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Resumen

Este protocolo describe la metodología para el seguimiento no invasivo de células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos in vivo con una plataforma clínicamente disponible.

Resumen

Las células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígeno quimérico (CAR) han mostrado resultados sin precedentes en ensayos clínicos fundamentales para pacientes con neoplasias malignas de células B o mieloma múltiple (MM). Sin embargo, numerosos obstáculos limitan la eficacia y prohíben el uso generalizado de terapias de células T con CAR debido al tráfico deficiente y la infiltración en los sitios tumorales, así como la falta de persistencia in vivo. Además, las toxicidades potencialmente mortales, como el síndrome de liberación de citoquinas o la neurotoxicidad, son las principales preocupaciones. La obtención de imágenes y el seguimiento eficientes y sensibles de las células T con CAR permiten la evaluación del tráfico, la expansión y la caracterización in vivo de las células T con T y permiten el desarrollo de estrategias para superar las limitaciones actuales de la terapia con células T con CAR. Este artículo describe la metodología para incorporar el simportador de yoduro de sodio (NIS) en células T CAR y para imágenes de células T CAR utilizando tomografía por emisión de tetrafluoroborato-positrón [18F] ([18F]TFB-PET) en modelos preclínicos. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones CAR y genes diana además de los utilizados para este estudio.

Introducción

La terapia con células T (CAR T) receptoras de antígeno quimérico es un abordaje rápidamente emergente y potencialmente curativo en neoplasias hematológicas malignas1,2,3,4,5,6. Se informaron resultados clínicos extraordinarios después de la terapia con células T CAR T (CART19) dirigida por CD19 o antígeno de maduración de células B (BCMA)CAR2. Esto llevó a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) a la aprobación de células CART19 para el linfoma agresivo de células B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 y lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblástica aguda (Tisa-Cel)5,8, linfoma de células del manto (brexucabtagene autoleuce)9 y linfoma folicular (Axi-Cel)10 . Más recientemente, la FDA aprobó la terapia de células T CAR dirigida por BCMA en pacientes con mieloma múltiple (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Además, la terapia de células T con CAR para la leucemia linfocítica crónica (LLC) se encuentra en etapa tardía de desarrollo clínico y se espera que reciba la aprobación de la FDA en los próximos tres años1.

A pesar de los resultados sin precedentes de la terapia de células T con CAR, su uso generalizado está limitado por 1) la insuficiente expansión in vivo de las células T con CAR o el tráfico deficiente a los sitios tumorales, lo que conduce a tasas más bajas de respuesta duradera12,13 y 2) el desarrollo de eventos adversos potencialmente mortales, incluido el síndrome de liberación de citoquinas (SRC)14,15 . Las características distintivas del SRC incluyen no solo la activación inmune que resulta en niveles elevados de citoquinas / quimiocinas inflamatorias, sino también la proliferación masiva de células T después de la infusión de células T con CAR15,16. Por lo tanto, el desarrollo de una estrategia validada de grado clínico para obtener imágenes de células T CAR in vivo permitiría 1) el seguimiento de células T CAR en tiempo real in vivo para monitorear su tráfico a sitios tumorales y descubrir posibles mecanismos de resistencia, y 2) monitorear la expansión de células T CAR y potencialmente predecir sus toxicidades, como el desarrollo de CRS.

Las características clínicas del SRC leve son fiebre alta, fatiga, dolor de cabeza, erupción cutánea, diarrea, artralgia, mialgia y malestar general. En el SRC más grave, los pacientes pueden desarrollar taquicardia/hipotensión, fuga capilar, disfunción cardíaca, insuficiencia renal/hepática y coagulación intravascular diseminada17,18. En general, se ha demostrado que el grado de elevación de las citoquinas, incluyendo interferón-gamma, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, interleucina (IL)-10 e IL-6, se correlaciona con la gravedad de los síntomas clínicos17,19. Sin embargo, la aplicación extensiva de monitoreo de citoquinas séricas "en tiempo real" para predecir CRS es difícil debido al alto costo y la disponibilidad limitada. Para explotar las características beneficiosas de la terapia de células T con CAR, las imágenes no invasivas de las células T adoptivas se pueden utilizar potencialmente para predecir la eficacia, las toxicidades y la recaída después de la infusión de células T con CAR.

