JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات (AST) في غضون 2.5 ساعة عن طريق تصوير تشتت رامان المحفز بخلية واحدة لعملية التمثيل الغذائي D2O. تنطبق هذه الطريقة على البكتيريا الموجودة في البول أو بيئة الدم الكاملة ، والتي تعد تحويلية للنمط الظاهري السريع أحادي الخلية AST في العيادة.

Abstract

لإبطاء ومنع انتشار العدوى المقاومة لمضادات الميكروبات ، هناك حاجة ماسة إلى اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات (AST) لتحديد التأثيرات المضادة للميكروبات على مسببات الأمراض كميا. عادة ما يستغرق الأمر أياما لإكمال AST بالطرق التقليدية القائمة على الثقافة طويلة الأمد ، ولا تعمل مباشرة للعينات السريرية. هنا ، نبلغ عن طريقة AST سريعة تم تمكينها عن طريق التصوير المحفز لتشتت رامان (SRS) لدمج التمثيل الغذائي لأكسيد الديوتيريوم (D2O). تتم مراقبة الدمج الأيضي ل D2O في الكتلة الحيوية وتثبيط النشاط الأيضي عند التعرض للمضادات الحيوية على مستوى البكتيريا المفردة بواسطة تصوير SRS. يمكن الحصول على تركيز تعطيل التمثيل الغذائي أحادي الخلية (SC-MIC) للبكتيريا عند التعرض للمضادات الحيوية بعد ما مجموعه 2.5 ساعة من تحضير العينة واكتشافها. علاوة على ذلك ، فإن طريقة AST السريعة هذه قابلة للتطبيق مباشرة على العينات البكتيرية في البيئات البيولوجية المعقدة ، مثل البول أو الدم الكامل. يعد التصوير الأيضي SRS لدمج الديوتيريوم تحويليا للنمط الظاهري السريع أحادي الخلية AST في العيادة.

Introduction

تشكل مقاومة مضادات الميكروبات تهديدا عالميا متزايدا للعلاج الفعال للأمراض المعدية1. من المتوقع أن تتسبب مقاومة مضادات الميكروبات في 10 ملايين حالة وفاة إضافية سنويا وخسارة 100 تريليون دولار في الناتج المحلي الإجمالي العالمي بحلول عام 2050 إذا لم يتم اتخاذ أي إجراء لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية 1,2. وهذا يؤكد الحاجة الملحة لطرق تشخيص سريعة ومبتكرة لاختبار حساسية البكتيريا المعدية للمضادات الحيوية (AST) لإبطاء ظهور البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية وتقليل معدل الوفيات ذات الصلة3. لضمان أفضل نتيجة سريرية ممكنة ، من الضروري إدخال علاج فعال في غضون 24 ساعة. ومع ذلك ، فإن الطريقة القياسية الذهبية الحالية ، مثل طريقة نشر القرص أو طريقة تخفيف المرق ، تتطلب عادة 24 ساعة على الأقل لإجراء الحضانة المسبقة للعينات السريرية و 16-24 ساعة إضافية للحصول على الحد الأدنى من نتائج التركيز المثبط (MIC). بشكل عام ، تستغرق هذه الطرق وقتا طويلا للغاية بحيث لا يمكن توجيه قرار فوري لعلاج الأمراض المعدية في العيادة ، مما يؤدي إلى ظهور وانتشار مقاومة مضادات الميكروبات4.

تم تطوير طرق AST للنمط الجيني ، مثل التقنيات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)5 ، للكشف السريع. تقيس هذه التقنيات التسلسلات الجينية للمقاومة المحددة من أجل توفير نتائج AST سريعة. أنها لا تعتمد على ثقافة الخلايا التي تستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، يتم اختبار التسلسلات الجينية المعروفة فقط مع المقاومة. لذلك ، يقتصر تطبيقه على الأنواع البكتيرية المختلفة أو آليات المقاومة المختلفة. أيضا ، لا يمكنهم تقديم نتائج MIC لقرارات العلاج 6,7. إلى جانب ذلك ، يتم تطوير طرق النمط الظاهري الجديدة ل AST السريع للتغلب على هذه القيود8 ، بما في ذلك أجهزة الموائع الدقيقة9،10،11،12،13 ، والأجهزة البصرية 14،15،16 ، AST المظهري الذي يحدد كمية نسخة الأحماض النوويةرقم 17،18 ، وطرق رامان الطيفية 19 ، 20،21،22،23،24. تقلل هذه الطرق من الوقت اللازم لتوجيه نتائج AST ، ومع ذلك ، فإن معظمها ينطبق فقط على العزلات البكتيرية ، وليس مباشرة على العينات السريرية ، ولا يزال يتطلب حضانة طويلة الأمد.

في هذا العمل ، نقدم طريقة لتحديد سريع لحساسية البكتيريا في البول والدم الكامل من خلال مراقبة النشاط الأيضي الخلوي عن طريق التصوير SRS. يشارك الماء (H2O) في الغالبية العظمى من عمليات التوليف الجزيئي الحيوي الأساسية في الخلايا الحية. كإيزوتوبولوج للماء ، من خلال تفاعل التبادل H / D المحفز بالإنزيم بين ذرة الهيدروجين النشطة للأكسدة والاختزال في NADPH والذرة D في D2O ، يمكن دمج الديوتيريوم في الكتلة الحيوية داخل الخلية25,26. يتم التوسط في تفاعل تخليق الأحماض الدهنية المديوتيريوم المسمى NADPH. ينتج عن دمج D2O في تفاعلات الأحماض الأمينية (AAs) إنتاج البروتين المثبط26 (الشكل 1). وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام الجزيئات الحيوية المحتوية على رابطة C-D المركبة حديثا في الخلايا الميكروبية المفردة كعلامة عامة للنشاط الأيضي ليتم اكتشافها. لقراءة روابط C-D المركبة من جديد ، يستخدم التحليل الطيفي Raman ، وهو أداة تحليلية متعددة الاستخدامات توفر معلومات كيميائية محددة وكمية للجزيئات الحيوية ، على نطاق واسع لتحديد الحساسية لمضادات الميكروبات وتقليل وقت الاختبار بشكل كبير إلى بضع ساعات27،28،29،30 . ومع ذلك ، نظرا للكفاءة المنخفضة المتأصلة في عملية تشتت رامان ، فإن التحليل الطيفي التلقائي لرامان ذو حساسية كشف منخفضة. لذلك ، من الصعب الحصول على نتائج الصور في الوقت الفعلي باستخدام التحليل الطيفي التلقائي لرامان. وصل تشتت رامان المتماسك (CRS) ، بما في ذلك تشتت رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS) وتشتت رامان المحفز (SRS) ، إلى حساسية عالية للكشف بسبب مجال الضوء المتماسك لتوليد أوامر بحجم أكبر من مطيافية رامان التلقائية ، وبالتالي تقديم تصوير كيميائي عالي السرعة ومحدد وكمي على مستوى الخلية الواحدة31،32،33،34،35 ، 36،37،38،39.

هنا ، بناء على أحدث أعمالنا40 ، نقدم بروتوكولا للتحديد السريع للنشاط الأيضي والحساسية لمضادات الميكروبات عن طريق تصوير الفيمتو ثانية SRS C-D لدمج D2O للبكتيريا في الوسط الطبيعي والبول وبيئة الدم الكاملة على مستوى الخلية الواحدة. يسهل تصوير الفيمتو ثانية SRS مراقبة تركيز تعطيل التمثيل الغذائي للخلية الواحدة (SC-MIC) ضد المضادات الحيوية على مستوى البكتيريا المفردة في غضون 2.5 ساعة. يتم التحقق من صحة نتائج SC-MIC عن طريق اختبار MIC القياسي عن طريق التخفيف الدقيق للمرق. طريقتنا قابلة للتطبيق لتحديد حساسية مضادات الميكروبات للبكتيريا عدوى المسالك البولية (UTI) ومسببات عدوى مجرى الدم (BSI) مع وقت فحص أقل بكثير مقارنة بالطريقة التقليدية ، مما يفتح الفرصة ل AST النمط الظاهري السريع في العيادة على مستوى الخلية الواحدة.

Protocol

يتوافق استخدام عينات الدم البشري مع إرشادات IRB بجامعة بوسطن والمعاهد الوطنية للصحة (NIH). على وجه التحديد ، العينات من بنك وتم تحديد هويتها بالكامل. لا تعتبر هذه العينات موضوعات بشرية من قبل مكتب مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة بوسطن.

1. تحضير محلول مخزون البكتيريا والمضادات الحيوية

  1. تحضير محلول مخزون المضادات الحيوية (كبريتات الجنتاميسين أو الأموكسيسيلين) بتركيز 1 مجم / مل مذاب في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) أو مذيب ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في أنابيب صغيرة سعة 1.5 مل. قم بإذابة كبريتات الجنتاميسين في محلول PBS المعقم والأموكسيسيلين في مذيب DMSO المعقم. بعد ذلك ، قم بتخزين محلول المضادات الحيوية في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية كما هو مقترح.
  2. لجعل D 2O يحتوي على وسائط مرق مولر-هينتون (MHB) المعدلة حسب الكاتيون ، أضف 220 مجم من قاعدة مرق MHB إلى 10 مل من D 2 O لجعل 100٪ D2O يحتوي على وسط. تعقيم الحل عن طريق التصفية مع مرشحات من حجم المسام 200 نانومتر.
    ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول دائما لصنع وتعقيم المحاليل المتوسطة في خطوات أخرى.
  3. لتحضير عينات بكتيرية لتصوير SRS ، أضف 2 مل من وسائط MHB العادية ، التي لا تحتوي على الديوتيريوم ، إلى أنبوب زراعة معقم مستدير القاع ، ثم قم بتسخينه عند 37 درجة مئوية.
  4. استخدم حلقة معقمة لاختيار مستعمرة بكتيرية واحدة (الإشريكية القولونية BW 25113 أو Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) من الثقافة الطازجة على طبق أجار الصويا tryptic. ثم قم بتعليقه في وسائط الاستزراع قبل التسخين والدوامة برفق لتحضير تعليق البكتيريا.
  5. احتضان البكتيريا عند 37 درجة مئوية في شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) حتى تصل إلى المرحلة اللوغاريتمية.

2. D2 O علاج الدمج في وجود المضادات الحيوية (الشكل 2 أ)

  1. تحقق من تركيز البكتيريا عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) باستخدام مقياس ضوئي بطول موجي يبلغ 600 نانومتر.
  2. قم بتخفيف المحلول البكتيري باستخدام وسط MHB العادي ، الذي لا يحتوي على الديوتيريوم ، للوصول إلى تركيز الخلية النهائي 8 × 105 CFU / mL. دوامة بلطف لخلط الخلايا البكتيرية.
  3. تحضير 300 ميكرولتر من المحلول البكتيري في سبعة أنابيب صغيرة سعة 1.5 مل ، و 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب صغير واحد سعة 1.5 مل.
  4. أضف 4.8 ميكرولتر من محلول مخزون المضادات الحيوية (جنتاميسين أو أموكسيسيلين) (1 مجم / مل) إلى الأنبوب الصغير الذي يحتوي على 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري ، لجعل التركيز النهائي للمضادات الحيوية 8 ميكروغرام / مل.
  5. خذ 300 ميكرولتر من المحلول من 8 ميكروغرام / مل من محلول البكتيريا المحتوية على المضادات الحيوية ، وأضفه إلى 300 ميكرولتر أخرى من المحلول البكتيري ، لصنع مضاد حيوي مخفف مزدوج (4 ميكروغرام / مل) يحتوي على محلول بكتيري.
  6. كرر التخفيف التسلسلي المزدوج للمضادات الحيوية الاختبارية ، الجنتاميسين ، أو الأموكسيسيلين ، حتى يتم الوصول إلى الأنبوب الصغير بأقل تركيز (0.25 ميكروغرام / مل) ، وتخلص من 300 ميكرولتر من الأنبوب. بالنسبة لكل من الجنتاميسين والأموكسيسيلين ، تتراوح التركيزات التسلسلية من 0.25 ميكروغرام / مل - 8 ميكروغرام / مل.
    1. اترك أنبوبا واحدا بدون مضادات حيوية للتحكم الفارغ. سيكون هذا هو التحكم الإيجابي لفحص نشاط التمثيل الغذائي البكتيري دون علاج بالمضادات الحيوية ولكن مع علاج D2O.
    2. اترك أنبوبا واحدا بدون مضادات حيوية ولا يوجد D2O للتحكم السلبي.
  7. احتضان القسمة البكتيرية مع بعض المضادات الحيوية (جنتاميسين أو أموكسيسيلين) التي تحتوي على وسط MHB لمدة 1 ساعة.
  8. أثناء الحضانة ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي للمضادات الحيوية بنسبة 100٪ D 2 O تحتوي على وسط بنفس تدرج تركيز المضادات الحيوية المحضرة في الخطوة2.6. بالنسبة لكل من الجنتاميسين والأموكسيسيلين ، تتراوح التركيزات التسلسلية من 0.25 ميكروغرام / مل - 8 ميكروغرام / مل.
  9. بعد 1 ساعة من العلاج بالمضادات الحيوية ، أضف 700 ميكرولتر من المضادات الحيوية المخففة بشكل متسلسل و 100٪ D 2 O المحتوي على MHB المتوسط إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية في نفس تركيز المضادات الحيوية (أعدت في الخطوة2.6) ، على التوالي.
    1. على سبيل المثال ، أضف 700 ميكرولتر من وسط MHB المحتوي على 100٪ D2O (يحتوي على 8 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية) إلى 300 ميكرولتر من 8 ميكروغرام / مل من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية. بنفس الطريقة ، انقل إلى الأنابيب المقابلة للتركيز التالي ، وقم بالتجانس عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    2. أضف 700 ميكرولتر من وسط MHB المحتوي على 100٪ D2 الخالي من المضادات الحيوية إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا الخالية من المضادات الحيوية (المحضرة في الخطوة 2.6.1) كعنصر تحكم فارغ.
    3. احتضن عند 37 درجة مئوية في شاكر الحضانة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يكون التركيز النهائي ل D2O في الوسط للاختبار 70٪.
  10. أولا بالطرد المركزي 1 مل من المضادات الحيوية و D2O عينة بكتيرية معالجة عند 6200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم يغسل مرتين بالماء النقي. أخيرا ، قم بإصلاح العينات في محلول فورمالين 10٪ وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية.

3. تحضير البكتيريا في بيئة البول (الشكل 2 ب)

  1. لتحضير E. coli BW 25113 في المرحلة اللوغاريتمية ، اتبع الخطوات في 1.4 و 1.5.
  2. تحقق من تركيز البكتيريا عن طريق قياس OD باستخدام مقياس ضوئي بطول موجي 600 نانومتر.
  3. لتقليد عينات التهاب المسالك البولية السريرية14،18،41 ، قم برفع محلول الإشريكية القولونية إلى 10 مل من البول غير المحدد للوصول إلى تركيز الخلية النهائي البالغ 10 6 CFU / mL.
  4. قم بتصفية البول المسننة بالإشريكية القولونية باستخدام مرشح 5 ميكرومتر ، ثم قسم المحلول البكتيري في 300 ميكرولتر إلى سبعة أنابيب صغيرة سعة 1.5 مل ، و 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب صغير واحد سعة 1.5 مل.
  5. إجراء علاج الدمج D 2 O في وجود المضادات الحيوية وجمع العينات كما هو موضح في الخطوات السابقة من 2.4 إلى2.10.

4. تحضير البكتيريا في بيئة الدم (الشكل 2 ج)

  1. لتحضير Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 في المرحلة اللوغاريتمية ، اتبع الخطوات عند 1.4 و 1.5.
  2. لتقليد عينات عدوى مجرى الدم السريرية42,43 ، ارتفاع P. aeruginosa في 1 مل من دم الإنسان غير المحدد للوصول إلى تركيز 107 CFU / mL.
  3. أضف 9 مل من الماء النقي المعقم لتحلل الدم.
  4. قم بتصفية الدم المسننة P. aeruginosa باستخدام مرشح 5 ميكرومتر. ثم حصاد البكتيريا إلى حجم 1 مل عن طريق الطرد المركزي عند 6200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.  أضف 9 مل من MHB العادي الذي تم تسخينه مسبقا إلى محلول البكتيريا ودوامة برفق. التركيز النهائي للبكتيريا هو 106 CFU / مل
  5. قسم محلول الدم P. aeruginosa المسنن في 300 ميكرولتر من القسمة إلى سبعة أنابيب صغيرة سعة 1.5 مل ، و 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب صغير واحد سعة 1.5 مل.
  6. إجراء علاج الدمج D 2 O في وجود المضادات الحيوية وجمع العينات كما هو موضح في الخطوات السابقة من 2.4 إلى2.10.

5. تصوير SRS لدمج التمثيل الغذائي D2O في بكتيريا واحدة

  1. اغسل 1 مل من محلول البكتيريا الثابتة بالماء النقي ثم جهاز طرد مركزي عند 6200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف . إثراء الحل البكتيري إلى حوالي 20 ميكرولتر.
  2. قم بإيداع المحلول البكتيري على غطاء زجاجي مطلي ب poly-L-lysine. شطيرة وختم العينة للتصوير SRS.
  3. صورة البكتيريا عند تردد اهتزاز C-D عند 2168 سم -1 باستخدام مجهر SRS.
    1. أدخل واضبط الطول الموجي للمضخة على 852 نانومتر باستخدام برنامج التحكم على جهاز كمبيوتر.
    2. قم بقياس طاقة الليزر باستخدام مقياس الطاقة. اضبط قوة ليزر المضخة عند العينة على ~ 8 ميجاوات وقوة ليزر ستوكس عند العينة على ~ 40 ميجاوات عن طريق ضبط لوحة نصف الموجة أمام خرج الليزر.
      ملاحظة: في مجهر SRS ، يوفر ليزر الفيمتو ثانية القابل للضبط بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز ليزر الإثارة (680 إلى 1300 نانومتر) و Stokes (1045 نانومتر).
  4. من خلال ضبط مسامير مرايا الانعكاس ، قم بمحاذاة المضخة مكانيا وحزم ستوكس وتوجيه الحزمتين إلى مجهر عمودي مجهز بنظام مرآة 2D galvo للمسح بالليزر.
    1. استخدم هدف الغمر في الماء 60x لتركيز المضخة وليزر ستوكس على العينة.
    2. استخدم مكثف الزيت لجمع الإشارات من العينة في الاتجاه الأمامي.
    3. استخدم مرشح تمرير النطاق الترددي لتصفية ليزر ستوكس قبل توجيهه إلى الصمام الثنائي الضوئي.
    4. استخرج إشارة رامان المحفزة بواسطة مضخم قفل واكتشف الإشارات بواسطة الصمام الثنائي الضوئي.
  5. اضبط كل صورة SRS لتحتوي على 200 × 200 بكسل ووقت بقاء البكسل لمدة 30 ميكروثانية في لوحة تحكم البرنامج. إجمالي وقت الاستحواذ لصورة واحدة هو ~ 1.2 ثانية. اضبط حجم الخطوة على 150 نانومتر ، بحيث يكون حجم الصورة حوالي 30 × 30 ميكرومتر2. قم بتصوير ثلاثة مجالات عرض على الأقل لكل عينة.

6. معالجة الصور وتحليل البيانات (الشكل 3)

  1. للحصول على متوسط شدة إشارة C-D ، افتح صور SRS ومعالجتها باستخدام برنامج ImageJ.
  2. أولا ، قم بتحويل صور SRS إلى صور من النوع 8 بت بألوان مقلوبة بالنقر فوق Image | اكتب | 8 بت، ثم تحرير | عكس الأزرار في برنامج ImageJ.
  3. بعد ذلك ، قم بتصفية الصور باستخدام تمويه Gaussian بالنقر فوق معالجة | الفلاتر | أزرار طمس Gaussian وتعيين سيغما (نصف القطر) إلى 1.
  4. استخدم ضبط عتبة الصورة لتحديد المنطقة البكتيرية. انقر على الصورة | ضبط | عتبة للتأكد من تطابق أحجام البكتيريا المحددة مع تلك الموجودة في صور SRS الأصلية. تخلص من الجسيمات الصغيرة عن طريق ضبط عتبة الحجم لتحديد الجسيمات. انقر على تطبيق.
  5. تطبيق تحليل | أزرار تحليل الجسيمات لتسمية وتحديد منطقة البكتيريا.
  6. بالنقر فوق الزر إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار إلى صورة SRS الأصلية غير المعالجة ، قم بتسمية نفس المنطقة من البكتيريا ، وحدد متوسط كثافة كل نقطة بيانات بالنقر فوق الزر قياس في مدير عائد الاستثمار.
  7. ضع دائرة حول منطقة الخلفية في صورة SRS الأصلية وقم بقياس متوسط كثافة الخلفية. يتم الحصول على متوسط شدة C-D لكل بكتيريا عن طريق خصم شدة إشارة الخلفية.

7. تحديد كمية الحساسية لمضادات الميكروبات عن طريق SC-MIC

ملاحظة: تم تحديد القيمة الحدية عند 0.60 لتحديد SC-MIC وفقا للتحليل الإحصائي لشدة SRS C-D للظروف النشطة الأيضية والمثبطة لعملية التمثيل الغذائي للبكتيريا عند تركيزات مختلفة من التعرض للدواء40. تم تزويد كثافة C-D للمجموعات الحساسة للمضادات الحيوية والمقاومة للمضادات الحيوية بالتوزيع الطبيعي.

  1. ارسم منحنى خاصية تشغيل جهاز الاستقبال (ROC) وقم بتقييم عتبة القطع عند 0.60. بناء على هذه القيمة الفاصلة ، يمكن تعريف SC-MIC كمؤشر لفعالية المضادات الحيوية لتحديد المجموعة غير النشطة الأيضية والنشطة الأيضية.
  2. لتحليل بيانات تصوير SRS كميا ، ارسم الرسوم البيانية لشدة إشارة C-D لكل مجموعة بكتيريا معالجة بتركيز المضادات الحيوية المخففة بشكل متسلسل. تشير نقاط البيانات الملونة إلى بكتيريا فردية مختلفة.
  3. تطبيع شدة C-D للمجموعة المعالجة بالمضادات الحيوية إلى متوسط كثافة المجموعة الضابطة دون علاج بالمضادات الحيوية. تحديد نتائج SC-MIC لمجموعات مختلفة من البكتيريا والمضادات الحيوية عن طريق تحديد شدة إشارة SRS في منطقة C-D مقابل تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية باستخدام قيمة القطع عند 0.60.
  4. تحقق من صحة ومقارنة قراءات SC-MIC مع MIC المحددة باستخدام مقايسة التخفيف الدقيق للمرق التقليدية.
  5. وفقا لمعهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) ، يتم تفسير فئة الحساسية بناء على نتائج التصوير الأيضي SRS لكل سلالة بكتيرية تم اختبارها على أنها "حساسة" أو "مقاومة" أو "متوسطة".

النتائج

يتم قياس تأثير وقت الحضانة على دمج الديوتيريوم بواسطة التحليل الطيفي الدقيق لرامان التلقائي في منطقة C-D (2070 إلى 2250 سم -1) و C-H (2800 إلى 3100 سم -1) (الشكل 4 أ). تظهر أطياف رامان أحادية الخلية ذات الفاصل الزمني ل P. aeruginosa المزروعة في 70٪ D 2 O التي تحتوي على وسط زيادة كثافة...

Discussion

يمكن الحصول على AST السريع من خلال تقييم استجابة النشاط الأيضي البكتيري للعلاج بالمضادات الحيوية باستخدام التصوير الأيضي SRS أحادي الخلية في غضون 2.5 ساعة من العينة إلى نتائج SC-MIC. يمكن الكشف عن استجابة النشاط الأيضي البكتيري والحساسية لمضادات الميكروبات من خلال مراقبة الدمج الأيضي ل D2O...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01AI141439 إلى J.-X.C و MS ، و R35GM136223 إلى J.-X.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved