단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

요약

이 프로토콜은_D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

초록

항생제 내성 감염의 확산을 늦추고 예방하기 위해 병원균에 대한 항균 효과를 정량적으로 결정하기 위해 신속한 항균 감수성 검사 (AST)가 시급합니다. 전형적으로 장기간 배양에 기초한 통상적인 방법으로 AST를 완성하는 데 며칠이 걸리며, 이들은 임상 샘플에 대해 직접 작용하지 않는다. 여기에서는 산화중수소(_D2O) 대사 혼입의 자극된 라만 산란(SRS) 이미징에 의해 가능해진 신속한 AST 방법을 보고합니다. 바이오매스로의_D2O의 대사 혼입 및 단일 박테리아 수준에서 항생제에의 노출에 따른 대사 활성 억제는 SRS 영상화에 의해 모니터링된다. 항생제 노출 시 박테리아의 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)는 총 2.5시간의 샘플 준비 및 검출 후에 얻을 수 있습니다. 또한이 신속한 AST 방법은 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경의 박테리아 샘플에 직접 적용 할 수 있습니다. 중수소 혼입의 SRS 대사 영상화는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST에 대한 변형입니다.

서문

항생제 내성(AMR)은^{감염성 질환의} 효과적인 치료에 대한 전 세계적으로 증가하는 위협입니다1. 항생제 내성 박테리아 퇴치를 위한 조치가 취해지지 않으면 AMR로 인해 연간 1,000만 명이 추가로 사망하고 2050년까지 전 세계 GDP 1,00조 달러의 손실이 발생할 것으로 예상됩니다.^1,2. 이는 항생제 내성 박테리아의 출현을 늦추고 관련^{사망률을 줄이기} 위해 감염성 박테리아의 항생제 감수성 검사(AST)를 위한 신속하고 혁신적인 진단 방법의 시급한 필요성을 강조합니다3. 최상의 임상 결과를 보장하려면 24시간 이내에 효과적인 치료법을 도입하는 것이 중요합니다. 그러나 디스크 확산 또는 브로스 희석 방법과 같은 현재의 금 표준 방법은 일반적으로 임상 샘플의 사전 배양 절차에 최소 24시간이 필요하고 최소 억제 농도(MIC) 결과를 얻기 위해 추가로 16-24시간이 필요합니다. 전반적으로, 이러한 방법은 클리닉에서 전염병 치료에 대한 즉각적인 결정을 안내하기에는 너무 시간이 많이 걸리며, 이는 항생제 내성의 출현 및 확산으로 이어집니다⁴.

중합효소연쇄반응(PCR)^{기반 기술5}과 같은 유전형 AST 방법이 신속한 검출을 위해 개발되었습니다. 이러한 기술은 빠른 AST 결과를 제공하기 위해 특정 저항 유전자 서열을 측정합니다. 그들은 시간이 많이 걸리는 세포 배양에 의존하지 않습니다. 그러나 내성이있는 특정 알려진 유전자 서열 만 테스트됩니다. 따라서, 그 적용은 다양한 박테리아 종 또는 다른 저항 메커니즘으로 제한됩니다. 또한 치료 결정 ^6,7에 대한 MIC 결과를 제공 할 수 없습니다. 게다가, 이러한 한계를 극복하기 위해 신속한 AST를 위한 신규한 표현형 방법이 개발 중이다(⁸), 미세유체 장치 9,10,11,12,13, 광학 장치^14,15,16, 핵산 복제 번호 ^17,18, 및 라만 분광법(¹⁹⁾을 포함하는 표현형 AST, ^{20,21,22,23,24}. 이러한 방법은 AST 결과를 안내하는 시간을 단축하지만 대부분은 임상 표본에 직접 적용되지 않고 박테리아 분리에만 적용되며 여전히 오랜 시간 사전 배양이 필요합니다.

이 연구에서는 SRS 영상에 의한 세포 대사 활동의 모니터링을 통해 소변 및 전혈에서 박테리아의 감수성을 신속하게 결정하는 방법을 제시합니다. 물 (H₂O)은 살아있는 세포에서 필수적인 생체 분자 합성 과정의 대다수에 참여합니다. 물의 동위 원소로서, NADPH의 산화 환원 활성 수소 원자와 D₂O의 D 원자 사이의 효소 촉매 H / D 교환 반응을 통해, 중수소는 세포 (^25,26) 내부의 바이오 매스로 통합 될 수있다. 중수 소화 지방산 합성 반응은 중수소 표지 NADPH에 의해 매개됩니다. 아미노산 (AA)의 반응에_D2O가 혼입되면 중수 소화 단백질 생산 (²⁶)이 발생합니다 (그림 1). 이와 같이, 단일 미생물 세포에서 새롭게 합성된 C-D 결합 함유 생체분자는 검출하고자 하는 일반적인 대사활성 마커로 채용될 수 있다. de novo 합성 C-D 결합을 판독하기 위해 생체 분자의 구체적이고 정량적인 화학 정보를 제공하는 다목적 분석 도구인 Raman 분광법은 항균 감수성을 결정하고 테스트 시간을 몇 시간으로 크게 단축하는 데 널리 사용됩니다.^27,28,29,30 . 그러나, 라만 산란 공정의 고유한 낮은 효율로 인해, 자발적 라만 분광법은 검출 감도가 낮다. 따라서 자발적인 라만 분광법을 사용하여 실시간 이미지 결과를 얻는 것은 어려운 일입니다. 코히어런트 안티-스톡스 라만 산란(CARS) 및 자극 라만 산란(SRS)을 포함한 코히어런트 라만 산란(CRS)은 자발적 라만 분광법보다 훨씬 더 큰 크기를 생성하는 코히어런트 라이트 필드로 인해 높은 검출 감도에 도달하여 단일 셀 수준에서 고속, 특이적 및 정량적 화학 이미징을 렌더링합니다. 31,32,33,34,35 ,^36,37,38,39.

여기에서, 우리의 가장 최근의 연구⁽⁴⁰)에 기초하여, 우리는 단일 세포 수준에서 정상 배지, 소변 및 전혈 환경에서 박테리아의_D2O혼입의 펨토초 SRS C-D 이미징에 의한 대사 활성 및 항균 감수성의 신속한 결정을 위한 프로토콜을 제시한다. 펨토초 SRS 이미징은 2.5시간 이내에 단일 박테리아 수준에서 항생제에 대한 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. SC-MIC 결과는 브로스 미세 희석을 통한 표준 MIC 테스트에 의해 검증됩니다. 당사의 방법은 기존 방법에 비해 분석 시간이 훨씬 단축된 박테리아 요로 감염(UTI) 및 혈류 감염(BSI) 병원체의 항균 감수성을 측정하는 데 적용할 수 있으며, 이는 단일 세포 수준에서 클리닉에서 빠른 표현형 AST의 기회를 열어줍니다.

프로토콜

인간 혈액 표본의 사용은 보스턴 대학의 IRB와 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따릅니다. 특히, 표본은 은행에서 왔으며 완전히 식별되지 않습니다. 이 표본은 보스턴 대학의 기관 검토위원회 (IRB) 사무실에서 인간 대상으로 간주되지 않습니다.

1. 박테리아 및 항생제 원액의 제조

1. 1.5mL 마이크로 튜브의 멸균 1x 인산완충식염수(PBS) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해된 1mg/mL 농도의 항생제(황산겐타마이신 또는 아목시실린) 원액을 준비합니다. 겐타 마이신 설페이트를 멸균 PBS 용액에 녹이고 아목시실린을 멸균 DMSO 용매에 용해시킨다. 그 후, 항생제 용액을 제안된 대로 2-8°C에서 저장한다.
2. _D2O함유 양이온 조정 뮐러-힌튼 브로스(MHB) 배지를 만들기 위해, 10mL의 D2O에 220mg의 MHB 브로스 베이스를 첨가하여 100%_D2O함유 배지를 만든다. 200nm 공극 크기의 필터로 여과하여 용액을 멸균합니다.
   알림: 이 프로토콜은 항상 추가 단계에서 배지 용액을 만들고 살균하는 데 사용하십시오.
3. SRS 이미징을 위해 박테리아 샘플을 준비하려면 중수소가 포함되지 않은 일반 MHB 배지 2mL를 멸균 둥근 바닥 배양 튜브에 추가한 다음 37°C에서 예열합니다.
4. 멸균 루프를 사용하여 트립신 대두 한천 플레이트의 신선한 배양물로부터 하나의 박테리아(대장균 BW 25113 또는 녹농 균 ATCC 47085) 콜로니를 선택합니다. 그런 다음 예열 된 배양 배지에 현탁하고 부드럽게 와동하여 박테리아 현탁액을 준비합니다.
5. 박테리아가 대수 단계에 도달할 때까지 셰이커에서 분당 200회전(rpm)으로 37°C에서 배양합니다.

2. 항생제 존재 하에서의_D2O혼입 처리(도 2a)

1. 파장 600nm에서 광도계로 광학 밀도 (OD)를 측정하여 박테리아 농도를 확인하십시오.
2. 중수소를 포함하지 않는 일반 MHB 배지를 사용하여 박테리아 용액을 희석하여 최종 세포 농도 8 x 10⁵ CFU/mL에 도달합니다. 박테리아 세포를 부드럽게 혼합하기 위해 와동.
3. 7개의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 300μL 분취량을 준비하고, 하나의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 600μL 분취량을 준비합니다.
4. 4.8μL의 항생제(겐타마이신 또는 아목시실린) 원액(1mg/mL)을 600μL의 박테리아 용액이 포함된 마이크로 튜브에 추가하여 최종 항생제 농도를 8μg/mL로 만듭니다.
5. 항생제 함유 박테리아 용액 8μg/mL에서 용액 300μL를 취하고 박테리아 용액 300μL를 더 추가하여 2배 희석된 항생제(4μg/mL) 함유 박테리아 용액을 만듭니다.
6. 최저 농도(0.25μg/mL)의 마이크로 튜브에 도달할 때까지 테스트 항생제, 겐타마이신 또는 아목시실린의 2배 연속 희석을 반복하고 튜브에서 300μL를 버립니다. 겐타 마이신과 아목시실린 모두의 경우 연속 농도 범위는 0.25 μg / mL - 8 μg / mL입니다.
   1. 빈 통제를 위해 항생제가없는 튜브 하나를 남겨 두십시오. 이는 항생제 처리 없이_D2O처리로 박테리아 대사 활성을 검사하는 양성 대조군이 될 것이다.
   2. 음성 대조군을 위해 항생제가없고 D₂O가없는 튜브 하나를 남겨 두십시오.
7. 박테리아 분취량을 MHB 배지를 함유하는 특정 항생제 (겐타 마이신 또는 아목시실린)와 함께 1 시간 동안 배양한다.
8. 배양 동안, 단계 2.6에서 제조된 항생제와 동일한 농도구배를 갖는 100%_D2O함유 배지로 항생제의 연속 희석액을 준비한다. 겐타 마이신과 아목시실린 모두의 경우 연속 농도 범위는 0.25 μg / mL - 8 μg / mL입니다.
9. 1시간 항생제 처리 후, 동일한 항생제 농도(단계 2.6에서 제조)의 항생제 전처리 박테리아 300μL에 각각 연속 희석된 항생제 700μL와 100%_D2O함유 MHB 배지를 첨가한다.
   1. 예를 들어, 700μL의 100%_D2O-함유 MHB 배지(8μg/mL의 항생제 함유)를 300μL의 8μg/mL 항생제 전처리 박테리아에 추가합니다. 동일한 방식으로 다음 농도의 해당 튜브로 옮기고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다.
   2. 블랭크 대조군으로서 300μL의 무항생제 박테리아(단계 2.6.1에서 제조됨)에 700μL의 무항생제 100%_D2O-함유 MHB 배지를 추가합니다.
   3. 200 rpm의 인큐베이션 쉐이커에서 37°C에서 추가 30분 동안 인큐베이션합니다.
      참고: 이 단계에서, 시험용 배지 중_D2O의 최종 농도는 70%이다.
10. 먼저 항생제 1 mL와 D2O 처리된 박테리아 시료를₆₂₀₀x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음, 정제수로 2회 세척하였다. 마지막으로 샘플을 10 % 포르말린 용액에 고정하고 4 ° C에서 보관하십시오.

3. 소변 환경에서 박테리아의 준비 (그림 2b)

1. 대장 균 BW 25113을 로그 단계에서 준비하려면 1.4 및 1.5의 단계를 따르십시오.
2. 600 nm의 파장에서 광도계로 OD를 측정하여 박테리아 농도를 확인하십시오.
3. 임상 UTI 샘플^14,18,41을 모방하려면 대장균 용액을 식별되지 않은 소변 10mL에 스파이크하여 최종 세포 농도 ^{10 6} CFU/mL에 도달합니다.
4. 5μm 필터를 사용하여 대장균 스파이크된 소변을 여과한 다음 300μL 분취량의 박테리아 용액을 7개의 1.5mL 마이크로 튜브로, 1개의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 600μL 분취량을 나눕니다.
5. 항생제의 존재하에_D2O혼입 처리를 수행하고 2.4 내지 2.10의 이전 단계에서 설명한 바와 같이 샘플 수집을 수행한다.

4. 혈액 환경에서 박테리아의 준비 (그림 2c)

1. 녹 농균 ATCC 47085를 로그 단계에서 준비하려면 1.4 및 1.5의 단계를 따르십시오.
2. 임상 혈류 감염 샘플^42,43을 모방하기 위해 식별되지 않은 인간 혈액 1mL에 녹농균을 스파이크하여 10^7CFU/mL의 농도에 도달합니다.
3. 혈액을 용해시키기 위해 멸균 정제수 9mL를 추가합니다.
4. 녹농균 스파이크된 혈액을 5 μm 필터를 사용하여 여과한다. 그런 다음 4°C에서 5분 동안 6200 x g에서 원심분리하여 박테리아를 1mL 부피로 수확합니다.  미리 예열된 일반 MHB 9mL를 박테리아 용액에 넣고 부드럽게 소용돌이칩니다. 박테리아의 최종 농도는 10⁶ CFU/mL입니다.
5. 녹 농균 스파이크된 혈액 용액을 300μL 분취액으로 7개의 1.5mL 마이크로 튜브로 나누고, 600μL 분취량을 1.5mL 마이크로 튜브에 나눕니다.
6. 항생제의 존재하에_D2O혼입 처리를 수행하고 2.4 내지 2.10의 이전 단계에서 설명한 바와 같이 샘플 수집을 수행한다.

5. 단일 박테리아에서_D2O대사 혼입의 SRS 이미징

1. 고정 박테리아 용액 1mL를 정제수로 세척한 다음 6200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오. 박테리아 용액을 약 20 μL로 농축한다.
2. 박테리아 용액을 폴리 -L- 라이신 코팅 커버 글라스에 증착하십시오. SRS 이미징을 위해 샘플을 샌드위치하고 밀봉합니다.
3. SRS 현미경을 사용하여 2168cm-1에서 ^C-D 진동 주파수에서 박테리아를 이미지화합니다.
   1. 컴퓨터의 제어 소프트웨어를 사용하여 펌프 파장을 852nm로 입력하고 조정합니다.
   2. 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. 레이저 출력 앞의 반파 플레이트를 조정하여 샘플에서 펌프 레이저의 출력을 ~8mW로 설정하고 샘플에서 Stokes 레이저의 출력을 ~40mW로 설정합니다.
      참고: SRS 현미경에서 80MHz 반복률의 조정 가능한 펨토초 레이저는 펌프(680 - 1300nm) 및 Stokes(1045nm) 여기 레이저를 제공합니다.
4. 반사 거울의 나사를 조정하여 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로 정렬하고 두 빔을 레이저 스캐닝을 위한 2D 갈보 미러 시스템이 장착된 직립 현미경으로 향하게 합니다.
   1. 60x 수침 대물렌즈를 사용하여 펌프와 Stokes 레이저를 샘플에 집중시킵니다.
   2. 오일 콘덴서를 사용하여 샘플에서 정방향으로 신호를 수집합니다.
   3. 대역 통과 필터를 사용하여 Stokes 레이저를 포토 다이오드로 향하게하기 전에 필터링하십시오.
   4. 잠금 증폭기로 자극된 라만 신호를 추출하고 광 다이오드로 신호를 감지합니다.
5. 소프트웨어의 제어판에서 각 SRS 이미지가 200 x 200 픽셀과 30μs 동안 픽셀 체류 시간을 포함하도록 설정합니다. 하나의 이미지에 대한 총 획득 시간은 ~1.2초입니다. 스텝 크기를 150nm로 설정하면 이미지 크기가 약 30 x 30μm²가 됩니다. 각 샘플에 대해 최소 3개의 보기 필드를 이미지화합니다.

6. 이미지 처리 및 데이터 분석 (그림 3)

1. 평균 C-D 신호 강도를 얻으려면 ImageJ 소프트웨어로 SRS 이미지를 열고 처리하십시오.
2. 먼저 이미지 | 클릭하여 SRS 이미지를 반전 된 색상의 8 비트 유형 이미지로 변환합니다. 유형 | 8비트 및 | 편집 ImageJ 소프트웨어의 버튼을 반전합니다.
3. 그런 다음 프로세스 | 클릭하여 가우시안 블러로 이미지를 필터링합니다. 필터 | 가우스 흐림 버튼을 누르고 시그마(반지름) 를 1로 설정합니다.
4. 이미지 임계값 조정을 사용하여 박테리아 영역을 선택합니다. 이미지 | 클릭 | 조정 선택한 박테리아 크기가 원본 SRS 이미지의 크기와 일치하는지 확인하기 위한 임계값입니다. 입자를 결정하기 위해 크기 임계값을 조정하여 작은 입자를 제거합니다. 적용을 클릭합니다.
5. 분석 | 적용 입자 분석 버튼을 사용하여 박테리아의 영역을 표시하고 결정합니다.
6. ROI 관리자에서 모두 표시 버튼을 클릭하여 처리되지 않은 원본 SRS 이미지에 레이블을 지정하고 동일한 박테리아 영역에 레이블을 지정하고 ROI 관리자에서 측정 버튼을 클릭하여 각 데이터 포인트의 평균 강도를 결정합니다.
7. 원본 SRS 이미지의 배경 영역에 동그라미를 치고 배경의 평균 강도를 측정합니다. 각 박테리아의 평균 C-D 강도는 배경 신호 강도를 공제하여 얻습니다.

7. SC-MIC를 통한 항균 감수성 정량

참고: SC-MIC를 결정하기 위한 0.60에서의 컷오프 값은 다양한 농도의 약물 노출시 박테리아에 대한 대사 활성 및 대사 억제 조건의 SRS C-D 강도의 통계 분석에 따라 설정됩니다(⁴⁰). 항생제 감수성 및 항생제 내성 그룹에 대한 C-D 강도는 정규 분포로 적합했습니다.

1. 수신기 작동 특성(ROC) 곡선을 플로팅하고 차단 임계값을 0.60으로 평가합니다. 이러한 컷오프 값에 기초하여, 항생제의 효능의 지표로서 SC-MIC는 대사적으로 비활성 및 대사적으로 활성인 그룹을 결정하기 위해 정의될 수 있다.
2. SRS 이미징 데이터를 정량적으로 분석하려면 연속적으로 희석된 항생제 농도로 처리된 각 박테리아 그룹에 대한 C-D 신호 강도의 히스토그램을 플로팅합니다. 색상이 지정된 데이터 포인트는 서로 다른 개별 박테리아를 나타냅니다.
3. 항생제 처리군의 C-D 강도를 항생제 처리하지 않은 대조군의 평균 강도로 표준화합니다. 0.60의 컷오프 값을 사용하여 다양한 항생제 농도와 비교하여 C-D 영역의 SRS 신호 강도를 정량화하여 다양한 박테리아 및 항생제 조합의 SC-MIC 결과를 결정합니다.
4. SC-MIC 판독값을 검증하고 기존 브로스 미세 희석 분석을 사용하여 측정된 MIC와 비교합니다.
5. 임상 및 실험실 표준 연구소(CLSI)에 따르면 테스트된 각 박테리아 균주에 대한 SRS 대사 영상 결과를 기반으로 한 감수성 범주는 "감수성", "내성" 또는 "중간"으로 해석됩니다.

결과

중수소 혼입에 대한 배양 시간의 영향은 C-D (2070-2250 cm-1) 및 CH (2,800-3,100 ^cm-1) 영역에서 자발적 라만 미세 분광법으로 측정됩니다 (그림 4a). 70% D2O 함유 배지에서 배양된 녹농균의 타임랩스 단일 세포 라만 스펙트럼은 0분에서 180분까지의 배양 시간에 걸쳐 CD/CH 강도가 증가하는 것을 보여줍니다(그림 4b) 단일 미생물 세포에서 증가?...

토론

신속한 AST는 샘플에서 SC-MIC 결과까지 2.5시간 이내에 단일 세포 SRS 대사 영상을 사용하여 항생제 치료에 대한 박테리아 대사 활성의 반응을 평가함으로써 얻을 수 있습니다. 박테리아 대사 활성 및 항미생물 감수성의 반응은 C-D 결합의 SRS 이미징을 사용하여 생체 분자 합성을 위한_D2O의 대사 혼입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 물은 살아있는 세포에서 어디에나 사용되기 때문에 SRS ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2