JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) תוך 2.5 שעות על ידי הדמיית פיזור ראמן מגורה בתא יחיד של חילוף החומרים של D2O. שיטה זו חלה על חיידקים בשתן או בסביבת דם שלמה, שהיא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

Abstract

כדי להאט ולמנוע התפשטות של זיהומים עמידים מיקרוביאלית, בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) זקוקה בדחיפות לקבוע כמותית את ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות על פתוגנים. בדרך כלל לוקח ימים להשלים את ה- AST בשיטות קונבנציונליות המבוססות על התרבית הוותיקה, והן אינן פועלות ישירות עבור דגימות קליניות. כאן אנו מדווחים על שיטת AST מהירה המתאפשרת על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן (SRS) של שילוב מטבולי של תחמוצת דאוטריום (D2O). שילוב מטבולי של D2O בביומסה ועיכוב הפעילות המטבולית בעת חשיפה לאנטיביוטיקה ברמת החיידק הבודד מנוטרים על ידי הדמיית SRS. ריכוז ההשתקה של חילוף החומרים החד-תאי (SC-MIC) של חיידקים בעת חשיפה לאנטיביוטיקה יכול להתקבל לאחר סך של 2.5 שעות של הכנת דגימה וזיהויה. יתר על כן, שיטת AST מהירה זו ישימה ישירות על דגימות חיידקים בסביבות ביולוגיות מורכבות, כגון שתן או דם שלם. הדמיה מטבולית SRS של שילוב דאוטריום היא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

Introduction

עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא איום עולמי הולך וגובר על הטיפול היעיל במחלות זיהומיות1. התחזית היא ש-AMR יגרום ל-10 מיליון מקרי מוות נוספים בשנה ולאובדן תוצר עולמי של 100 טריליון דולר עד 2050 אם לא תינקט פעולה למאבק בחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. זה מדגיש את הצורך הדחוף בשיטות אבחון מהירות וחדשניות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) של חיידקים זיהומיים כדי להאט את הופעתם של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ולהפחית את שיעור התמותה הקשור3. כדי להבטיח את התוצאה הקלינית הטובה ביותר האפשרית, חיוני להציג טיפול יעיל תוך 24 שעות. עם זאת, השיטה הנוכחית של תקן הזהב, כמו דיפוזיה של דיסק או שיטת דילול מרק, דורשת בדרך כלל לפחות 24 שעות עבור הליך קדם-דגירה עבור דגימות קליניות ועוד 16-24 שעות כדי להשיג את תוצאות הריכוז המעכב המינימלי (MIC). בסך הכל, שיטות אלה גוזלות זמן רב מכדי להנחות החלטה מיידית לטיפול במחלות זיהומיות במרפאה, מה שמוביל להופעתה והתפשטותה של עמידות מיקרוביאלית4.

שיטות AST גנוטיפיות, כגון טכניקות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)5, פותחו לזיהוי מהיר. טכניקות כאלה מודדות את הרצפים הגנטיים הספציפיים של ההתנגדות על מנת לספק תוצאות AST מהירות. הם אינם מסתמכים על תרבית תאים גוזלת זמן; עם זאת, נבדקים רק רצפים גנטיים ידועים ספציפיים עם עמידות. לכן, היישום שלה מוגבל מינים חיידקים שונים או מנגנונים שונים של התנגדות. כמו כן, הם לא יכולים לספק תוצאות MIC עבור החלטות טיפול 6,7. חוץ מזה, שיטות פנוטיפיות חדשניות עבור AST מהיר נמצאות בפיתוח כדי להתגבר על מגבלות אלה8, כולל התקנים מיקרופלואידיים 9,10,11,12,13, התקנים אופטיים14,15,16, AST פנוטיפי לכימות חומצות גרעין עותק מספר17,18, ושיטות ספקטרוסקופיות של ראמאן 19, 20,21,22,23,24. שיטות אלה מקצרות את הזמן להנחיית תוצאות AST, אולם רובן ישימות רק לחיידקים מבודדים, לא ישירות לדגימות קליניות, ועדיין דורשות קדם-דגירה ארוכת זמן.

