JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن لبروتين الأجسام المضادة المؤتلف المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO والأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنتجة باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية التعرف على بروتين أمينوببتيداز N (APN) الخنازير والارتباط به.

Abstract

يمكن ل Porcine aminopeptidase N (APN) ، وهو ميتالوببتيداز مرتبط بالغشاء موجود بكثرة في الغشاء المخاطي في الأمعاء الدقيقة ، أن يبدأ استجابة مناعية مخاطية دون أي تدخل مثل انخفاض تعبير البروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية. هذا يجعل APN مرشحا جذابا في تطوير اللقاحات التي تستهدف بشكل انتقائي ظهارة الغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات السابقة أن APN هو بروتين مستقبلات لكل من الإشريكية القولونية المعوية (E. coli) F4 وفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال. وبالتالي ، فإن APN تبشر بالخير في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة أو اللقاحات الجديدة القائمة على الأجسام المضادة الخاصة ب APN. في هذه الدراسة ، قارنا إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة ب APN (mAbs) باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية وطريقة التعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة. أنشأنا أيضا خط خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) المنقول بشكل ثابت باستخدام pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN وسلالة تعبير الإشريكية القولونية BL21 (DE3) التي تؤوي ناقل pET28a (+) -rAbs-APN. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة المعبر عنها في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المنتجة باستخدام الأورام الهجينة يمكن أن تتعرف على بروتين APN وترتبط به. وهذا يوفر الأساس لمزيد من التوضيح لوظيفة مستقبلات APN لتطوير العلاجات التي تستهدف مختلف الحواتم الخاصة ب APN.

Introduction

يعمل Aminopeptidase N (APN) ، وهو إنزيم يعمل في ضوء القمر ينتمي إلى عائلة ميتالوبروتيناز M1 ، كعلامة للورم ومستقبلات وجزيء إشارة عبر مسارات تعتمد على الإنزيم ومستقلة عن الإنزيم 1,2. بالإضافة إلى شق بقايا الأحماض الأمينية N-terminal لمختلف الببتيدات النشطة بيولوجيا لتنظيم نشاطها البيولوجي ، يلعب APN دورا مهما في التسبب في الأمراض الالتهابية المختلفة. تشارك APN في معالجة المستضد وعرضه بواسطة الببتيدات المشذبة التي ترتبط بإحكام بجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسية من الفئةالثانية 2,3. يمارس APN أيضا تأثيرات مضادة للالتهابات عن طريق الارتباط بمستقبلات البروتين G المقترنة المشاركة في نقل الإشارات المتعددة ، وتعديل إفراز السيتوكين ، والمساهمة في البلعمة بوساطة مستقبلات جاما Fc في الاستجابة المناعية4،5،6،7.

باعتباره exopeptidase المرتبط بالغشاء الموزع على نطاق واسع ، فإن APN وفير في الغشاء المخاطي المعوي الصغير الخنازير ويرتبط ارتباطا وثيقا ب endocytosis بوساطة المستقبلات1،5،8. يتعرف APN على البروتين الشوكي لفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال ويربطه لدخول الخلايا ، ويتفاعل مباشرة مع الوحدة الفرعية FaeG من الإشريكية القولونية المعوية F4 fimbriae للتأثير على الالتصاق البكتيري بالخلايا المضيفة9،10،11. وبالتالي ، فإن APN هو هدف علاجي محتمل في علاج الأمراض المعدية الفيروسية والبكتيرية.

منذ تطوير تقنية الورم الهجين والاستراتيجيات الأخرى لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في عام 1975 ، تم استخدام mAbs على نطاق واسع في العلاج المناعي وتوصيل الأدوية والتشخيص12،13،14. حاليا ، يتم استخدام mAbs بنجاح لعلاج الأمراض ، مثل السرطان ومرض التهاب الأمعاء والتصلب المتعدد12,15. نظرا لتقاربها القوي وخصوصيتها ، يمكن أن تكون mAbs أهدافا مثالية في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة (ADC) أو اللقاحات الجديدة16,17. يعد بروتين APN أمرا بالغ الأهمية لتوصيل المستضدات بشكل انتقائي إلى خلايا معينة ، ويمكن أن يثير استجابة مناعية مخاطية محددة وقوية ضد مسببات الأمراض دون أي تدخل بما في ذلك التعبير المنخفض للبروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية5،8،18. لذلك ، فإن المنتجات العلاجية القائمة على mAbs الخاصة ب APN تبشر بالخير ضد الالتهابات البكتيرية والفيروسية. في هذه الدراسة ، نصف إنتاج mAbs الخاصة ب APN باستخدام تقنية الورم الهجين ، والتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة المضادة ل APN (rAbs) باستخدام نواقل بدائية النواة وحقيقية النواة. تشير النتيجة إلى أنه تم التعرف على بروتين APN من قبل كل من rAbs المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المشتقة من الورم الهجين.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة يانغتشو (SYXK20200041).