Varios investigadores han desarrollado estrategias para utilizar imágenes basadas en radionúclidos con tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), que proporciona alta resolución y alta sensibilidad20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 para el visualización y monitoreo in vivo del tráfico de células T CAR. Entre esas estrategias de imagen basadas en radionúclidos, se ha desarrollado el simportador de yoduro de sodio (NIS) como una modalidad sensible para obtener imágenes de células y virus mediante tomografías PET31,32. Las imágenes de células T NIS+CAR con [18F]TFB-PET son una tecnología sensible, eficiente y conveniente para evaluar y diagnosticar la expansión, el tráfico y la toxicidad de las células T CAR30. Este protocolo describe 1) el desarrollo de células T NIS+CAR a través de la transducción dual con alta eficacia y 2) una metodología para obtener imágenes de células T NIS+CAR con [18F]TFB-PET. Las células T BCMA-CAR para MM se utilizan como un modelo de prueba de concepto para describir NIS como un reportero para imágenes de células T CAR. Sin embargo, estas metodologías se pueden aplicar a cualquier otra terapia de células T con CAR.

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Protocolo

El protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic, el Comité Institucional de Bioseguridad y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.

1. Producción de células T NIS+ BCMA-CAR

NOTA: Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic (IRB 17-008762) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC Bios00000006.04).

  1. Producción de lentivirus que codifican BCMA-CAR, NIS y proteína fluorescente verde luciferasa (GFP).
    NOTA: Un constructo BCMA-CAR de segunda generación fue sintetizado de novo (ver la Tabla de Materiales) y clonado en un vector lentiviral de tercera generación bajo el control de un promotor del factor de elongación-1 alfa (EF-1α). El constructo BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) incluyó la coestimulación 4-1BB y un fragmento variable de cadena única (scFv) derivado de un clon de anticuerpo BCMA antihumano C11D5.333,34. El NIS está bajo el control del promotor EF-1α y se une al gen de resistencia a la puromicina a través de péptidos autoescindidos (P2A). El vector lentiviral que codifica la luciferasa-GFP (ver la Tabla de Materiales) se utiliza para transducir células tumorales, que luego expresan GFP y luciferasa.
    1. Preparar plásmidos vectores lentivirales: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) y pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro y pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contienen el gen de resistencia a la puromicina. Por lo tanto, las células transducidas por NIS o luciferasa GFP se pueden seleccionar con 1 μg/mL o 2 μg/mL de diclorhidrato de puromicina, como se describió anteriormente14,35.
    2. Sembra 20 × 106 de 293T células en un matraz T175 e incubar durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2. Confirme que las células 293T se distribuyen uniformemente en el matraz al 70-90% de confluencia mediante visualización directa bajo el microscopio.
    3. Prepare una mezcla maestra de 15 μg del vector de expresión (por ejemplo, CAR, NIS o ADN lineal luciferasa-GFP), 7 μg del vector de envoltura (VSV-G) y 18 μg del vector de empaquetamiento (gag, pol, rev y tat). Diluya la mezcla maestra de ADN en 4,5 ml del medio de transfección y luego agregue 111 μL del reactivo precomplejante (mezcla A).
    4. Preparar un nuevo tubo y diluir 129 μL del reactivo de transfección liposomal en 4,5 ml del medio de transfección (Mezcla B).
    5. Combine las mezclas A y B y mueva el tubo para mezclar el contenido. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    6. Después de la incubación, simplemente aspire el sobrenadante celular sin separar las células y agregue 16 ml de un medio de crecimiento que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina. Luego, agregue la mezcla de mezclas A y B en las celdas 293T gota a gota. Finalmente, incubar las células transfectadas a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h.
    7. En los días 1 y 2 después de la transfección, cosecha el sobrenadante de 293T, gira a 900 × g durante 10 min y filtra a través de un filtro de nylon de 0,45 μm. Concentrar el filtrado a 24 y 48 h por ultracentrifugación a 112.700 × g durante 2 h, y congelar a -80 °C.
  2. Ex-vivo Aislamiento de células T (Figura 1)
    NOTA: Realizar todos los trabajos de cultivo celular en un gabinete de flujo laminar utilizando técnica aséptica y equipo de protección personal. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se extraen de sangre sana de donantes voluntarios recolectada durante la aféresis36. El cribado de patógenos se realizó en células humanas utilizadas en este estudio.
    1. Utilice la técnica de gradiente de densidad estándar para aislar pbMC.
      1. Agregue suavemente 15 ml de medio de gradiente de densidad (densidad de 1.077 g/mL) (que contenga alfa-D-glucopiranosido, homopolímero de beta-D-fructofuranosil y, 3-(acetilamino)-5-(acetilmetilamino)-2,4,6-triodobenzoico ácido monosódico) a un tubo de separación de gradiente de densidad de 50 ml sin crear burbujas de aire (consulte la Tabla de materiales).
      2. Para evitar la captura celular, diluya la muestra de sangre con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,2 g/L de cloruro de potasio, 0,2 g/L de fosfato de potasio monobásico, 8 g/L de cloruro de sodio y 1,15 g/L de fosfato de sodio dibásico) que contenga 2% de FBS en una relación de volumen de 1:1. Transfiera suavemente la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad sin romper la interfaz entre los dos. Gira hacia abajo a 1.200 × g durante 10 min en RT.
        NOTA: Se puede utilizar un tubo de separación de gradiente de densidad de 50 ml para el aislamiento de 4-17 ml de una muestra de sangre. El tubo de separación de gradiente de densidad de 50 ml (consulte la Tabla de materiales) utilizado en este protocolo no requiere el "freno apagado" durante la centrifugación. Sin embargo, cuando se utilizan tubos estándar de 50 ml, el freno debe estar apagado y requiere una centrifugación de 30 minutos.
      3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml, lave con PBS + 2% FBS llenando hasta 50 ml y luego gire hacia abajo a 300 × g durante 8 minutos en RT.
      4. Aspirar el sobrenadante, y resuspendir las células peletizadas en 50 mL de PBS + 2% FBS. Cuente el número de células y luego gire hacia abajo a 300 × g durante 8 minutos en RT. Repita el paso anterior para un total de 2 lavados.
    2. Aspirar el sobrenadante y resuspendir las células peletizadas a una concentración de 50 × 106 células/ml con PBS + 2% FBS.
    3. Realice el aislamiento de células T de PBMC utilizando un kit de cuentas magnéticas de selección negativa.
      NOTA: Un kit de selección negativa ideal incluye perlas magnéticas unidas a anticuerpos contra antígenos expresados en células distintas de las células T. Un kit de uso común contiene anticuerpos conjugados a perlas magnéticas contra CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 y CD16 (consulte la Tabla de materiales).
      1. Transfiera PBMC a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 14 ml. Luego, coloque los PBMC y el cóctel de anticuerpos de selección negativa en un separador celular totalmente automatizado y realice el aislamiento de células T de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. Estimulación de células T y expansión de células T (Figura 1)
    1. Para cultivar las células T aisladas, prepare el medio de expansión de células T (MTC) hecho con un medio de células hematopoyéticas sin suero suplementado con 10% de albúmina sérica humana y 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina14. Después del aislamiento de células T, cuente las células y el cultivo a una concentración de 2 × 106 células/ml con MTC.
    2. Lave las perlas anti-CD3/CD28 tres veces con MTC antes de cultivarlas con células T.
      1. Mezcle el vial que contiene las perlas girando. Luego, pipetee el volumen requerido de perlas (3: 1 cuentas: célula) (por ejemplo, cuando estimule 1.0 × 106 células de células T, use 3.0 × 106 de perlas anti-CD3 / CD28) en un tubo de microcentrífuga estéril (1.5 ml) y resuspenda en 1 ml de MTC.
    3. Coloque el tubo de la microcentrífuga con las perlas en un imán durante 1 minuto y aspire el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas lavadas en 1 ml de MTC. Repita los dos pasos anteriores para un total de 3 lavados.
    4. Resuspend las perlas en 1 mL de MTC y transfiéralas a las células T. Luego, diluya las células T a una concentración final de 1.0 × 106 células / ml con MTC. Transfiera la suspensión de células T/perlas a una placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos y colóquela en la incubadora (37 °C, 5% de CO2).
  4. Titulación de lentivirus (Figura 2)
    1. Prepare las células T para el ensayo de titulación. Asegúrese de que aproximadamente 1.0 x 106 células estén disponibles para valorar un tipo de virus.
    2. Estimular los linfocitos T descritos en la sección 1.3.2.
    3. La placa 1.0 × 105 células de células T estimuladas en una placa de 96 pocillos (placa de título) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h (Figura 2A). Aislar y estimular las células T como se describe en la sección 1.2.
    4. Preparar una placa de dilución (placa de 96 pocillos) añadiendo 100 μL de MTC en los pocillos de las columnas designadas y los pozos de control no transducidos (Figura 2B).
    5. Descongele un vial de partículas lentivirales en hielo y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Transferir 50 μL del sobrenadante del virus a los pocillos de la columna 6 de la placa de 96 pocillos (dilución 3) (Figura 2B). Pipeta arriba y abajo para mezclar bien.
    6. Realizar diluciones en serie (dilución en serie 2 veces): transfiera 50 μL del pozo A6 al pozo B6 y luego 50 μL del pozo B6 al pozo C6; repetir hasta G6. Luego, agregue 50 μL del virus diluido a la placa de título (Figura 2B).
    7. Incubar la placa de título a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h, y determinar los porcentajes de células CAR-, NIS-, o GFP-positivas por citometría de flujo (Figura 2C).
      1. Lave los pocillos girando la placa de título dos veces a 650 × g a 4 °C durante 3 min.
      2. Teñir las células T transducidas como se describe en los pasos 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determine los títulos en función de los porcentajes de células CAR, NIS o GFP positivas mediante la fórmula (1):
        Títulos = Porcentaje de células T BCMA-CAR+ o NIS+ × recuento de células T en la transducción × la dilución / volumen específico (1)
  5. Transducción de lentivirus y NIS+Expansión de células T BCMA-CAR
    1. Veinticuatro a 48 h después de la estimulación de las células T, realice la transducción lentiviral en las células T estimuladas (las células T deben formar grupos).
      1. Descongelar los lentivirus congelados que codifican CAR o NIS a 4 °C.
      2. Mezcle bien las células T estimuladas para romper los grupos, y simplemente agregue el virus recién descongelado a una multiplicidad de infección (MOI) de 5.0 (al transducir 1.0 × 106 células T, use 5.0 × 106 de lentivirons). Incubar las células transducidas a 37 °C, 5% CO2.
      3. En los días 3, 4 y 5, cuente las células T transducidas utilizando un hematocitómetro37 o un contador celular totalmente automatizado38 y ajuste la concentración celular a 1.0 × 106 células / ml agregando MTC fresca y precalentada. Para las células T transducidas por NIS que portan el gen de resistencia a la puromicina, trate las células con 1 μg/ml de diclorhidrato de puromicina en los días 3, 4 y 5.
    2. El día 6, retire las perlas anti-CD3 / CD28 de las células T transducidas (del paso 1.3.4) mezclándolas bien para romper los grupos de células T y colocándolas en un imán durante 1 minuto. Luego, simplemente coloque las células T transducidas recolectadas en cultivo a una concentración de 1.0 × 106 células / ml. Después de eliminar las perlas de las células T, evalúe la expresión de CAR y NIS por citometría de flujo.
      NOTA: Como el fragmento variable de cadena única del BCMA-CAR se deriva del ratón, se puede teñir con IgG (H + L) anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647. El NIS se puede detectar utilizando ETNL antihumano [péptido sintético correspondiente a aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Este anticuerpo reconoce el extremo C citosólico del NIS. Por lo tanto, las células T deben ser permeabilizadas antes de la incubación con un anticuerpo NIS anti-humano.
    3. Realizar tinción superficial de BCMA-CAR utilizando IgG anti-ratón de cabra (H+L).
      1. Tome una alícuota del cultivo (por ejemplo, 50,000 células T) y lávese con tampón de flujo (PBS, 1% FBS y 1% de azida de sodio). A continuación, resuspend las células con 50 μL de tampón de flujo y tiñe las células con 1 μL de anticuerpo anti-ratón de cabra para detectar la expresión de CAR y 0,3 μL de agua muerta viva para excluir las células muertas.
      2. Incubar durante 15 min en la oscuridad a RT, lavar las células añadiendo 150 μL de tampón de flujo y centrifugar las células a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
    4. Después de la tinción de CAR superficial, fije y permeabilice las células agregando 100 μL de medio de fijación (PBS con 4.21% de formaldehído) e incube durante 20 min a 4 ° C. Lave las células dos veces con 100 μL de un tampón que contenga un agente permeabilizante celular como la saponina (650 × g durante 3 min a 4 °C).
    5. Resuspend las células fijas/permeabilizadas en 50 μL de un tampón permeabilizante. Luego, agregue 0.3 ng de anticuerpo ETNL NIS antihumano en 50 μL de tampón de flujo e incube durante 1 h a 4 ° C.
    6. Añadir 150 μL de tampón de flujo y centrifugar las células a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Incubar las células con 2,5 μL de anticuerpo secundario anti-conejo en 50 μL de tampón de flujo durante 30 min a 4 °C, lavar las células añadiendo 150 μL de tampón de flujo y centrifugar a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
    7. Finalmente, resuspende en 200 μL de tampón de flujo y realice citometría de flujo para determinar la eficiencia de transducción (Figura 3A, B).
    8. El día 8, cuente y gire hacia abajo las células T a 300 × g durante 8 min a 4 ° C. Resuspend las células T con medio de congelación (90% FBS + 10% dimetilsulfóxido [DMSO]) a una concentración de 10 × 106/mL, luego transfiera 1 mL cada uno a crioviales marcados.
    9. Coloque los viales en un congelador de -80 °C durante 48 h. Después de 48 h (y para el día 10), transfiera las células T a nitrógeno líquido.
      NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener información general sobre la producción de células T NIS+ CAR. La figura 3D representa ejemplos de expansión de células T ex vivo de tres donantes diferentes.

2. Imágenes de células T NIS+ BCMA-CAR con [ 18F]TFB-PET

NOTA: Este protocolo sigue las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 es una línea celular BCMA+ MM, que a menudo se utiliza como línea celular objetivo para las células T BCMA-CAR39,40.

  1. Establecer células luciferasa+ BCMA+ OPM-2.
    1. Sembrar 500,000 células OPM-2 en una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos. Lentivirus de deshielo que codifica luciferasa-GFP a 4 °C.
    2. Agregue el virus recién descongelado a un MOI de 3.0 a las células OPM-2 y mezcle bien mediante pipeteo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, 5% co2).
    3. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, añadir 2 μg/ml de puromicina para seleccionar las células transducidas. Cuatro días después de la transducción, evaluar las células GFP positivas (luciferasa positiva) mediante citometría de flujo (Figura 3E).
  2. Establecer modelos de ratón de xenoinjerto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Cuente las células luciferasa + OPM-2 y hágalas girar dos veces para eliminar todo el medio de cultivo celular. Resuspend las células OPM-2 a una concentración de 10 × 106 células/ml con PBS.
    2. En el día -21, inyecte 100 μL (1,0 × 106 células) de células luciferasa + OPM-2 en la cola de ratones NOD-scid IL2rγnull (NSG) inmunocomprometidos de 8 a 12 semanas de edad (Figura 4).
    3. El día 20 después de la inyección de células OPM-2 (día -1 de la inyección de células T con CAR), compruebe la carga tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) (Figura 4).
      NOTA: Las células OPM-2 forman un tumor de crecimiento lento, que generalmente tarda de 2 a 3 semanas en injertarse.
    4. Administrar 10 μL/g de D-luciferina a ratones xenoinjertos OPM-2 mediante inyección intraperitoneal (IP). Después de 10 min, realice BLI en los ratones con un 2% de gas isoflurano (Figura 5A). Después de confirmar el injerto tumoral, aleatorice a los ratones de acuerdo con la carga tumoral.
    5. En el día -1 de la inyección de células T CAR, descongele las células T NIS+BCMA-CAR y retire el medio de congelación por centrifugación (300 × g, 8 min, 4 °C). Luego, las células resuspend con MTC a 2.0 × 106 células / ml e incuban durante la noche (37 ° C, 5% CO2).
    6. El día 0, contar y centrifugar las células T NIS+BCMA-CAR (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspend las células T NIS+BCMA-CAR a 50 × 106 células/ml con PBS.
    7. Administrar 100 μL (5,0 × 106 células) de células T NIS+BCMA-CAR mediante inyección en la vena de la cola a los ratones xenoinjertos OPM-2. En los días 7 y 15, tome imágenes de los ratones con una tomografía por emisión de positrones.
  3. Imágenes in vivo de células T NIS+BCMA-CAR utilizando el modelo de ratón xenoinjerto BCMA+OPM-2.
    1. Pese los ratones antes de la toma de imágenes y retire las marcas metálicas para eliminar los artefactos relacionados con el metal.
    2. Prepare [18F]TFB como se describió anteriormente41.
      NOTA: [18F]TFB debe producirse el día de su uso. La pureza radioquímica debe ser del >99% y la actividad molar >5 GBq/mmol.
    3. Inyecte 9.25 MBq [18F]TFB por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola. Permita un período de absorción de ~ 40 minutos para que el radiotrazador se distribuya en el cuerpo y limpie la sangre.
    4. Anestesiar al ratón mediante inhalación de isoflurano (2%).
      NOTA: El isoflurano es el anestésico inhalado preferido, ya que tiene un inicio y una recuperación rápidos y confiables.
    5. Antes de anestesiar al ratón, limpie todas las superficies de la máquina de anestesia con limpiadores desinfectantes.
    6. Coloque el ratón dentro de la cámara de inducción. Gire el dial del vaporizador al 2% y espere a que el mouse se recueste y no responda en 1-2 minutos.
    7. Controle al ratón para evitar anestesia insuficiente o depresión excesiva de las funciones respiratorias. En resumen, pellizque el dedo del pie para confirmar la anestesia insuficiente.
      NOTA: La frecuencia respiratoria normal es de hasta 180 / min, y la tasa de caída aceptable es del 50%.
    8. Aplique ungüento oftálmico para evitar el secado corneal y el trauma.
    9. Adquiera imágenes pet/ct 45 min después de la inyección con el ratón anestesiado en una estación de trabajo de imágenes micro PET/CT (consulte la Tabla de materiales). A continuación, adquiera imágenes PET estáticas durante 15 minutos, seguidas de adquisición de imágenes por TC durante 5 minutos con rotación de 360 ° y 180 proyecciones a 500 μA, 80 keV y 200 ms de exposición.
  4. Análisis de datos de imágenes adquiridos
    1. Analice las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes PET (Figura 5B y Video Suplementario S1).
    2. Definir el volumen de interés (VOI).
    3. Calcular el valor de absorción estandarizado (SUV) utilizando la fórmula (2).
      SUV en VOI = Concentración de actividad en VOI (MBq/mL) × peso corporal (g) / dosis administrada (MBq) (2)
  5. Confirmación del tráfico de células T NIS+BCMA-CAR a los sitios tumorales con la citometría de flujo
    1. Después de las imágenes [18F]TFB-PET, coloque al ratón de nuevo en la jaula. Después del cese de la anestesia, controle a los animales hasta que sean capaces de moverse con propósito y asegúrese de que tengan acceso a alimentos y agua.
    2. Monitoree a los ratones hasta la descomposición del [18F]TFB inyectado. Una vez que el radioisótopo no es detectable, sacrificar a los ratones con CO2.
    3. Para la eutanasia, coloque a los ratones en la jaula (no más de 5 ratones por jaula).
    4. Exponga a los ratones al CO2 hasta el cese completo de la respiración en aproximadamente 5-10 minutos.
      NOTA: Este método de eutanasia debe ser consistente con las Directrices AVMA para la Eutanasia de Animales (Edición 2020).
    5. Para asegurar la muerte de los ratones, realice la dislocación cervical agarrando la parte posterior de la cabeza y la base de la cola del animal, luego separe / aleje las manos entre sí.
    6. Recolecte la médula ósea para confirmar que las células T NIS + BCMA-CAR trafican eficientemente al sitio del tumor.
    7. Transfiera los fémures y la tibia cosechados a una placa de 6 pocillos que contenga 5 ml de medio de cultivo celular. Retire los músculos y tendones de los fémures y la tibia, y simplemente corte ambos extremos (por encima de las articulaciones) de los fémures y la tibia.
    8. Llene una jeringa de insulina con el medio de cultivo celular y enjuague la médula ósea en la placa de 6 pocillos. Para los fémures, use agujas de 22 G y jeringas de 5 ml porque el diámetro del fémur es mayor que el de la tibia.
    9. Use el extremo plano del émbolo para moler la médula ósea. Coloque un colador de células de 70 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml y filtre la médula ósea molida. Luego, llene el tubo con el tampón de flujo y centrífique el tubo a 300 × g durante 8 min a 4 ° C.
    10. Aspirar el sobrenadante y resuspend la médula ósea con 5 ml de tampón de flujo. Transfiera 200 μL de médula ósea a una placa de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 300 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspend las células con 50 μL de tampón de flujo.
    11. Teñir la médula ósea con anticuerpos de flujo contra 0,25 μg de CD45 de ratón, 0,03 μg de CD45 humano, 0,06 μg de CD3 humano, 0,24 μg de BCMA humano y 0,3 μL de agua viva/muerta. Incubar la placa durante 15 min a RT en la oscuridad.
    12. Centrifugar la placa a 300 × g durante 3 min a 4 °C. Luego, agregue 200 μL de tampón de flujo y ejecútese en el citómetro de flujo (Figura 5C).

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Resultados

La Figura 1 representa los pasos para generar células T NIS+BCMA-CAR. El día 0, aísle los PBMC y luego aísle las células T por selección negativa. Luego, estimule las células T con perlas anti-CD3 / CD28. El día 1, transduzca células T con lentivirus NIS y BCMA-CAR. En los días 3, 4 y 5, cuente las células T y alimente con medios para ajustar la concentración a 1.0 × 106 / ml. Para las células T transducidas por NIS, agregue 1 μg/ml de puromicina para sel...

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Discusión

Este artículo describe una metodología para incorporar NIS en células T CAR e imágenes de células T CAR infundidas in vivo a través de [18F]TFB-PET. Como prueba de concepto, las células T NIS+BCMA-CAR se generaron a través de la transducción dual. Recientemente hemos informado que la incorporación de NIS en las células T CAR no perjudica las funciones y la eficacia in vivo de las células T CAR y permite el tráfico y la expansión de las células T CAR...

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Divulgaciones

SSK es un inventor de patentes en inmunoterapia car con licencia para Novartis (a través de un acuerdo entre Mayo Clinic, la Universidad de Pensilvania y Novartis) y Mettaforge (a través de Mayo Clinic). RS, MJC y SSK son inventores de patentes en el campo de la inmunoterapia CAR que están autorizadas a Humanigen. SSK recibe fondos de investigación de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs y Lentigen. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte a través de la canalización K2R (SSK) de Mayo Clinic, el Centro de Medicina Individualizada (SSK) de Mayo Clinic y la Fundación Predolin (RS). Las figuras 1, 2 y 4 se crearon con BioRender.com.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

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