בעבודה זו אנו מציגים שיטה לקביעה מהירה של רגישות חיידקים בשתן ובדם שלם באמצעות ניטור הפעילות המטבולית התאית על ידי הדמיית SRS. מים (H2O) לוקחים חלק ברוב המכריע של תהליכי סינתזה ביומולקולריים חיוניים בתאים חיים. כאיזוטופולוג של מים, באמצעות תגובת חילופי H/D מזורזת אנזימים בין אטום המימן הפעיל חמצון-חיזור ב-NADPH לבין אטום D ב-D2O, ניתן לשלב דאוטריום בביומסה בתוך תא25,26. תגובת סינתזה של חומצות שומן מתווכת על ידי דאוטריום שכותרתו NADPH. השילוב של D2O בתגובות של חומצות אמינו (AAs) גורם לייצור חלבון מפורק26 (איור 1). בדרך זו, ניתן להשתמש בביומולקולות המכילות קשר C-D שזה עתה סונתז בתאים מיקרוביאליים בודדים כסמן פעילות מטבולית כללית שיש לזהות. כדי לקרוא קשרי C-D מסונתזים דה נובו, ספקטרוסקופיית ראמאן, כלי אנליטי רב-תכליתי המספק מידע כימי ספציפי וכמותי של ביומולקולות, נמצאת בשימוש נרחב כדי לקבוע רגישות מיקרוביאלית ולהפחית באופן משמעותי את זמן הבדיקה למספר שעות27,28,29,30 . עם זאת, בשל היעילות הנמוכה האינהרנטית של תהליך פיזור ראמאן, הספקטרוסקופיה הספונטנית של ראמאן היא בעלת רגישות גילוי נמוכה. לכן, מאתגר להשיג תוצאות תמונה בזמן אמת באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית. פיזור ראמאן קוהרנטי (CRS), כולל פיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS), הגיע לרגישות גילוי גבוהה בגלל שדה האור הקוהרנטי כדי ליצור סדרי גודל גדולים יותר מאלה של ספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית, ובכך להפוך הדמיה כימית מהירה, ספציפית וכמותית ברמת התא הבודד 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

כאן, בהתבסס על העבודה האחרונה שלנו40, אנו מציגים פרוטוקול לקביעה מהירה של הפעילות המטבולית והרגישות האנטי-מיקרוביאלית על ידי הדמיית femtosecond SRS C-D של שילוב D2O של חיידקים במדיום הרגיל, בשתן ובסביבת הדם כולה ברמת התא הבודד. הדמיית Femtosecond SRS מאפשרת לנטר את ריכוז ההשבתה של חילוף החומרים של תא בודד (SC-MIC) נגד אנטיביוטיקה ברמת החיידק היחיד תוך 2.5 שעות. תוצאות SC-MIC מאומתות על-ידי בדיקת MIC סטנדרטית באמצעות מיקרו-דילול מרק. השיטה שלנו ישימה לקביעת רגישות אנטי מיקרוביאלית של חיידקי דלקת בדרכי השתן (UTI) ופתוגנים של זיהום בזרם הדם (BSI) עם זמן בדיקה קצר בהרבה בהשוואה לשיטה הקונבנציונלית, מה שפותח את ההזדמנות ל- AST פנוטיפי מהיר במרפאה ברמת התא הבודד.

Protocol

השימוש בדגימות דם אנושיות הוא בהתאם להנחיות ה- IRB של אוניברסיטת בוסטון והמכונים הלאומיים לבריאות (NIH). באופן ספציפי, הדגימות הן מבנק והן מזוהות לחלוטין. דגימות אלה אינן נחשבות לנבדקים אנושיים על ידי משרד מועצת הביקורת המוסדית (IRB) באוניברסיטת בוסטון.

1. הכנת חיידקים ותמיסת מלאי אנטיביוטיקה

  1. הכן את תמיסת המלאי של האנטיביוטיקה (גנטמיצין סולפט או אמוקסיצילין) בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל המומס בממס מלח סטרילי1x עם אגירת פוספט (PBS) או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בצינורות מיקרו של 1.5 מ"ל. להמיס גנטמיצין סולפט בתמיסת PBS סטרילית ואמוקסיצילין בממס DMSO סטרילי. לאחר מכן, יש לאחסן את תמיסת האנטיביוטיקה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס כפי שהוצע.
  2. כדי ליצור את D 2 O המכיל מדיית מרק מולר-הינטון (MHB) מותאמת קטיון, הוסף 220 מ"ג של בסיס ציר MHB ל-10 מ"ל של D 2 O כדי ליצור 100%D2O המכיל מדיום. לעקר את הפתרון על ידי סינון עם מסננים של 200 ננומטר גודל נקבוביות.
    הערה: השתמש בפרוטוקול זה תמיד לייצור ועיקור פתרונות בינוניים בשלבים נוספים.
  3. כדי להכין דגימות חיידקים להדמיית SRS, הוסף 2 מ"ל של מדיה MHB רגילה, שאינה מכילה דאוטריום, לצינור תרבית סטרילי בעל תחתית עגולה, ולאחר מכן חמם אותה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. השתמש בלולאה סטרילית כדי לבחור חיידק אחד (Escherichia coli BW 25113 או Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) מושבה מהתרבית הטרייה על צלחת אגר סויה טריפטית. לאחר מכן להשעות אותו במדיית התרבית שחוממה מראש ומערבלים בעדינות כדי להכין את תרחיף החיידקים.
  5. דגירה של חיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר ב-200 סיבובים לדקה (סל"ד) עד שהיא מגיעה לשלב הלוגריתמי.

2. D2O שילוב טיפול בנוכחות אנטיביוטיקה (איור 2a)

  1. בדוק את ריכוז החיידקים על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.
  2. דלל את התמיסה החיידקית באמצעות מדיום MHB רגיל, שאינו מכיל דאוטריום, כדי להגיע לריכוז תאים סופי של 8 x 105 CFU / mL. מערבולת בעדינות כדי לערבב את תאי החיידקים.
  3. הכן 300 μL aliquots של התמיסה החיידקית בשבעה צינורות מיקרו 1.5 מ"ל, ו 600 μL aliquots של התמיסה החיידקית בצינור מיקרו אחד 1.5 מ"ל.
  4. הוסף 4.8 μL של תמיסת מלאי אנטיביוטית (gentamicin או amoxicillin) (1 מ"ג/מ"ל) לתוך צינור מיקרו המכיל 600 μL של תמיסת החיידקים, כדי להפוך את הריכוז האנטיביוטי הסופי ל 8 מיקרוגרם / מ"ל.
  5. יש ליטול 300 מיקרוליטר של תמיסה מתוך 8 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת חיידקים המכילה אנטיביוטיקה, ולהוסיף לתמיסת חיידקים נוספת של 300 מיקרוגרם/מ"ל, כדי ליצור תמיסה אנטיביוטית מדוללת כפולה (4 מיקרוגרם למ"ל) המכילה חיידקים.
  6. חזור על הדילול הסדרתי הכפול של אנטיביוטיקה בדיקה, gentamicin, או amoxicillin, עד צינור מיקרו עם הריכוז הנמוך ביותר (0.25 מיקרוגרם / מ"ל) הוא הגיע, ולהשליך 300 μL מן הצינור. הן עבור גנטמיצין והן עבור אמוקסיצילין, הריכוזים הסדרתיים נעים בין 0.25 מיקרוגרם למ"ל - 8 מיקרוגרם למ"ל.
    1. השאירו צינור אחד ללא אנטיביוטיקה לשליטה ריקה. זו תהיה הבקרה החיובית לבדוק את הפעילות המטבולית של החיידקים ללא טיפול אנטיביוטי אלא עם טיפול D2O.
    2. השאירו צינור אחד ללא אנטיביוטיקה וללא D2O לבקרה השלילית.
  7. לדגום את החיידק אליקוט עם אנטיביוטיקה מסוימת (gentamicin או amoxicillin) המכילה מדיום MHB במשך שעה אחת.
  8. במהלך הדגירה, הכינו דילול סדרתי של אנטיביוטיקה עם 100% D 2 O המכיל מדיום עם אותו שיפוע ריכוז של אנטיביוטיקה שהוכן בשלב2.6. הן עבור גנטמיצין והן עבור אמוקסיצילין, הריכוזים הסדרתיים נעים בין 0.25 מיקרוגרם למ"ל - 8 מיקרוגרם למ"ל.
  9. לאחר טיפול אנטיביוטי של שעה אחת, יש להוסיף 700 μL של אנטיביוטיקה מדוללת סדרתית ו-100% D 2 O המכילה MHB ל-300 μL של חיידקים שטופלו מראש באנטיביוטיקה באותו ריכוז אנטיביוטי (מוכן בשלב2.6), בהתאמה.
    1. לדוגמה, להוסיף 700 μL של 100% D2O המכיל מדיום MHB (המכיל 8 מיקרוגרם / מ"ל של אנטיביוטיקה) ל 300 μL של 8 מיקרוגרם / mL חיידקים שטופלו מראש אנטיביוטיקה. באותו אופן, להעביר את הצינורות המתאימים של הריכוז הבא, הומוגני על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
    2. הוסף 700 μL של 100% D2O ללא אנטיביוטיקה המכיל MHB בינוני ל 300 μL של חיידקים ללא אנטיביוטיקה (מוכן בשלב 2.6.1) כבקרה ריקה.
    3. דגירה ב-37°C בשייקר דגירה ב-200 סל"ד למשך 30 דקות נוספות.
      הערה: בשלב זה, הריכוז הסופי של D2O במדיום עבור הבדיקה הוא 70%.
  10. תחילה צנטריפוגה 1 מ"ל של אנטיביוטיקה ו D2O דגימת חיידקים מטופלים ב 6200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם מים מטוהרים. לבסוף, לתקן דגימות בתמיסת 10% פורמלין ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת חיידקים בסביבת שתן (איור 2b)

  1. כדי להכין את E. coli BW 25113 בשלב הלוגריתמי, בצע את השלבים ב 1.4 ו 1.5.
  2. בדוק את ריכוז החיידקים על ידי מדידת OD עם פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.
  3. כדי לחקות את דגימות ה-UTIהקליניות 14,18,41, יש להקפיץ את תמיסת E. coli ל-10 מ"ל של שתן נטול זיהוי כדי להגיע לריכוז תאים סופי של 10 6 CFU/mL.
  4. סנן את השתן של E. coli באמצעות מסנן של 5 מיקרומטר, ולאחר מכן חלק את התמיסה החיידקית ב- 300 μL aliquots לשבע שפופרות מיקרו של 1.5 מ"ל, ו- 600 μL aliquots של התמיסה החיידקית בצינור מיקרו אחד של 1.5 מ"ל.
  5. בצע טיפול משולבD 2 O בנוכחות אנטיביוטיקה ואיסוף דגימות כמתואר בשלבים הקודמים מ 2.4 עד 2.10.

4. הכנת חיידקים בסביבת הדם (איור 2c)

  1. כדי להכין Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 בשלב הלוגריתמי, בצע את השלבים ב 1.4 ו 1.5.
  2. כדי לחקות את הזיהומים הקליניים בזרם הדם דגימות42,43, ספייק P. aeruginosa ב 1 מ"ל של דם אנושי deidentified להגיע לריכוז של 107 CFU / mL.
  3. הוסף 9 מ"ל של מים מטוהרים סטריליים כדי lyse את הדם.
  4. סנן את הדם P. aeruginosa באמצעות מסנן 5 מיקרומטר. לאחר מכן קצירת חיידקים לנפח של 1 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 6200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.  הוסיפו 9 מ"ל של MHB רגיל שחומם מראש לתמיסת החיידקים ומערבל בעדינות. הריכוז הסופי של חיידקים הוא 106 CFU/מ"ל
  5. חלקו את תמיסת הדם המקוצרת P. aeruginosa ב-300 μL aliquots לשבעה צינורות מיקרו של 1.5 מ"ל, ו-600 μL aliquots של התמיסה החיידקית בצינור מיקרו אחד של 1.5 מ"ל.
  6. בצע טיפול משולבD 2 O בנוכחות אנטיביוטיקה ואיסוף דגימות כמתואר בשלבים הקודמים מ 2.4 עד 2.10.

