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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Resumo

Para retardar e prevenir a propagação de infecções resistentes a antimicrobianos, o teste rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) é urgente para determinar quantitativamente os efeitos antimicrobianos sobre os patógenos. Normalmente, leva dias para completar o AST por métodos convencionais baseados na cultura de longo prazo, e eles não funcionam diretamente para amostras clínicas. Aqui, relatamos um método AST rápido possibilitado por imagens estimuladas de espalhamento Raman (SRS) da incorporação metabólica de óxido de deutério (D2O). A incorporação metabólica de D2O na biomassa e a inibição da atividade metabólica após a exposição a antibióticos no nível de uma única bactéria são monitoradas por imagens SRS. A concentração de inativação do metabolismo unicelular (SC-MIC) de bactérias após a exposição a antibióticos pode ser obtida após um total de 2,5 h de preparação e detecção da amostra. Além disso, este método AST rápido é diretamente aplicável a amostras bacterianas em ambientes biológicos complexos, como urina ou sangue total. A imagem metabólica SRS da incorporação de deutério é transformadora para AST fenotípica rápida de célula única na clínica.

Introdução

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma ameaça global crescente ao tratamento eficaz de doenças infecciosas1. Prevê-se que a RAM causará mais 10 milhões de mortes por ano e uma perda de PIB global de US $ 100 trilhões até 2050 se nenhuma ação para combater bactérias resistentes a antibióticos for tomada 1,2. Isso enfatiza a necessidade urgente de métodos diagnósticos rápidos e inovadores para o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) de bactérias infecciosas para retardar o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos e reduzir a taxa de mortalidade relacionada3. Para garantir o melhor resultado clínico possível, é crucial introduzir uma terapia eficaz dentro de 24 horas. No entanto, o método padrão-ouro atual, como o método de difusão em disco ou diluição em caldo, geralmente requer pelo menos 24 h para o procedimento de pré-incubação para amostras clínicas e um adicional de 16-24 h para obter os resultados da concentração inibitória mínima (CIM). No geral, esses métodos são muito demorados para orientar uma decisão imediata para o tratamento de doenças infecciosas na clínica, o que leva ao surgimento e disseminação da resistência antimicrobiana4.

Métodos genotípicos de AST, como técnicas baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR)5, foram desenvolvidos para detecção rápida. Tais técnicas medem as sequências genéticas de resistência específicas, a fim de fornecer resultados rápidos de AST. Eles não dependem de cultura celular demorada; no entanto, apenas sequências genéticas específicas conhecidas com resistência são testadas. Portanto, sua aplicação é limitada a várias espécies bacterianas ou diferentes mecanismos de resistência. Além disso, não podem fornecer resultados de CIM para as decisões terapêuticas 6,7. Além disso, novos métodos fenotípicos para AST rápida estão em desenvolvimento para superar essas limitações8, incluindo dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, dispositivos ópticos14,15,16, AST fenotípicos quantificando a cópia de ácidos nucleicos número 17,18 e métodos espectroscópicos Raman 19, 20,21,22,23,24. Esses métodos reduzem o tempo para orientar os resultados da AST, no entanto, a maioria deles só é aplicável a isolados bacterianos, não diretamente a espécimes clínicos, e ainda requer pré-incubação de longo prazo.

Neste trabalho, apresentamos um método para determinação rápida da suscetibilidade de bactérias na urina e no sangue total via monitoramento da atividade metabólica celular por meio de imagens SRS. A água (H2O) participa na grande maioria dos processos essenciais de síntese biomolecular em células vivas. Como um isotólogo da água, através da reação de troca H/D catalisada por enzimas entre o átomo de hidrogênio redox-ativo no NADPH e o átomo D em D2O, o deutério pode ser incorporado à biomassa dentro de uma célula25,26. Uma reação de síntese de ácidos graxos deuterados é mediada pelo deutério marcado NADPH. A incorporação de D2O em reações de aminoácidos (AAs) resulta na produção de proteína deuterada26 (Figura 1). Desta forma, as biomoléculas contendo ligações C-D recém-sintetizadas em células microbianas únicas podem ser empregadas como um marcador geral de atividade metabólica a ser detectado. Para ler ligações C-D sintetizadas de novo, a espectroscopia Raman, uma ferramenta analítica versátil que fornece informações químicas específicas e quantitativas de biomoléculas, é amplamente utilizada para determinar a suscetibilidade antimicrobiana e reduzir significativamente o tempo de teste para algumas horas27,28,29,30 . No entanto, devido à baixa eficiência inerente do processo de espalhamento Raman, a espectroscopia Raman espontânea é de baixa sensibilidade de detecção. Portanto, é um desafio obter resultados de imagem em tempo real usando espectroscopia Raman espontânea. O espalhamento Raman coerente (SRS), incluindo o espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) e o espalhamento Raman estimulado (SRS), atingiu alta sensibilidade de detecção devido ao campo de luz coerente para gerar ordens de magnitude maiores do que a da espectroscopia Raman espontânea, tornando assim imagens químicas de alta velocidade, específicas e quantitativas no nível de célula única 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Aqui, com base em nosso trabalho mais recente40, apresentamos um protocolo para determinação rápida da atividade metabólica e suscetibilidade antimicrobiana por imagem C-D SRS de femtossegundos da incorporação de bactérias D2O no meio normal, urina e ambiente sanguíneo total no nível unicelular. A imagem SRS de femtossegundos facilita o monitoramento da concentração de inativação do metabolismo de célula única (SC-MIC) contra antibióticos no nível de bactéria única dentro de 2,5 h. Os resultados do SC-MIC são validados pelo teste MIC padrão via microdiluição em caldo. Nosso método é aplicável para determinar a suscetibilidade antimicrobiana de bactérias patogênicas de infecção do trato urinário (ITU) e infecção da corrente sanguínea (BSI) com um tempo de ensaio muito reduzido em comparação com o método convencional, o que abre a oportunidade para AST fenotípica rápida na clínica no nível de célula única.

Protocolo

O uso de amostras de sangue humano está de acordo com as diretrizes do IRB da Universidade de Boston e dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Especificamente, os espécimes são de um banco e são completamente desidentificados. Esses espécimes não são considerados seres humanos pelo escritório do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston.

1. Preparação de bactérias e solução de estoque de antibióticos

  1. Preparar a solução-mãe de antibióticos (sulfato de gentamicina ou amoxicilina) numa concentração de 1 mg/ml dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solvente de sulfóxido de dimetilo (DMSO) estéril 1x em microtubos de 1,5 ml. Dissolver sulfato de gentamicina em solução estéril de PBS e amoxicilina em solvente DMSO estéril. Posteriormente, conservar a solução antibiótica a 2-8 °C, conforme sugerido.
  2. Para fazer D 2O contendo caldo de Mueller-Hinton ajustado por cátion (MHB), adicione 220 mg de caldo MHB base a 10 mL de D 2 O para fazer 100% D2O contendo meio. Esterilizar a solução filtrando com filtros de poros de 200 nm.
    NOTA: Use este protocolo sempre para fazer e esterilizar soluções médias em etapas adicionais.
  3. Para preparar amostras bacterianas para imagens SRS, adicione 2 mL de meio MHB normal, que não contém deutério, a um tubo de cultura estéril de fundo redondo e, em seguida, pré-aqueça-o a 37 °C.
  4. Use uma alça estéril para selecionar uma colônia bacteriana (Escherichia coli BW 25113 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) da cultura fresca em uma placa de ágar soja tríptica. Em seguida, suspenda-o no meio de cultura pré-aquecido e suavemente vórtice para preparar a suspensão de bactérias.
  5. Incubar as bactérias a 37 °C num agitador a 200 rotações por minuto (rpm) até atingir a fase logarítmica.

2. D2O tratamento de incorporação na presença de antibióticos (Figura 2a)

  1. Verifique a concentração bacteriana medindo a densidade óptica (OD) com um fotômetro a um comprimento de onda de 600 nm.
  2. Diluir a solução bacteriana utilizando o meio MHB normal, que não contém deutério, para atingir uma concentração celular final de 8 x 105 UFC/ml. Vórtice suavemente para misturar as células bacterianas.
  3. Preparar alíquotas de 300 μL da solução bacteriana em sete microtubos de 1,5 ml e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana num microtubos de 1,5 ml.
  4. Adicionar 4,8 μL de solução-mãe de antibiótico (gentamicina ou amoxicilina) (1 mg/ml) no microtubo contendo 600 μL da solução bacteriana, para aumentar a concentração final do antibiótico para 8 μg/ml.
  5. Retirar 300 μL de solução dos 8 μg/ml de solução bacteriana contendo antibióticos e adicionar a outros 300 μL de solução bacteriana, para obter uma solução bacteriana contendo duas vezes antibiótico diluído (4 μg/ml).
  6. Repetir a dupla diluição em série dos antibióticos de ensaio, gentamicina ou amoxicilina, até atingir o microtubo com a concentração mais baixa (0,25 μg/ml) e eliminar 300 μL do tubo. Tanto para a gentamicina quanto para a amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
    1. Deixe um tubo sem antibióticos para controle em branco. Este será o controle positivo para inspecionar a atividade metabólica bacteriana sem tratamento com antibióticos, mas com tratamento D2O.
    2. Deixe um tubo sem antibióticos e sem D2O para o controle negativo.
  7. Incubar a alíquota bacteriana com o antibiótico certo (gentamicina ou amoxicilina) contendo MHB por 1 h.
  8. Durante a incubação, preparar uma diluição em série de antibióticos com meio contendo 100% de D 2 O com o mesmo gradiente de concentração de antibióticos preparados na etapa2.6. Tanto para a gentamicina quanto para a amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
  9. Após 1 h de tratamento com antibióticos, adicionar 700 μL de antibiótico diluído em série e meio MHB contendo 100% D 2 O aos 300 μL de bactérias pré-tratadas com antibióticos na mesma concentração de antibiótico (preparado na etapa2.6), respectivamente.
    1. Por exemplo, adicione 700 μL de meio MHB contendo 100% D2O (contendo 8 μg/mL de antibiótico) aos 300 μL de bactérias pré-tratadas com antibiótico de 8 μg/mL. Da mesma forma, transfira para os tubos correspondentes da próxima concentração e homogeneize pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    2. Adicionar 700 μL de meio MHB 100% D 2 contendoMHB 100% D 2 isentos de antibióticos a 300 μL de bactérias isentas de antibióticos (preparado no passo 2.6.1) como controlo em branco.
    3. Incubar a 37 °C num agitador de incubação a 200 rpm durante mais 30 min.
      NOTA: Nesta etapa, a concentração final de D2O no meio para o teste é de 70%.
  10. Primeiro, centrifugar o 1 mL de antibiótico e a amostra bacteriana tratada com D2O a 6200 x g por 5 min a 4 °C e, em seguida, lavar duas vezes com água purificada. Por último, fixar as amostras em solução de formalina a 10% e armazená-las a 4 °C.

3. Preparação de bactérias no ambiente urinário (Figura 2b)

  1. Para preparar E. coli BW 25113 na fase logarítmica, siga os passos em 1,4 e 1,5.
  2. Verifique a concentração bacteriana medindo a OD com um fotômetro a um comprimento de onda de 600 nm.
  3. Para mimetizar as amostras clínicas de ITU 14,18,41, espete a solução de E. coli em 10 mL de urina desidentificada para atingir uma concentração celular final de 10 a 6 UFC/mL.
  4. Filtre a urina com espinhos de E. coli usando um filtro de 5 μm e, em seguida, divida a solução bacteriana em alíquotas de 300 μL em sete microtubos de 1,5 mL e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana em um microtubos de 1,5 mL.
  5. Realizar o tratamentode incorporação D 2 O na presença de antibióticos e coleta de amostras, conforme descrito nas etapas anteriores de 2,4 a 2,10.

4. Preparação de bactérias no ambiente sanguíneo (Figura 2c)

  1. Para preparar Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 na fase logarítmica, siga os passos em 1,4 e 1,5.
  2. Para mimetizar as amostras clínicas de infecções da corrente sanguínea42,43, espiga de P. aeruginosa em 1 mL de sangue humano desidentificado para atingir uma concentração de 107 UFC/mL.
  3. Adicione 9 mL de água purificada estéril para lisar o sangue.
  4. Filtre o sangue cravado de P. aeruginosa usando um filtro de 5 μm. Em seguida, colher as bactérias até 1 mL de volume por centrifugação a 6200 x g por 5 min a 4 °C.  Adicione 9 mL de MHB normal pré-aquecido à solução bacteriana e suavemente vórtice. A concentração final de bactérias é de 106 UFC/mL
  5. Divida a solução sanguínea com espinhos de P. aeruginosa em alíquotas de 300 μL em sete microtubos de 1,5 mL e alíquotas de 600 μL da solução bacteriana em um microtubos de 1,5 mL.
  6. Realizar o tratamentode incorporação D 2 O na presença de antibióticos e coleta de amostras, conforme descrito nas etapas anteriores de 2,4 a 2,10.

5. Imagem SRS da incorporação metabólica de D2O em uma única bactéria

  1. Lavar 1 ml de solução bacteriana fixa com água purificada e, em seguida, centrifugar a 6200 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante. Enriqueça a solução bacteriana a cerca de 20 μL.
  2. Deposite a solução bacteriana em um vidro de cobertura revestido de poli-L-lisina. Sanduíche e sele a amostra para imagens SRS.
  3. Imagem de bactérias na frequência vibracional C-D a 2168 cm-1 usando um microscópio SRS.
    1. Insira e ajuste o comprimento de onda da bomba para 852 nm usando o software de controle em um computador.
    2. Meça a potência do laser usando um medidor de energia. Defina a potência do laser da bomba na amostra para ~ 8 mW e a potência do laser Stokes na amostra para ~ 40 mW, ajustando a placa de meia onda na frente da saída do laser.
      NOTA: No microscópio SRS, um laser de femtossegundo ajustável com uma taxa de repetição de 80 MHz fornece os lasers de excitação da bomba (680 a 1300 nm) e Stokes (1045 nm).
  4. Ajustando os parafusos dos espelhos de reflexão, alinhe espacialmente a bomba e os feixes de Stokes e direcione os dois feixes para um microscópio vertical equipado com sistema de espelho galvo 2D para digitalização a laser.
    1. Use um objetivo de imersão em água de 60x para focar a bomba e os lasers Stokes na amostra.
    2. Use um condensador de óleo para coletar os sinais da amostra na direção para a frente.
    3. Use um filtro passa-banda para filtrar o laser Stokes antes de direcioná-lo para um fotodiodo.
    4. Extraia o sinal Raman estimulado por um amplificador de bloqueio e detecte os sinais pelo fotodiodo.
  5. Defina cada imagem SRS para conter 200 x 200 pixels e o tempo de permanência do pixel para 30 μs no painel de controle do software. O tempo total de aquisição para uma imagem é de ~1,2 s. Defina o tamanho da etapa para 150 nm, para que o tamanho da imagem seja de cerca de 30 x 30 μm2. Mostre pelo menos três campos de visão para cada amostra.

6. Processamento de imagens e análise de dados ( Figura 3 )

  1. Para obter a intensidade média do sinal C-D, abra e processe imagens SRS com o software ImageJ.
  2. Primeiro, converta imagens SRS em imagens do tipo 8 bits com cores invertidas clicando em Imagem | Tipo | 8 bits e, em seguida, Editar | Inverta botões no software ImageJ.
  3. Em seguida, filtre as imagens com desfoque gaussiano clicando em Processar | Filtros | Botões de desfoque gaussiano e defina o Sigma (Raio) como 1.
  4. Use o ajuste do limite da imagem para selecionar a área bacteriana. Clique na imagem | Ajustar | Limite para garantir que os tamanhos bacterianos selecionados correspondam aos das imagens SRS originais. Elimine pequenas partículas ajustando o limite de tamanho para determinar as partículas. Clique em Aplicar.
  5. Aplicar | de análise Botões de análise de partículas para rotular e determinar a área das bactérias.
  6. Ao clicar no botão Mostrar tudo no gerenciador de ROI para a imagem SRS original não processada, rotule a mesma área de bactérias, determine a intensidade média de cada ponto de dados clicando no botão Medir no gerenciador de ROI.
  7. Circule a área de fundo na imagem SRS original e meça a intensidade média do plano de fundo. As intensidades médias de C-D de cada bactéria são obtidas deduzindo-se a intensidade do sinal de fundo.

7. Quantificação da suscetibilidade antimicrobiana via SC-MIC

NOTA: O valor de corte em 0,60 para determinar a CIM-SC é estabelecido de acordo com a análise estatística das intensidades SRS C-D das condições metabolismo-ativas e inibidas pelo metabolismo de bactérias em várias concentrações de exposição a medicamentos40. As intensidades de C-D para os grupos suscetível a antibióticos e resistentes a antibióticos foram ajustadas com distribuição normal.

  1. Plotar a curva ROC (receiver operating characteristic) e avaliar o limiar de corte em 0,60. Com base nesse valor de corte, o SC-MIC como um indicador da eficácia dos antibióticos pode ser definido para determinar o grupo metabolicamente inativo e metabolicamente ativo.
  2. Para analisar quantitativamente os dados de imagem SRS, plotar os histogramas das intensidades de sinal C-D para cada grupo de bactérias tratadas com a concentração de antibiótico diluído em série. Os pontos de dados coloridos representam diferentes bactérias individuais.
  3. Normalizar as intensidades C-D do grupo tratado com antibióticos para a intensidade média do grupo controle sem tratamento com antibióticos. Determine os resultados do SC-MIC de diferentes combinações de bactérias e antibióticos quantificando as intensidades de sinal SRS na região C-D versus várias concentrações de antibióticos usando o valor de corte de 0,60.
  4. Validar e comparar a leitura do SC-MIC com a CIM determinada usando o ensaio convencional de microdiluição em caldo.
  5. De acordo com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), a categoria de suscetibilidade baseada nos resultados de imagem metabólica SRS para cada cepa bacteriana testada é interpretada como "suscetível", "resistente" ou "intermediária".

Resultados

O efeito do tempo de incubação na incorporação de deutério é medido por microespectroscopia Raman espontânea nas regiões C-D (2070 a 2250 cm-1) e C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Os espectros Raman unicelulares de lapso de tempo de P. aeruginosa cultivados em meio contendo 70% de D 2 O mostram aumento da intensidade de CD/CH ao longo do tempo de incubação de 0 a 180 min. (Figura 4b) O aumento da abundância de C-D em...

Discussão

A AST rápida pode ser obtida avaliando a resposta da atividade metabólica bacteriana ao tratamento com antibióticos usando imagens metabólicas SRS de célula única dentro de 2,5 h da amostra para os resultados da SC-MIC. A resposta da atividade metabólica bacteriana e a suscetibilidade antimicrobiana podem ser detectadas pelo monitoramento da incorporação metabólica de D2O para síntese de biomoléculas usando imagens SRS de ligações C-D. Como a água é usada de forma onipresente em células vivas,...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01AI141439 a J.-X.C e M.S, e R35GM136223 a J.-X.C.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

Referências

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