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要約

このプロトコールは、臨床的に利用可能なプラットフォームを用いて 、インビボで キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作されたT細胞を非侵襲的に追跡するための方法論を記載している。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作されたT細胞は、B細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫(MM)患者に対する重要な臨床試験において前例のない結果を示している。しかし、多くの障害が有効性を制限し、腫瘍部位への不十分なトラフィッキングおよび浸潤、ならびにインビボでの持続性の欠如のために、CAR T細胞療法の広範な使用を禁止している。さらに、サイトカイン放出症候群や神経毒性などの生命を脅かす毒性が大きな懸念事項です。CAR T細胞の効率的で高感度なイメージングおよび追跡は、T細胞のトラフィッキング、拡張、およびインビボ特性評価の評価を可能にし、CAR T細胞療法の現在の限界を克服するための戦略の開発を可能にします。本稿では、CAR T細胞にヨウ化ナトリウムシンポーター(NIS)を組み込むための方法論と、前臨床モデルにおける[18F]テトラフルオロホウ酸-陽電子放射断層撮影法([18F]TFB-PET)を用いたCAR T細胞イメージングについて述べる。このプロトコールに記載された方法は、本研究に用いたものに加えて、他のCAR構築物および標的遺伝子にも適用することができる。

概要

キメラ抗原受容体T(CAR T)細胞療法は、血液学的悪性腫瘍において急速に出現し、治癒可能なアプローチである1,2,3,4,5,6。CD19特異的CAR T(CART19)またはB細胞成熟抗原(BCMA)CAR T細胞療法の後に異常な臨床転帰が報告された2。これにより、米国食品医薬品局(FDA)は、攻撃的なB細胞リンパ腫(axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4、tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3、およびlisocabtagene maraleucel)7、急性リンパ芽球性白血病(Tisa-Cel)5,8、マントル細胞リンパ腫(brexucabtagene autoleuce)9、および濾胞性リンパ腫(Axi-Cel)10に対するCART19細胞の承認につながりました10.ごく最近、FDAは多発性骨髄腫(MM)(イデカブタジーン・ビクルーセル)の患者におけるBCMA指向性CAR T細胞療法を承認しました11。さらに、慢性リンパ性白血病(CLL)に対するCAR T細胞療法は後期臨床開発段階にあり、今後3年以内にFDAの承認を受ける予定です1。

CAR T細胞療法の前例のない結果にもかかわらず、その広範な使用は、1)不十分なインビボCAR T細胞増殖または腫瘍部位への不十分な輸送によって制限されており、これは持続性応答の速度の低下につながる12,13および2)サイトカイン放出症候群(CRS)14,15を含む生命を脅かす有害事象の発症14,15.CRSの特徴には、炎症性サイトカイン/ケモカインのレベルの上昇をもたらす免疫活性化だけでなく、CAR T細胞注入後の大規模なT細胞増殖も含まれます15,16。したがって、CAR T細胞をインビボでイメージングするための検証済みの臨床グレードの戦略の開発により、1)CAR T細胞をインビボでリアルタイムで追跡して腫瘍部位へのトラフィッキングを監視し、耐性の潜在的なメカニズムを明らかにし、2)CAR T細胞の増殖をモニタリングし、CRSの発症などの毒性を潜在的に予測することができます。

軽度のCRSの臨床的特徴は、高熱、疲労、頭痛、発疹、下痢、関節痛、筋肉痛、および倦怠感である。より重篤なCRSでは、頻脈/低血圧、毛細血管漏出、心機能障害、腎/肝不全、および播種性血管内凝固症候群を発症する可能性がある17,18。一般に、インターフェロン-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン(IL)-10、およびIL-6を含むサイトカインの上昇の程度は、臨床症状の重症度と相関することが示されている17,19。しかし、CRSを予測するための「リアルタイム」血清サイトカインモニタリングの広範な適用は、高いコストと限られた可用性のために困難である。CAR T細胞療法の有益な特性を利用するために、養子T細胞の非侵襲的イメージングは、CAR T細胞注入後の有効性、毒性、および再発を予測するために潜在的に利用され得る。

いくつかの研究者は、陽電子放射断層撮影法(PET)または単一光子放射コンピュータ断層撮影法(SPECT)で放射性核種ベースのイメージングを使用する戦略を開発しており、これは高解像度と高感度を提供します20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T細胞トラフィッキングのインビボ可視化とモニタリング。これらの放射性核種ベースのイメージング戦略の中で、ヨウ化ナトリウムシンポーター(NIS)は、PETスキャンを使用して細胞やウイルスを画像化する高感度モダリティとして開発されています31,32。[18F]TFB-PETによるNIS+CAR T細胞イメージングは、CAR T細胞の増殖、トラフィッキング、毒性を評価および診断するための高感度で効率的で便利な技術です30。このプロトコルは、1)高い有効性を有する二重形質導入によるNIS+CAR T細胞の開発、および2)[18F]TFB-PETスキャンを用いてNIS+CAR T細胞をイメージングするための方法論を記述している。 MM用BCMA-CAR T細胞は、NISをCAR T細胞イメージングのレポーターとして記述するための概念実証モデルとして使用される。しかしながら、これらの方法論は、他の任意のCAR T細胞療法に適用することができる。

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プロトコル

このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会、施設バイオセーフティ委員会、およびメイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠しています。

1. NIS+ BCMA-CAR Tセル生産

注:このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB 17-008762)および施設バイオセーフティ委員会(IBC Bios00000006.04)のガイドラインに従います。

  1. BCMA-CAR、NIS、およびルシフェラーゼ-グリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードするレンチウイルスの産生。
    注:第2世代のBCMA-CAR構築物をde novo(材料表を参照)合成し、伸長因子-1α(EF-1α)プロモータの制御下で第3世代レンチウイルスベクターにクローニングした。BCMA-CAR構築物(C11D5.3-41BBz)には、4-1BB共刺激および抗ヒトBCMA抗体クローンC11D5.333,34に由来する一本鎖可変断片(scFv)が含まれていた。NISはEF-1αプロモーターの制御下にあり、自己切断ペプチド(P2A)を介してピューロマイシン耐性遺伝子に結合する。ルシフェラーゼ-GFPをコードするレンチウイルスベクター(材料表を参照)は、腫瘍細胞を形質導入するために使用され、腫瘍細胞はGFPおよびルシフェラーゼを発現する。
    1. レンチウイルスベクタープラスミドを調製する:pLV-EF1α-BCMA-CAR(15 μg)、pBMN-CMV-GFP-Luc2-puro(15 μg)、およびpLV-EF1α-NIS-P2A-Puro(15 μg)。
      注:pBMN-CMV-GFP-Luc2-puroおよびpLV-EF1α-NIS-P2A-Puroはピューロマイシン耐性遺伝子を含む。したがって、NISまたはルシフェラーゼGFP形質導入細胞は、前述のように、1μg/mLまたは2μg/mLのピューロマイシン二塩酸塩で選択することができる14,35。
    2. T175フラスコに20×106 個の293T細胞をシードし、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートする。293T細胞がフラスコ上に70~90%の合流点で均等に分布していることを確認するには、顕微鏡下で直接可視化します。
    3. 15 μg の発現ベクター (CAR、NIS、またはルシフェラーゼ-GFP 直鎖状 DNA)、7 μg のエンベロープベクター (VSV-G)、および 18 μg のパッケージングベクター (gag、pol、rev、および tat ) のマスターミックスを調製します。DNAマスターミックスを4.5 mLのトランスフェクション培地で希釈し、111 μLのプレコンプレックス試薬(混合物A)を加えます。
    4. 新しいチューブを用意し、129 μL のリポソームトランスフェクション試薬を 4.5 mL のトランスフェクション培地 (混合液 B) で希釈します。
    5. 混合物AとBを組み合わせ、チューブをフリックして内容物を混ぜる。室温(RT)で30分間インキュベートする。
    6. インキュベーション後、細胞を剥離せずに細胞上清を吸引し、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミンを含む増殖培地を16mL加える。次いで、混合物AおよびBの混合物を293T細胞上に滴下して加える。最後に、トランスフェクトした細胞を37°C、5%CO2で24 時間インキュベートする。
    7. トランスフェクション後の 1 日目と 2 日目に、293T の上清を採取し、900 × g で 10 分間スピンダウンし、0.45 μm のナイロンフィルターでろ過します。濾液を112,700 × g で2時間超遠心分離して24時間および48時間で濃縮し、-80°Cで凍結する。
  2. エクスビボ T細胞の単離(図1)
    メモ: すべての細胞培養作業は、無菌技術と個人用保護具を使用して層流キャビネットで行ってください。末梢血単核球(PBMC)は、アフェレーシス中に収集された健康なボランティアドナー血液から採取されます36。病原体スクリーニングは、本研究で用いたヒト細胞に対して行った。
    1. 標準の密度勾配技術を使用して、PBMC を分離します。
      1. 15 mL の密度勾配培地 (密度 1.077 g/mL) (α-D-グルコピラノシド、β-D-フルクトフラノシルホモポリマー、および 3-(アセチルアミノ)-5-(アセチルメチルアミノ)-2,4,6-トリオド安息香酸一ナトリウム塩を含む) を、気泡を発生させずに 50 mL 密度勾配分離チューブに穏やかに加えます ( 材料表を参照)。
      2. 細胞トラップを避けるために、血液サンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.2 g/Lの塩化カリウム、0.2 g/Lのリン酸一カリウム、8 g/Lの塩化ナトリウム、および1.15 g/Lのリン酸ナトリウム二塩基)で1:1の体積比で希釈する。希釈した血液を、両者の界面を壊すことなく密度勾配培地の上に穏やかに移す。1,200 × g で RT で 10 分間スピンダウンします。
        注:50 mLの密度勾配分離チューブを使用して、4〜17 mLの血液サンプルを単離できます。このプロトコルで使用される50 mL密度勾配分離チューブ( 材料表を参照)は、遠心分離中に「ブレーキオフ」を必要としません。ただし、標準の 50 mL チューブを使用する場合、ブレーキをオフにする必要があり、30 分間の遠心分離が必要です。
      3. 上清を新しい50 mL円錐管に移し、PBS + 2% FBSで最大50 mLまで充填して洗浄し、RTで300 × g で8分間スピンダウンします。
      4. 上清を吸引し、ペレット化した細胞を50mLのPBS+2%FBSに再懸濁した。細胞数を数え、RTで8分間300 × g でスピンダウンします。前の手順を繰り返して、合計2回の洗浄を行います。
    2. 上清を吸引し、ペレット化した細胞をPBS+2%FBSで50×106 細胞/mLの濃度に再懸濁する。
    3. ネガティブセレクション磁気ビーズキットを使用してPBMCsからT細胞単離を実行します。
      注:理想的なネガティブ選択キットには、T細胞以外の細胞で発現する抗原に対する抗体に付着した磁気ビーズが含まれています。一般的に使用されるキットには、CD15、CD14、CD34、CD36、CD56、CD123、CD235a、CD19、およびCD16に対する磁気ビーズにコンジュゲートされた抗体が含まれています( 材料表を参照)。
      1. PBMCを14mLポリスチレン丸底チューブに移す。次いで、PBMCsおよびネガティブセレクション抗体カクテルを全自動細胞分離器に入れ、製造業者のプロトコールに従ってT細胞単離を行う。
  3. T細胞刺激とT細胞増殖(図1)
    1. 単離したT細胞を培養するために、10%ヒト血清アルブミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを添加した無血清造血細胞培地で作製したT細胞増殖培地(TCM)を調製する14。T細胞単離後、細胞をカウントし、TCMで2×106 細胞/mLの濃度で培養する。
    2. 抗CD3/CD28ビーズをTCMで3回洗浄してから、T細胞で培養する。
      1. ビーズを入れたバイアルを旋回させて混合する。次いで、必要量のビーズ(3:1ビーズ:細胞)(例えば、1.0×106 個のT細胞を刺激する場合、3.0×106 個の抗CD3/CD28ビーズを使用する)を滅菌微量遠心チューブ(1.5mL)にピペットし、1mLのTCMに再懸濁する。
    3. ビーズの入った微量遠心管を磁石上に1分間置き、上清を吸引した。磁石からチューブを取り出し、洗浄したビーズを1mLのTCMに再懸濁した。前の 2 つの手順を繰り返して、合計 3 回の洗浄を行います。
    4. ビーズを1mLのTCMに再懸濁し、T細胞に移す。次いで、T細胞をTCMで終濃度1.0×106 細胞/mLに希釈する。T細胞/ビーズ懸濁液を組織培養処理した6ウェルプレートに移し、インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。
  4. レンチウイルスの滴定(図2)
    1. 滴定アッセイのためにT細胞を調製する。1 種類のウイルスを滴定するために約 1.0 x 106 個の細胞が使用可能であることを確認します。
    2. セクション1.3.2で説明されているようにT細胞を刺激する。
    3. 0×105 個の刺激T細胞を96ウェルプレート(力価プレート)に含み、37°C、5%CO2で24 時間インキュベートした(図2A)。セクション1.2に記載されているようにT細胞を単離し、刺激する。
    4. 指定されたカラムおよび形質導入されていないコントロールウェルのウェルに100 μLのTCMを加えて希釈プレート(96ウェルプレート)を調製する(図2B)。
    5. レンチウイルス粒子のバイアル1本を氷上で解凍し、優しくピペットを上下にしてよく混ぜる。50 μLのウイルス上清を96ウェルプレートのカラム6のウェルに移す(希釈液3)(図2B)。ピペットを上下にしてよく混ぜる。
    6. 段階希釈(2倍段階希釈)を行う:ウェルA6からウェルB6に50 μL、次にウェルB6からウェルC6に50 μLを移す。G6まで繰り返します。次いで、希釈したウイルス50 μLを力価プレートに加える(図2B)。
    7. タイタープレートを37°C、5%CO2 で48時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってCAR-、NIS-、またはGFP陽性細胞の割合を決定した(図2C)。
      1. タイタープレートを650 × g で4°Cで3分間2回スピンダウンしてウェルを洗浄する。
      2. 形質導入T細胞をステップ1.5.3~1.5.9に記載されるように染色する。
      3. 式(1)を使用して、CAR、NIS、またはGFP陽性細胞の割合に基づいて力価を決定します。
        力価=形質導入時のT細胞数×おけるBCMA-CAR+またはNIS+ T細胞の割合×/体積(1)
  5. レンチウイルスとNISの形質導入+BCMA-CAR T細胞拡張
    1. T細胞刺激の24〜48時間後に、刺激されたT細胞に対してレンチウイルス形質導入を行う(T細胞はクラスターを形成するべきである)。
      1. CARまたはNISをコードする凍結レンチウイルスを4°Cで解凍する。
      2. 刺激したT細胞をよく混ぜてクラスターを分解し、感染多重度(MOI)が5.0の(1.0×106 個のT細胞を形質導入する場合、5.0×106 個のレンチビロンを使用する)で解凍したばかりのウイルスを加えるだけです。形質導入細胞を37°C、5%CO2でインキュベートする。
      3. 3日目、4日目、および5日目に、血液細胞計37または完全自動細胞カウンター38を使用して形質導入T細胞をカウントし、新鮮な予め加温されたTCMを加えて細胞濃度を1.0×106 細胞/ mLに調整する。ピューロマイシン耐性遺伝子を有するNIS形質導入T細胞の場合、3日目、4日目、および5日目に1μg/mLのピューロマイシン二塩酸塩で細胞を処理する。
    2. 6日目に、T細胞クラスターを分解するためによく混合し、それらを磁石に1分間置くことによって、形質導入されたT細胞から抗CD3/CD28ビーズを(ステップ1.3.4から)除去する。次いで、回収した形質導入T細胞を1.0×106 細胞/mLの濃度で培養物に戻すだけである。T細胞からビーズを除去した後、フローサイトメトリーによりCARおよびNISの発現を評価する。
      注:BCMA-CARの一本鎖可変断片はマウス由来であるため、Alexa Fluor 647と結合させたヤギ抗マウスIgG(H+L)で染色することができます。NISは、抗ヒトETNL[aa625-643(SWTPCVGHDGGRDQQETNL)に対応する合成ペプチド]を用いて検出することができる。この抗体は、NISの細胞質ゾルC末端を認識する。したがって、T細胞は、抗ヒトNIS抗体とのインキュベーション前に透過処理されなければならない。
    3. ヤギ抗マウスIgG(H+L)を用いてBCMA-CARの表面染色を行う。
      1. 培養物のアリコート(例えば、50,000個のT細胞)を採取し、フローバッファー(PBS、1%FBS、および1%アジ化ナトリウム)で洗浄する。次に、細胞を50 μLのフローバッファーで再懸濁し、CAR発現を検出するためのヤギ抗マウス抗体1 μLおよび死細胞を除くための0.3 μLの生死アクアで細胞を染色する。
      2. RTにて暗所で15分間インキュベートし、150μLのフローバッファーを加えて細胞を洗浄し、650 × g で細胞を4°Cで3分間遠心分離した。
    4. 表面CAR染色後、100 μLの固定培地(PBSと4.21%ホルムアルデヒド)を加えて細胞を固定および透過処理し、4°Cで20分間インキュベートします。 サポニンなどの細胞透過処理剤を含む緩衝液100 μL(650 × g 、4°Cで3分間)で細胞を2回洗浄する。
    5. 固定/透過処理した細胞を50 μLの透過処理バッファーに再懸濁します。次いで、50 μLのフローバッファーに0.3 ngの抗ヒトETNL NIS抗体を添加し、4°Cで1時間インキュベートする。
    6. 150 μLのフローバッファーを加え、650 × g で細胞を4°Cで3分間遠心分離した。 50 μLのフローバッファー中の2.5 μLの抗ウサギ二次抗体と共に細胞を4°Cで30分間インキュベートし、150 μLのフローバッファーを加えて細胞を洗浄し、650 × g で4°Cで3分間遠心分離した。
    7. 最後に、200 μLのフローバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを実行して形質導入効率を測定します(図3A、B)。
    8. 8日目に、T細胞を300 × g でカウントし、4°Cで8分間スピンダウンした。 T細胞を凍結培地(90%FBS+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])で10×106/mLの濃度で再懸濁し、次いで標識クライオビアにそれぞれ1mLを移す。
    9. バイアルを-80°Cの冷凍庫に48時間置く。48時間後(および10日目までに)、T細胞を液体窒素に移す。
      メモ: NIS+ CAR T セル生産の概要については、図 1 を参照してください。図3Dは、3つの異なるドナーからのエキソビボT細胞増殖の例を表す。

2. NIS+ BCMA-CAR T細胞イメージング [ 18F]TFB-PETスキャン

注:このプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC A00001767-16)、IRB、およびIBC(Bios00000006.04)のガイドラインに従います。OPM-2はBCMA+ MM細胞株であり、BCMA-CAR T細胞の標的細胞株としてよく用いられる39,40。

  1. ルシフェラーゼ+ BCMA+ OPM-2細胞を樹立する。
    1. 組織培養処理した24ウェルプレートに500,000個のOPM-2細胞をシードする。ルシフェラーゼ-GFPをコードするレンチウイルスを4°Cで解凍する。
    2. 解凍したばかりのウイルスをMOI3.0でOPM-2細胞に加え、ピペッティングでよく混ぜる。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。
    3. 形質導入から48時間後、2μg/mLのピューロマイシンを加えて形質導入細胞を選択する。形質導入の4日後、GFP陽性細胞(ルシフェラーゼ陽性)をフローサイトメトリーにより評価する(図3E)。
  2. BCMA+ OPM-2異種移植マウスモデルを確立する(図4)。
    1. ルシフェラーゼ+ OPM-2細胞を数え、それらを2回スピンダウンしてすべての細胞培養培地を除去します。OPM-2細胞をPBSで10×106 細胞/mLの濃度で再懸濁する。
    2. -21日目に、8~12週齢の免疫不全NOD-scid IL2rγnull(NSG)マウスの尾部に100 μL(1.0 × 106細胞)のルシフェラーゼ+OPM-2細胞を注射します(図4)。
    3. OPM-2細胞注射後20日目(CAR T細胞注射の-1日目)に、生物発光イメージング(BLI)を介して腫瘍量を確認する(図4)。
      注:OPM-2細胞は増殖の遅い腫瘍を形成し、生着には通常2〜3週間かかります。
    4. OPM-2異種移植片マウスに10 μL/gのD-ルシフェリンを腹腔内(IP)注射で投与する。10分後、2%イソフルランガス下でマウスにBLIを行う(図5A)。腫瘍生着を確認した後、腫瘍量に応じてマウスを無作為化する。
    5. CAR T細胞注入の-1日目に、NIS+BCMA-CAR T細胞を解凍し、遠心分離(300× g、8分間、4°C)により凍結培地を除去した。その後、TCMで細胞を再懸濁し、2.0×106 細胞/mLで一晩インキュベートする(37°C、5%CO2)。
    6. 0日目に、NIS+BCMA-CAR T細胞(300× g、8分、4°C)を数えて遠心分離する。NIS+BCMA-CAR T細胞をPBSで50×106 細胞/mLで再懸濁する。
    7. 100 μL (5.0 × 106 細胞) の NIS+BCMA-CAR T 細胞を尾静脈注射で OPM-2 異種移植片マウスに投与する。7日目および15日目に、PETスキャンを用いてマウスを画像化する。
  3. NIS+BCMA-CAR T細胞 のインビボイメージングは 、BCMA+OPM-2異種移植マウスモデルを用いた。
    1. イメージングの前にマウスの体重を量り、金属関連のアーチファクトを排除するために金属製のイヤータグをすべて取り外します。
    2. 前述のように[18F]TFBを準備します41。
      注: [18F]TFB は、その使用日に製造する必要があります。放射化学的純度は>99%で、モル活性>5GBq/mmolでなければなりません。
    3. 9.25MBq [18F]TFBを尾静脈注射で静脈内注射する。放射性トレーサーが体内に分布し、血液をきれいにするために〜40分の取り込み期間を許容する。
    4. イソフルラン吸入(2%)を用いてマウスを麻酔する。
      注:イソフルランは、迅速かつ信頼性の高い発症および回復を有するため、好ましい吸入麻酔薬である。
    5. マウスを麻酔する前に、消毒剤クリーナーで麻酔装置のすべての表面を清掃してください。
    6. マウスを誘導チャンバー内に置きます。気化器のダイヤルを2%に回し、マウスが1〜2分以内に横曲げられて応答しなくなるのを待ちます。
    7. 不十分な麻酔または呼吸機能の過度のうつ病を避けるために、マウスを監視します。簡単に言えば、不十分な麻酔を確認するためにつま先をつまむ。
      注:通常の呼吸数は最大180 /分で、許容可能な落下率は50%です。
    8. 角膜乾燥や外傷を避けるために眼科軟膏を塗布する。
    9. マイクロPET/CTイメージングワークステーションで麻酔をかけられたマウスで注射後45分後にPET/CT画像を取得します( 材料表を参照)。次に、静的PET画像を15分間取得した後、500μA、80keV、および200ms露光で360°回転および180投影で5分間CT画像を取得しました。
  4. 取得した画像データの解析
    1. PET画像処理ソフトウェアを使用して画像を解析します(図5B および 補足ビデオS1)。
    2. 対象ボリューム (VOI) を定義します。
    3. 式(2)を用いて標準化された取り込み値(SUV)を計算する。
      VOI中のSUV = 体重(g)×のVOI中の活性濃度(MBq/mL)/投与用量(MBq)(2)
  5. フローサイトメトリーによる腫瘍部位へのNIS+BCMA-CAR T細胞トラフィッキングの確認
    1. [18F]TFB-PETイメージング後、マウスをケージに戻します。麻酔を止めた後、動物が意図的な動きができるようになるまで動物を監視し、彼らが食物と水にアクセスできることを確認してください。
    2. 注射された[18F]TFBの崩壊までマウスをモニターする。放射性同位元素が検出できなくなったら、マウスをCO2で安楽死させます。
    3. 安楽死させるには、マウスをケージに入れます(ケージあたり5匹以下)。
    4. 約5〜10分で呼吸が完全に停止するまで、マウスをCO2 にさらします。
      注:この安楽死方法は、動物の安楽死のためのAVMAガイドライン(2020年版)と一致していなければなりません。
    5. マウスの死を確実にするために、動物の後頭部および尾の付け根をつかみ、次に手を互いに引き離す/離すことによって子宮頸部脱臼を行う。
    6. 骨髄を採取して、NIS+BCMA-CAR T細胞が腫瘍部位に効率的に輸送することを確認します。
    7. 回収した大腿骨および脛骨を、5mLの細胞培養培地を含む6ウェルプレートに移す。大腿骨と脛骨から筋肉と腱を取り除き、大腿骨と脛骨の両端(関節の上)を切るだけです。
    8. インスリンシリンジに細胞培養培地を充填し、骨髄を6ウェルプレート上に流す。大腿骨の場合は、大腿骨の直径が脛骨の直径よりも大きいため、22G針と5mLシリンジを使用してください。
    9. プランジャーの平らな端を使用して骨髄を粉砕します。滅菌した50mL円錐管上に70μmのセルストレーナーを置き、粉砕骨髄を濾過した。次いで、チューブをフローバッファーで満たし、チューブを300× g で4°Cで8分間遠心分離した。
    10. 上清を吸引し、5mLのフローバッファーで骨髄を再懸濁した。200 μLの骨髄を96ウェルプレートに移す。プレートを300 × g で4°Cで3分間遠心分離する。 上清をデカントし、50 μLのフローバッファーで細胞を再懸濁した。
    11. 0.25 μgのマウスCD45、0.03 μgのヒトCD45、0.06 μgのヒトCD3、0.24 μgのヒトBCMA、および0.3 μLの生/死水蘇に対するフロー抗体で骨髄を染色する。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
    12. プレートを300 × g で4°Cで3分間遠心分離する。 次に、200 μLのフローバッファーを添加し、フローサイトメーター上で実行します(図5C)。

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結果

図 1 は、NIS+BCMA-CAR T セルを生成するステップを表しています。0日目に、PBMCを単離し、次いで陰性選択によってT細胞を単離する。次に、抗CD3/CD28ビーズでT細胞を刺激する。1日目に、NISおよびBCMA-CARレンチウイルスの両方でT細胞を形質導入する。3日目、4日目、および5日目に、T細胞を数え、培地を投与して濃度を1.0×106/mLになるように調整した。NIS形質?...

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ディスカッション

本稿では、NISをCAR T細胞に組み込んで、[18F]TFB-PETを介してインビボで注入したCAR T細胞をイメージングするための方法論について説明する。概念実証として、NIS+BCMA-CAR T細胞は二重形質導入によって作製された。我々は最近、NISをCAR T細胞に組み込んでも、生体内でのCAR T細胞の機能や有効性を損なうことはなく、CAR T細胞の輸送と拡大を可能にすることを報告しま...

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開示事項

SSKは、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティス間の契約を通じて)とメッタフォージ(メイヨークリニックを通じて)にライセンス供与されたCAR免疫療法の特許の発明者です。RS、MJC、およびSSKは、Humanigenにライセンス供与されているCAR免疫療法の分野における特許の発明者です。SSKは、カイト、ギリアド、ジュノ、セルジーン、ノバルティス、フマニゲン、モルフォシス、トレロ、スネシス、リーラブス、レンティゲンから研究資金を受けています。図は BioRender.com で作成されました。

謝辞

この研究は、Mayo Clinic K2Rパイプライン(SSK)、Mayo Clinic Center for Individualized Medicine(SSK)、Predolin Foundation(RS)を通じて部分的に支援されました。図 1、2、および 4 は、BioRender.com を使用して作成しました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

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