5. הדמיית SRS של שילוב מטבולי D2O בחיידק יחיד

  1. לשטוף 1 מ"ל של תמיסת חיידקים קבועים עם מים מטוהרים ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט. להעשיר את התמיסה החיידקית לכ-20 μL.
  2. הפקד את תמיסת החיידקים על כיסוי מצופה פולי-L-ליזין. כריך ואטום את הדגימה להדמיית SRS.
  3. דמיינו חיידקים בתדר הרטט C-D ב-2168 ס"מ-1 באמצעות מיקרוסקופ SRS.
    1. הזן וכוונן את אורך הגל של המשאבה ל-852 ננומטר באמצעות תוכנת הבקרה במחשב.
    2. מדוד את עוצמת הלייזר באמצעות מד כוח. הגדר את עוצמת לייזר המשאבה בדגימה ל~8 mW ואת העוצמה של לייזר סטוקס בדגימה ל~40 mW על ידי התאמת צלחת חצי הגל לפני פלט הלייזר.
      הערה: במיקרוסקופ SRS, לייזר פמטו-שניות הניתן לכוונון עם קצב חזרות של 80 מגה-הרץ מספק את לייזרי העירור של המשאבה (680 עד 1300 ננומטר) וסטוקס (1045 ננומטר).
  4. על ידי כוונון הברגים של מראות ההשתקפות, יישרו מרחבית את המשאבה ואת אלומות סטוקס והכוונו את שתי הקרניים למיקרוסקופ זקוף המצויד במערכת מראות גלבו דו-ממדית לסריקת לייזר.
    1. השתמש במטרה לטבול במים פי 60 כדי למקד את המשאבה ובלייזרים של סטוקס על הדגימה.
    2. השתמש במעבה שמן כדי לאסוף את האותות מהדגימה בכיוון קדימה.
    3. השתמש במסנן פס כדי לסנן את לייזר סטוקס לפני הפנייתו לפוטודיודה.
    4. חלץ את אות הראמן המגורה על ידי מגבר נעילה וזהה את האותות על ידי הפוטודיודה.
  5. הגדר כל תמונת SRS כך שתכיל 200 x 200 פיקסלים וזמן השהייה של הפיקסלים הוא 30 μs בלוח הבקרה של התוכנה. זמן הרכישה הכולל עבור תמונה אחת הוא ~ 1.2 שניות. הגדר את גודל הצעד ל- 150 ננומטר, כך שגודל התמונה הוא בערך 30 x 30 מיקרומטר2. תמונה של לפחות שלושה שדות תצוגה עבור כל דוגמה.

6. עיבוד תמונה וניתוח נתונים (איור 3)

  1. כדי לקבל את עוצמת אות C-D הממוצעת, פתח ועבד תמונות SRS באמצעות תוכנת ImageJ.
  2. תחילה, המירו תמונות SRS לתמונות מסוג 8 סיביות עם צבע הפוך בלחיצה על Image | סוג | 8 סיביות ולאחר מכן ערוך | הפוך לחצנים בתוכנת ImageJ.
  3. לאחר מכן, סנן את התמונות עם טשטוש גאוס על ידי לחיצה על תהליך | מסננים | גאוס מטשטש כפתורים והגדר את הסיגמא (רדיוס) ל-1.
  4. השתמשו בהתאמת סף התמונה כדי לבחור את אזור החיידקים. לחץ על תמונה | התאמת | סף כדי להבטיח שגדלי החיידקים שנבחרו יתאימו לאלה שבתמונות SRS המקוריות. בטל חלקיקים קטנים על ידי התאמת סף הגודל כדי לקבוע את החלקיקים. לחץ על החל.
  5. החלת | ניתוח לחצני ניתוח חלקיקים כדי לסמן ולקבוע את אזור החיידקים.
  6. על ידי לחיצה על הלחצן Show All במנהל החזר ההשקעה לתמונת ה-SRS המקורית שאינה מעובדת, תייג את אותו אזור של חיידקים, קבע את העוצמה הממוצעת של כל נקודת נתונים על-ידי לחיצה על לחצן מדידה במנהל החזר ההשקעה.
  7. הקיפו בעיגול את אזור הרקע בתמונת ה-SRS המקורית ומדדו את העוצמה הממוצעת של הרקע. עוצמות C-D ממוצעות של כל חיידק מתקבלות על ידי ניכוי עוצמת אות הרקע.

7. כמות של רגישות מיקרוביאלית באמצעות SC-MIC

הערה: ערך החיתוך ב- 0.60 כדי לקבוע את ה- SC-MIC נקבע על פי הניתוח הסטטיסטי של עוצמות ה- SRS C-D של התנאים הפעילים בחילוף החומרים והמעוכבים בחילוף החומרים עבור חיידקים בריכוזים שונים של חשיפה לתרופות40. עוצמות ה-C-D של הקבוצות הרגישות לאנטיביוטיקה והעמידות לאנטיביוטיקה הותאמו בחלוקה נורמלית.

  1. התווה את עקומת מאפיין ההפעלה של המקלט (ROC) והערך את סף החיתוך ב- 0.60. בהתבסס על ערך חיתוך זה, ניתן להגדיר את ה- SC-MIC כאינדיקטור ליעילות האנטיביוטיקה כדי לקבוע את הקבוצה הלא פעילה מטבולית והפעילה מטבולית.
  2. כדי לנתח באופן כמותי את נתוני ההדמיה של SRS, התווה את ההיסטוגרמות של עוצמות אות C-D עבור כל קבוצת חיידקים שטופלה בריכוז האנטיביוטיקה המדולל סדרתי. נקודות הנתונים הצבעוניות מייצגות חיידקים בודדים שונים.
  3. לנרמל את עוצמות ה- C-D של הקבוצה המטופלת באנטיביוטיקה לעוצמה הממוצעת של קבוצת הביקורת ללא טיפול אנטיביוטי. קבע את תוצאות SC-MIC של חיידקים שונים ושילובי אנטיביוטיקה על ידי כימות עוצמות האות SRS באזור C-D לעומת ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה באמצעות ערך החיתוך ב- 0.60.
  4. אמת והשווה את קריאת SC-MIC עם המיקרופון שנקבע באמצעות בדיקת מיקרודילוציה קונבנציונלית של מרק.
  5. על פי מכון התקנים הקליניים והמעבדתיים (CLSI), קטגוריית הרגישות המבוססת על תוצאות ההדמיה המטבולית של SRS עבור כל זן חיידקים שנבדק מתפרשת כ"רגיש", "עמיד", או "ביניים".

תוצאות

ההשפעה של זמן הדגירה על התאגדות דאוטריום נמדדת על-ידי מיקרוספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית באזור C-D (2070 עד 2250 ס"מ-1) ו-C-H (2,800 עד 3,100 ס"מ-1) (איור 4a). ספקטרום הראמן החד-תאי בעל קיטועי הזמן של P. aeruginosa בתרבית ב-70% D2O המכיל מדיום מראה עלייה בעוצמת CD/CH לאורך זמן הדגיר?...

Discussion

ניתן להשיג AST מהיר על ידי הערכת התגובה של פעילות מטבולית חיידקית לטיפול אנטיביוטי באמצעות הדמיה מטבולית של SRS חד-תאי תוך 2.5 שעות מהדגימה לתוצאות SC-MIC. ניתן לזהות את התגובה של פעילות מטבולית חיידקית ורגישות מיקרוביאלית על ידי ניטור השילוב המטבולי של D2O לסינתזה של ביו-מולקולות באמצעות ה?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01AI141439 ל- J.-X.C ו- M.S, ו- R35GM136223 ל- J.-X.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved