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Resumo

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Resumo

Células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico (CAR) mostraram resultados sem precedentes em ensaios clínicos cruciais para pacientes com malignidades celulares B ou mieloma múltiplo (MM). No entanto, inúmeros obstáculos limitam a eficácia e proíbem o uso generalizado de terapias celulares CAR T devido ao mau tráfico e infiltração em locais tumorais, bem como à falta de persistência in vivo. Além disso, toxicidades que ameaçam a vida, como síndrome de liberação de citocinas ou neurotoxicidade, são grandes preocupações. Imagens eficientes e sensíveis e o rastreamento de células CAR T permitem a avaliação do tráfico de células T, expansão e caracterização in vivo e permite o desenvolvimento de estratégias para superar as limitações atuais da terapia celular CAR T. Este artigo descreve a metodologia de incorporação do isíndote de sódio (NIS) em células CAR T e para a imagem celular CAR T usando a tomografia de emissão de tetrafluoroborato-pósitron ([18F]TFB-PET) em modelos pré-clínicos. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outras construções car e genes-alvo, além dos utilizados neste estudo.

Introdução

A terapia celular do receptor de antígeno quimérico T (CAR T) é uma abordagem rapidamente emergente e potencialmente curativa em malignidades hematológicas1,2,3,4,5,6. Desfechos clínicos extraordinários foram relatados após a terapia celular CAR T (CART19) ou B (BCMA) de maturação celular B (BCMA). Isso levou à aprovação da Food and Drug Administration (FDA) dos EUA das células CART19 para linfoma agressivo de células B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblástica aguda (Tisa-Cel)5,8, linfoma de células de manto (brexucabtagene autoleuce)9, e linfoma folicular (Axi-Cel)10 . Mais recentemente, a FDA aprovou a terapia celular CAR T dirigida pelo BCMA em pacientes com mieloma múltiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Além disso, a terapia celular CAR T para leucemia linfocítica crônica (LLC) está em desenvolvimento clínico em estágio final e deverá receber aprovação da FDA nos próximos três anos11.

Apesar dos resultados inéditos da terapia celular CAR T, seu uso generalizado é limitado por 1) insuficiente na expansão celular CAR T ou mau tráfico para locais tumorais, o que leva a menores taxas de resposta durável12,13 e 2) o desenvolvimento de eventos adversos com risco de vida, incluindo síndrome de liberação de citocinas (CRS)14,15 . As marcas do CRS incluem não apenas ativação imunológica resultando em níveis elevados de citocinas inflamatórias/quimioterapias, mas também proliferação maciça de células T após infusão de células CAR T15,16. Assim, o desenvolvimento de uma estratégia validada de grau clínico para imagem de células CAR T in vivo permitiria 1) O rastreamento de células CAR T em tempo real in vivo monitoraria seu tráfico para locais tumorais e descobriria mecanismos potenciais de resistência, e 2) monitoramento da expansão de células CAR T e potencialmente prever suas toxicidades, como o desenvolvimento de CRS.

As características clínicas de SS leve são febre alta, fadiga, dor de cabeça, erupção cutânea, diarreia, artalgia, mialgia e mal-estar. Em CRS mais grave, os pacientes podem desenvolver taquicardia/hipotensão, vazamento capilar, disfunção cardíaca, insuficiência renal/hepática e coagulação intravascular disseminada17,18. Em geral, o grau de elevação das citocinas, incluindo interferon-gama, fator estimulante da colônia granulocito-macrófago, interleucina (IL)-10 e IL-6, mostrou-se correlacionar com a gravidade dos sintomas clínicos17,19. No entanto, a ampla aplicação do monitoramento de citocinas séricos "em tempo real" para prever o CRS é difícil devido ao alto custo e disponibilidade limitada. Para explorar as características benéficas da terapia celular CAR T, imagens não invasivas de células T adotivas podem ser potencialmente utilizadas para prever a eficácia, toxicidades e recaídas após a infusão de células CAR T.

Vários pesquisadores desenvolveram estratégias para usar imagens baseadas em radionuclídeos com tomografia de emissão de pósitrons (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de fótons (SPECT), que fornece alta resolução e alta sensibilidade20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 para o visualização in vivo e monitoramento do tráfico de células CAR T. Entre essas estratégias de imagem baseadas em radionuclídeos, o isíndonte de iodeto de sódio (NIS) foi desenvolvido como uma modalidade sensível às células de imagem e vírus usando pet scans31,32. A imagem celular NIS+CAR T com [18F]TFB-PET é uma tecnologia sensível, eficiente e conveniente para avaliar e diagnosticar a expansão, o tráfico e a toxicidade das células CAR T. Este protocolo descreve 1) o desenvolvimento de células NIS+CAR T através de transdução dupla com alta eficácia e 2) uma metodologia para imagens de células NIS+CAR T com [18F]TFB-PET scan. BCMA-CAR T células para MM são usadas como um modelo de prova de conceito para descrever NIS como repórter para imagens de células CAR T. No entanto, essas metodologias podem ser aplicadas a qualquer outra terapia celular CAR T.

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Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Mayo Clinic, do Comitê de Biossegurança Institucional e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic.

1. Produção de células NIS+ BCMA-CAR T

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Clínica Mayo (IRB 17-008762) e do Comitê de Biossegurança Institucional (IBC Bios000000006.04).

  1. Produção de lentivírus de codificação BCMA-CAR, NIS e luciferase-green (GFP).
    NOTA: Uma construção BCMA-CAR de segunda geração foi sintetizada de novo (ver a Tabela de Materiais) e clonada em um vetor lentiviral de terceira geração sob o controle de um fator de alongamento-1 alfa (EF-1α) promotor. A construção BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) incluiu a costimulação de 4-1BB e um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um clone de anticorpos BCMA anti-humano C11D5.333,34. O NIS está sob o controle do promotor EF-1α e se liga ao gene de resistência à puramicina através de peptídeos auto-cleaving (P2A). A codificação do vetor lentiviral luciferase-GFP (ver a Tabela de Materiais) é usada para transdutar células tumorais, que então expressam GFP e luciferase.
    1. Prepare plasmídeos vetoriais lentivirais: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contêm o gene de resistência à puramicina. Portanto, as células transduzidas NIS ou luciferase-GFP podem ser selecionadas com 1 μg/mL ou 2 μg/mL de dihidrocloreto de ideomicina, conforme descrito anteriormente14,35.
    2. Semente 20 × 106 de células 293T em um frasco T175 e incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO2. Confirme que as células 293T são distribuídas uniformemente no frasco a 70-90% de confluência por visualização direta sob o microscópio.
    3. Prepare uma mistura mestre de 15 μg do vetor de expressão (por exemplo, CAR, NIS ou DNA linear luciferase-GFP), 7 μg do vetor envelope (VSV-G) e 18 μg do vetor da embalagem (mordaça, pol, rev e tat). Diluir a mistura mestre de DNA em 4,5 mL do meio de transfecção e, em seguida, adicionar 111 μL do reagente pré-complexo (Mistura A).
    4. Prepare um novo tubo e dilua 129 μL do reagente de transfecção liposômica em 4,5 mL do meio de transfecção (Mistura B).
    5. Misture as misturas A e B e misture o tubo para misturar o conteúdo. Incubar por 30 min em temperatura ambiente (RT).
    6. Após a incubação, basta aspirar a célula sobrenante sem desprender as células e adicionar 16 mL de um meio de crescimento contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina-glutamina. Em seguida, adicione a mistura de misturas A e B em células 293T dropwise. Por fim, incubar as células transfeinadas a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h.
    7. Nos dias 1 e 2 pós-transfecção, colher o supernasal de 293T, girar a 900 × g por 10 minutos e filtrar através de um filtro de nylon de 0,45 μm. Concentre o filtrado em 24 e 48 h por ultracentrifugação a 112.700 × g por 2h e congele a -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolamento de células T (Figura 1)
    NOTA: Realize todo o trabalho de cultura celular em um armário de fluxo laminar usando técnica asséptica e equipamento de proteção individual. As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) são colhidas a partir de sangue saudável de doadores voluntários coletados durante aferese36. A triagem de patógenos foi realizada em células humanas utilizadas neste estudo.
    1. Use a técnica de gradiente de densidade padrão para isolar os PBMCs.
      1. Adicione suavemente 15 mL de gradiente de densidade (densidade de 1,077 g/mL) (contendo alfa-D-glucopyranoside, beta-D-frutosuctofuranosyl homopolímero, e, 3-(acetylamino)-5-(acetylimetilaamino)-2,4,6-6-monosodium ácido monossódico de 50 mL sem criar bolhas de ar (ver a Tabela dos Materiais).
      2. Para evitar armadilhas de células, diluir a amostra de sangue com soro salino tamponado de fosfato (PBS, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 0,2 g/L de monobásico fosfato de potássio, 8 g/L de cloreto de sódio e 1,15 g/L de dibásico fosfato de sódio) contendo 2% de FBS em uma proporção de 1:1. Transfira suavemente o sangue diluído em cima do meio de gradiente de densidade sem quebrar a interface entre os dois. Gire a 1.200 × g por 10 min na RT.
        NOTA: Um tubo de separação gradiente de densidade de 50 mL pode ser usado para o isolamento de 4-17 mL de uma amostra de sangue. O tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mL (ver a Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo não requer o "freio desligado" durante a centrifugação. No entanto, quando os tubos padrão de 50 mL são usados, o freio precisa estar desligado e requer centrifugação de 30 min.
      3. Transfira o supernante para um novo tubo cônico de 50 mL, lave com PBS + 2% FBS preenchendo até 50 mL e, em seguida, gire a 300 × g por 8 min na RT.
      4. Aspire o supernasce, e resuspenda as células pelotas em 50 mL de PBS + 2% FBS. Conte o número de células e, em seguida, gire para baixo a 300 × g por 8 min no RT. Repita a etapa anterior para um total de 2 lavagens.
    2. Aspire o supernasce, e resuspenme as células pelotas a uma concentração de 50 × 106 células/mL com PBS + 2% FBS.
    3. Realize o isolamento de células T de PBMCs usando um kit de contas magnéticas de seleção negativa.
      NOTA: Um kit de seleção negativo ideal inclui contas magnéticas ligadas a anticorpos contra antígenos expressos em células diferentes das células T. Um kit comumente usado contém anticorpos conjugados a contas magnéticas contra CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD23a, CD19 e CD16 (ver Tabela de Materiais).
      1. Transfira PBMCs para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 14 mL. Em seguida, coloque os PBMCs e o coquetel de anticorpos de seleção negativa em um separador de células totalmente automatizado, e realize o isolamento de células T de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Estimulação celular T e expansão de células T (Figura 1)
    1. Para cultivar as células T isoladas, prepare o meio de expansão celular T (TCM) feito com célula hematopoiética livre de soro complementada com 10% de albumina de soro humano e 1% penicilina-estreptomicina-glutamina14. Após o isolamento das células T, conte as células e a cultura em uma concentração de 2 × 106 células/mL com TCM.
    2. Lave as contas anti-CD3/CD28 três vezes com TCM antes de cultivadas com células T.
      1. Misture o frasco contendo as contas girando. Em seguida, pipeta o volume necessário de contas (3:1 contas:célula) (por exemplo, ao estimular 1,0 × 106 células de células T, use 3,0 × 106 de contas anti-CD3/CD28) em um tubo de microcentrifusidade estéril (1,5 mL) e resuspendam em 1 mL de TCM.
    3. Coloque o tubo de microcentrifuuge com as contas em um ímã por 1 min, e aspire o supernatante. Remova o tubo do ímã e resuspense as contas lavadas em 1 mL de TCM. Repita as duas etapas anteriores para um total de 3 lavagens.
    4. Resuspenda as contas em 1 mL de TCM e transfira-as para as células T. Em seguida, diluir as células T para uma concentração final de 1,0 × 106 células/mL com TCM. Transfira a suspensão t-cell/bead para uma placa de 6 poços tratada com cultura tecidual e coloque-a na incubadora (37 °C, 5% DE CO2).
  4. Titulação de lentivírus (Figura 2)
    1. Prepare células T para ensaio de titulação. Certifique-se de que aproximadamente 1,0 x 106 células estão disponíveis para titular um tipo de vírus.
    2. Estimule as células T como descrito na seção 1.3.2.
    3. Placa 1.0 × 105 células de células T estimuladas em uma placa de 96 poços (placa de titer) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h (Figura 2A). Isole e estimule as células T como descrito na seção 1.2.
    4. Prepare uma placa de diluição (placa de 96 poços) adicionando 100 μL de TCM nos poços das colunas designadas e nos poços de controle não traduzidos (Figura 2B).
    5. Descongele um frasco de partículas lentivirais no gelo e gentilmente pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Transfira 50 μL do vírus sobrenante para os poços da Coluna 6 da placa de 96 poços (diluição 3) (Figura 2B). Pipeta para cima e para baixo para misturar bem.
    6. Realizar diluições seriais (diluição serial de 2 vezes): transferir 50 μL do bem A6 para o bem B6 e, em seguida, 50 μL do bem B6 para o bem C6; repetir até G6. Em seguida, adicione 50 μL do vírus diluído à placa de titer (Figura 2B).
    7. Incubar a placa de titer a 37 °C, 5% de CO2 por 48 h e determinar as porcentagens de células CAR-, NIS-ou GFP positivo por citometria de fluxo (Figura 2C).
      1. Lave os poços girando a placa de titer duas vezes a 650 × g a 4 °C por 3 min.
      2. Colorir as células T transduzidas como descrito nas etapas 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determine os títulos com base nas porcentagens de células CAR-, NIS ou GFP-positive usando fórmula (1):
        Titers = Percentual de células BCMA-CAR+ ou NIS+ T × contagem de células T na transdução × diluição / volume específico (1)
  5. Transdução de lentivírus e NIS+Expansão de células BCMA-CAR T
    1. Vinte e quatro a 48 horas após a estimulação celular T, realizam transdução lentiviral em células T estimuladas (as células T devem formar aglomerados).
      1. Descongele os lentivírus congelados codificando CAR ou NIS a 4 °C.
      2. Misture bem as células T estimuladas para quebrar os aglomerados, e simplesmente adicione o vírus recém-descongelado a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5.0 (ao transdudir 1,0 × 106 células T, use 5,0 × 106 de lentírones). Incubar as células transduzidas a 37 °C, 5% de CO2.
      3. Nos dias 3, 4 e 5, conte as células T transduzidas usando um hematócitometro37 ou um contador de células totalmente automatizado38 e ajuste a concentração celular para 1,0 × 106 células/mL adicionando TCM fresco e pré-aquecido. Para células T transduzidas pelo NIS que carregam o gene de resistência à puramicina, trate as células com 1 μg/mL de dihidrocloida de diocrina de puramicina nos dias 3, 4 e 5.
    2. No dia 6, remova as contas anti-CD3/CD28 das células T transduzidas (a partir da etapa 1.3.4) misturando bem para quebrar os aglomerados de células T e colocando-os em um ímã por 1 min. Em seguida, basta colocar as células T transduzidas coletadas de volta à cultura em uma concentração de 1,0 × 106 células/mL. Após remover as contas das células T, avalie a expressão de CAR e NIS por citometria de fluxo.
      NOTA: Como o fragmento variável de cadeia única do BCMA-CAR é derivado do mouse, ele pode ser manchado com IgG anti-rato de cabra (H+L) conjugado com Alexa Fluor 647. O NIS pode ser detectado usando ETNL anti-humano [peptídeo sintético correspondente ao aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL)]. Este anticorpo reconhece o citosolico C-terminus do NIS. Portanto, as células T devem ser permeabilizadas antes da incubação com um anticorpo anti-humano NIS.
    3. Realizar a coloração superficial do BCMA-CAR usando igG anti-rato de cabra (H+L).
      1. Pegue uma alíquota da cultura (por exemplo, 50.000 células T) e lave com tampão de fluxo (PBS, 1% FBS e 1% azida de sódio). Em seguida, resuspenque as células com 50 μL de tampão de fluxo e colora as células com 1 μL de anticorpo anti-rato de cabra para detectar expressão CAR e 0,3 μL de aqua viva morta para excluir células mortas.
      2. Incubar por 15 minutos no escuro em RT, lavar as células adicionando 150 μL de tampão de fluxo e centrifugar as células a 650 × g por 3 min a 4 °C.
    4. Após a coloração superficial do CAR, fixe e permeabiliize as células adicionando 100 μL de meio de fixação (PBS com 4,21% de formaldeído) e incubar por 20 min a 4 °C. Lave as células duas vezes com 100 μL de um buffer que contenha um agente permeabilizante celular como a saponina (650 × g por 3 min a 4 °C).
    5. Resuspengem as células fixas/permeabilizadas em 50 μL de um buffer permeabilizante. Em seguida, adicione 0,3 ng de anticorpo ETNL NIS anti-humano em 50 μL de tampão de fluxo e incubar por 1 h a 4 °C.
    6. Adicione 150 μL de tampão de fluxo e centrifugar as células a 650 × g por 3 min a 4 °C. Incubar as células com 2,5 μL de anticorpo secundário anti rabbit em 50 μL de tampão de fluxo por 30 min a 4 °C, lavar as células adicionando 150 μL de tampão de fluxo e centrífuga a 650 × g por 3 min a 4 °C.
    7. Finalmente, resuspenque em 200 μL de tampão de fluxo e realize a citometria de fluxo para determinar a eficiência da transdução (Figura 3A,B).
    8. No dia 8, conte e gire as células T a 300 × g por 8 min a 4 °C. Resuspengue as células T com meio de congelamento (90% FBS + 10% dimetilsulfoxida [DMSO]) a uma concentração de 10 × 106/mL, depois transfira 1 mL cada para criovávias rotuladas.
    9. Coloque os frascos em um congelador de -80 °C por 48 h. Após 48 h (e até o dia 10), transfira as células T para nitrogênio líquido.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter a visão geral da produção de células CAR T NIS+. A Figura 3D representa exemplos de expansão celular ex vivo T de três doadores diferentes.

2. NIS+ BCMA-CAR T imagens celular com [ 18F]TFB-PET scan

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 é uma linha de células BCMA+ MM, que é frequentemente usada como uma linha de células-alvo para células BCMA-CAR T39,40.

  1. Estabeleça células luciferase+ BCMA+ OPM-2.
    1. Sementes 500.000 células OPM-2 em uma placa de 24 poços tratadas pela cultura tecidual. Degelo lentivírus codificando luciferase-GFP a 4 °C.
    2. Adicione o vírus recém-descongelado em um MOI de células 3.0 a OPM-2 e misture bem por pipetação. Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% DE CO2).
    3. Quarenta e oito horas após a transdução, adicione 2 μg/mL de puramicina para selecionar as células transduzidas. Quatro dias após a transdução, avalie as células GFP-positivas (luciferase-positiva) por citometria de fluxo (Figura 3E).
  2. Estabeleça modelos de mouse de xenoenxerto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Conte as células OPM-2 de luciferase+ e gire-as duas vezes para remover todo o meio de cultura celular. Resuspend as células OPM-2 a uma concentração de 10 × 106 células/mL com PBS.
    2. No dia -21, injete 100 μL (1,0 × 106 células) de células de luciferase+ OPM-2 nas caudas de camundongos imunocomprometidos de 8 a 12 semanas de idade NOD-scid IL2rγnull (NSG) (Figura 4).
    3. No dia 20 após a injeção celular OPM-2 (dia -1 de injeção de células CAR T), verifique a carga tumoral via bioluminescência por imagem (BLI) (Figura 4).
      NOTA: As células OPM-2 formam um tumor de crescimento lento, que geralmente leva de 2 a 3 semanas para engrafar.
    4. Administre 10 μL/g de D-luciferin em camundongos xenoenxertos OPM-2 através de injeção intraperitoneal (IP). Após 10 min, realize bli nos camundongos abaixo de 2% de gás isoflurane (Figura 5A). Após a confirmação do enxerto tumoral, randomize os camundongos de acordo com a carga tumoral.
    5. No dia -1 da injeção de células CAR T, descongele as células NIS+BCMA-CAR T e remova o meio de congelamento por centrifugação (300 × g, 8 min, 4 °C). Em seguida, as células resusgasuspendas com TCM a 2,0 × 106 células/mL e incubam durante a noite (37 °C, 5% de CO2).
    6. No dia 0, conte e centrifufique as células NIS+BCMA-CAR T (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspende as células NIS+BCMA-CAR T a 50 × 106 células/mL com PBS.
    7. Administre 100 μL (5,0 × 106 células) de células NIS+BCMA-CAR T via injeção de veia traseira para os camundongos xenoenxertos OPM-2. Nos dias 7 e 15, imagem os ratos usando uma tomografia PET.
  3. NIS+BCMA-CAR T célula in vivo imagem usando bcma+OPM-2 modelo de mouse de xenerto xenoenxerto.
    1. Pesar os ratos antes da imagem e remover quaisquer etiquetas de ouvido de metal para eliminar artefatos relacionados ao metal.
    2. Prepare [18F]TFB como descrito anteriormente41.
      NOTA: [18F]TFB deve ser produzido no dia de seu uso. A pureza radioquímica deve ser >99% e a atividade molar >5 GBq/mmol.
    3. Injete 9,25 MBq [18F]TFB por via intravenosa por injeção de veia traseira. Permita que um período de absorção de ~40 min para o radiotracer seja distribuído no corpo e limpe o sangue.
    4. Anestesiar o rato usando inalação de isoflurano (2%).
      NOTA: Isoflurane é o anestésico inalado preferido, pois tem início e recuperação rápidos e confiáveis.
    5. Antes de anestesiar o mouse, limpe todas as superfícies da máquina de anestesia com produtos desinfetantes.
    6. Coloque o mouse dentro da câmara de indução. Gire o mostrador vaporizador para 2% e espere que o mouse se torne reclinável e não responsivo dentro de 1-2 min.
    7. Monitore o camundongo para evitar anestesia insuficiente ou depressão excessiva das funções respiratórias. Resumindo, belisque o dedo do dedo para confirmar a anestesia insuficiente.
      NOTA: A taxa respiratória normal é de até 180/min, e a taxa de queda aceitável é de 50%.
    8. Aplique pomada oftálmica para evitar secagem e trauma na córnea.
    9. Adquira imagens PET/CT 45 min pós-injeção com o rato anestesiado em uma estação de trabalho de imagem micro PET/CT (veja a Tabela de Materiais). Em seguida, adquira imagens estáticas pet por 15 min seguidas de aquisição de imagem CT para 5 min com rotação de 360° e projeções de 180 a 500 μA, 80 keV e exposição de 200 ms.
  4. Analisando dados de imagem adquiridos
    1. Analise as imagens usando o software de processamento de imagens PET (Figura 5B e Vídeo Suplementar S1).
    2. Defina o volume de juros (VOI).
    3. Calcule o valor de absorção padronizado (SUV) utilizando fórmula (2).
      SUV em VOI = Concentração de atividade em VOI (MBq/mL) × peso corporal (g) / dose administrada (MBq) (2)
  5. Confirmação do tráfico celular NIS+BCMA-CAR T aos locais tumorais com a citometria de fluxo
    1. Depois de [18F]Imagem TFB-PET, coloque o mouse de volta na gaiola. Após a cessação da anestesia, monitore os animais até que sejam capazes de movimento proposital e garantam que tenham acesso a alimentos e água.
    2. Monitore os camundongos até a decomposição do TFB injetado [18F]. Uma vez que o radioisótopo não é detectável, eutanize os ratos com CO2.
    3. Para eutanásia, coloque os ratos na gaiola (não mais do que 5 ratos por gaiola).
    4. Exponha os camundongos ao CO2 até a cessação completa da respiração em aproximadamente 5-10 min.
      NOTA: Este método de eutanásia deve ser consistente com as Diretrizes avma para a eutanásia de animais (Edição 2020).
    5. Para garantir a morte dos camundongos, realize a luxação cervical segurando a parte de trás da cabeça e a base da cauda do animal, em seguida, puxando as mãos separadas/longe umas das outras.
    6. Colher a medula óssea para confirmar que as células NIS+BCMA-CAR T trafegam eficientemente para o local do tumor.
    7. Transfira os fêmures e a tíbia colhidos para uma placa de 6 poços contendo 5 mL de meio de cultura celular. Remova os músculos e tendões dos fêmures e tíbia, e simplesmente corte ambas as extremidades (acima das articulações) dos fêmures e tíbia.
    8. Encha uma seringa de insulina com o meio de cultura celular, e lave a medula óssea na placa de 6 poços. Para fêmures, use agulhas de 22 G e seringas de 5 mL porque o diâmetro do fêmur é maior que o da tíbia.
    9. Use a extremidade plana do êmbolo para moer a medula óssea. Coloque um coador de células de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e filtre a medula óssea moída. Em seguida, encha o tubo com o tampão de fluxo e centrifule o tubo a 300 × g por 8 min a 4 °C.
    10. Aspire o supernascer e resuspense a medula óssea com 5 mL de tampão de fluxo. Transfira 200 μL de medula óssea para uma placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 300 × g por 3 min a 4 °C. Decante o supernasciente, e resuspense as células com 50 μL de tampão de fluxo.
    11. Manche a medula óssea com anticorpos de fluxo contra 0,25 μg de camundongo CD45, 0,03 μg de CD45 humano, 0,06 μg de CD3 humano, 0,24 μg de BCMA humano e 0,3 μL de aqua vivo/morto. Incubar a placa por 15 minutos no RT no escuro.
    12. Centrifugar a placa a 300 × g por 3 min a 4 °C. Em seguida, adicione 200 μL de tampão de fluxo e execute no citômetro de fluxo (Figura 5C).

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Resultados

A Figura 1 representa os passos de geração de células NIS+BCMA-CAR T. No dia 0, isole os PBMCs e isole as células T por seleção negativa. Em seguida, estimule as células T com contas anti-CD3/CD28. No primeiro dia, transduem células T com lentivírus NIS e BCMA-CAR. Nos dias 3, 4 e 5, conte células T e alimente com mídia para ajustar a concentração a 1,0 × 106/mL. Para células T transduzidas pelo NIS, adicione 1 μg/mL de puramicina para selecionar célula...

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Discussão

Este artigo descreve uma metodologia para incorporar NIS em células CAR T e imagens infundidas células CAR T in vivo através de [18F]TFB-PET. Como prova de conceito, as células NIS+BCMA-CAR T foram geradas por meio de dupla transdução. Recentemente, relatamos que a incorporação do NIS nas células CAR T não prejudica as funções e a eficácia das células CAR T in vivo e permite o tráfico e expansão de células CAR T. À medida que as terapias ce...

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Divulgações

SSK é um inventor de patentes em imunoterapia CAR licenciada para Novartis (através de um acordo entre Mayo Clinic, University of Pennsylvania, e Novartis) e Mettaforge (através da Mayo Clinic). RS, MJC e SSK são inventores de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Humanigen. A SSK recebe financiamento de pesquisa de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Figuras foram criadas com BioRender.com.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado através do gasoduto Mayo Clinic K2R (SSK), do Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e da Fundação Predolin (RS). As figuras 1, 2 e 4 foram criadas com BioRender.com.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Referências

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