Minuten liegend und nicht mehr reagiert.
    7. Überwachen Sie die Maus, um eine unzureichende Anästhesie oder eine übermäßige Depression der Atmungsfunktionen zu vermeiden. Kurz gesagt, kneifen Sie den Zeh, um die unzureichende Anästhesie zu bestätigen.
      HINWEIS: Die normale Atemfrequenz beträgt bis zu 180 / min und die akzeptable Tropfenrate beträgt 50%.
    8. Tragen Sie Augensalbe auf, um Hornhauttrocknung und Trauma zu vermeiden.
    9. Erfassen Sie PET/CT-Bilder 45 Minuten nach der Injektion mit der betäubten Maus an einem Mikro-PET/CT-Bildgebungsarbeitsplatz (siehe Materialtabelle). Als nächstes erfassen Sie statische PET-Bilder für 15 Minuten, gefolgt von CT-Bildaufnahme für 5 Minuten mit 360 ° -Drehung und 180 Projektionen bei 500 μA, 80 keV und 200 ms Belichtung.
  4. Analyse der erfassten Bilddaten
    1. Analysieren Sie die Bilder mit der PET-Bildverarbeitungssoftware (Abbildung 5B und Supplemental Video S1).
    2. Definieren Sie das Volumen des Interesses (VOI).
    3. Berechnen Sie den standardisierten Aufnahmewert (SUV) mit der Formel (2).
      SUV in VOI = Konzentration der Aktivität in VOI (MBq/ml) × Körpergewicht (g) / verabreichte Dosis (MBq) (2)
  5. Bestätigung des NIS+BCMA-CAR-T-Zelltransports zu den Tumorstellen mit der Durchflusszytometrie
    1. Nach der [18F]TFB-PET-Bildgebung die Maus wieder in den Käfig legen. Überwachen Sie die Tiere nach Beendigung der Narkose, bis sie zu einer gezielten Bewegung fähig sind, und stellen Sie sicher, dass sie Zugang zu Nahrung und Wasser haben.
    2. Überwachen Sie die Mäuse bis zum Zerfall des injizierten [18F]TFB. Sobald das Radioisotop nicht nachweisbar ist, euthanasieren Sie die Mäuse mit CO2.
    3. Um einzuschläfern, legen Sie die Mäuse in den Käfig (nicht mehr als 5 Mäuse pro Käfig).
    4. Setzen Sie die Mäuse CO2 aus, bis die Atmung in ca. 5-10 min vollständig eingestellt ist.
      HINWEIS: Diese Euthanasiemethode muss mit den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (Ausgabe 2020) übereinstimmen.
    5. Um den Tod der Mäuse sicherzustellen, führen Sie eine Zervixdislokation durch, indem Sie den Hinterkopf und die Basis des Schwanzes des Tieres greifen und dann die Hände auseinander / voneinander wegziehen.
    6. Ernten Sie das Knochenmark, um zu bestätigen, dass die NIS + BCMA-CAR-T-Zellen effizient zur Tumorstelle gelangen.
    7. Übertragen Sie die geernteten Femuren und Tibia auf eine 6-Well-Platte, die 5 ml Zellkulturmedium enthält. Entfernen Sie die Muskeln und Sehnen von den Oberschenkelknochen und der Tibia und schneiden Sie einfach beide Enden (über den Gelenken) der Oberschenkelknochen und der Tibia ab.
    8. Füllen Sie eine Insulinspritze mit dem Zellkulturmedium und spülen Sie das Knochenmark auf die 6-Well-Platte. Verwenden Sie für Femuren 22 G Nadeln und 5 ml Spritzen, da der Femurdurchmesser größer ist als der der Tibia.
    9. Verwenden Sie das flache Ende des Kolbens, um das Knochenmark zu schleifen. Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-ml-Rohr und filtern Sie das gemahlene Knochenmark. Füllen Sie dann das Röhrchen mit dem Durchflusspuffer auf und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 8 min bei 4 °C.
    10. Saugen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Knochenmark mit 5 ml Flusspuffer. Übertragen Sie 200 μL Knochenmark auf eine 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 50 μL Flusspuffer.
    11. Färben Sie das Knochenmark mit Flussantikörpern gegen 0,25 μg Maus-CD45, 0,03 μg humanes CD45, 0,06 μg menschliches CD3, 0,24 μg humanes BCMA und 0,3 μL lebendes/totes Aqua. Inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten bei RT im Dunkeln.
    12. Zentrieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min bei 4 °C. Fügen Sie dann 200 μL Durchflusspuffer hinzu und führen Sie ihn auf dem Durchflusszytometer aus (Abbildung 5C).

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Schritte zum Generieren von NIS+BCMA-CAR-T-Zellen. Isolieren Sie am Tag 0 PBMCs und dann T-Zellen durch negative Selektion. Dann stimulieren Sie T-Zellen mit Anti-CD3 / CD28-Perlen. Transduzieren Sie an Tag 1 T-Zellen sowohl mit NIS- als auch mit BCMA-CAR-Lentiviren. Zählen Sie an den Tagen 3, 4 und 5 T-Zellen und füttern Sie sie mit Medien, um die Konzentration auf 1,0 × 106/ml einzustellen. Für NIS-transduzierte T-Zellen fügen Sie 1 μg/ml P...

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Diskussion

Dieses Papier beschreibt eine Methodik für die Integration von NIS in CAR-T-Zellen und die Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen in vivo durch [18F]TFB-PET. Als Proof of Concept wurden NIS+BCMA-CAR T-Zellen mittels dualer Transduktion erzeugt. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Integration von NIS in CAR-T-Zellen die Funktionen und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in vivo nicht beeinträchtigt und den Transport und die Expansion von CAR-T-Zellen ermöglic...

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Offenlegungen

SSK ist ein Erfinder von Patenten in der CAR-Immuntherapie, die an Novartis (durch eine Vereinbarung zwischen der Mayo Clinic, der University of Pennsylvania und Novartis) und Mettaforge (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. RS, MJC und SSK sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Humanigen lizenziert sind. SSK erhält Forschungsgelder von Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs und Lentigen. Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Mayo Clinic K2R-Pipeline (SSK), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) und die Predolin Foundation (RS) unterstützt. Die Abbildungen 1, 2 und 4 wurden mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Referenzen

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