1. تحضير مستضد بروتين APN الخنازير

ملاحظة: تم بناء سلالة pET28a (+) -APN-BL21 (DE3) والخلايا المعبر عنها بثبات APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 في دراسة سابقة11.

  1. استرجع البكتيريا من مخزون الجلسرين المجمد وخط على ألواح Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (كم +) لعزل مستعمرة واحدة.
  2. اختر مستعمرة واحدة من الصفيحة المخططة حديثا ، واستزراع 4 مل من وسط LB (10 جم / لتر تريبتون ، 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (NaCl) و 5 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، درجة الحموضة 7.2) مكملة ب KM + (50 ميكروغرام / مل) ، واتركها تنمو طوال الليل (12-16 ساعة) مع التقليب (178 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
  3. تمييع البكتيريا المحضرة في 1: 100 في مرق Km+ LB الطازج وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 2-3 ساعات حتى يصل OD600 إلى 0.4-0.6.
  4. أضف الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى الوسط إلى تركيز نهائي قدره 0.4 mM ، واحتضان المستنبتات لمدة 10 ساعات إضافية عند 16 درجة مئوية.
  5. وبالتالي ، أجهزة الطرد المركزي وحصاد البكتيريا باستخدام تحريض IPTG (10000 × جم ، 4 درجات مئوية 15 دقيقة).
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت LEW (التحلل / التوازن / الغسيل) (50 mM فوسفات الصوديوم اللامائي أحادي القاعدة (NaH2PO4) و 300 mM NaCl ، درجة الحموضة 8.0) التي تحتوي على 1 مجم / مل ليزوزيم. حرك المعلق البكتيري لمدة 30 دقيقة على الثلج وصوتنيكات تماما (15 ثانية نبضة و 20 ثانية ، 15 دقيقة) باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية.
  7. أجهزة الطرد المركزي تتحلل الخلية الخام عند 4 درجات مئوية و 10000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. نقل طافت في عمود متوازن مسبقا واحتضان 1-2 دقيقة قبل تصريف الجاذبية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  8. اغسل العمود باستخدام 20 مل من المخزن المؤقت LEW وصفيه باستخدام الجاذبية. تخلص من بروتين APN الموسوم بالهيستيدين باستخدام 9 مل من محلول الشطف (50 mM NaH2PO4 و 300 mM NaCl و 250 mM imidazole ، درجة الحموضة 8.0) واجمعها في أنابيب غسيل الكلى.
  9. قم بغسيل محلول البروتين طوال الليل عند 4 درجات مئوية في كربونات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم (PBS ، 135 mM NaCl ، 4.7 mM كلوريد البوتاسيوم ، 2 mM NaH 2 PO4 ، و 10 mM dodecahydrate sodium phosphate dibasic ، pH7.2) buffer.
  10. قم بالتحليل باستخدام جل SDS-PAGE بنسبة 12.0٪ ونشاف غربي لتقييم نقاء بروتين APN.
    1. قم بتحميل 5 ميكروغرام من البروتين في كل بئر من الجل واتركه يعمل عند 110 فولت لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، انقل البروتين إلى غشاء PVDF لمدة 50 دقيقة عند 15 فولت. حدد تركيز البروتين المنقى باستخدام مقايسة BCA.

2. تحصين الحيوانات

  1. تحت الجلد (s.c) حقن الفئران الإناث BALB / c ، 6-8 أسابيع من العمر ، مع 50 ميكروغرام من بروتين APN أو PBS (السيطرة السلبية) مختلطة مع المواد المساعدة مرة واحدة كل 2 أسابيع. استخدم مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على المتفطرات المقتولة بالحرارة للتحصين الأولي ، ومساعد فرويند غير المكتمل للتطعيمات المعززة. امزج كميات متساوية من بروتين APN (أو PBS) ومساعد فرويند أو مساعد فرويند غير المكتمل ، على التوالي.
  2. الكشف عن عيار الأجسام المضادة ضد APN في أمصال هذه الفئران عن طريق مقايسة الممتز المناعي غير المباشر المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام صفيحة عيار ميكروي مغلفة ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (درجة الحموضة 9.6). .

3. تقنية الورم الهجين لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد APN

  1. داخل الصفاق (i.p.) حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN في الفئران المختارة لتعزيز المستضد النهائي.
  2. بعد ثلاثة أيام ، القتل الرحيم للفئران باستخدام صوديوم بنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، v / v ، داخل الصفاق) وخلع عنق الرحم.
  3. جمع الطحال ، وغسل مع DMEM مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية. قم بتصفية تعليق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة لإزالة حطام الأنسجة ، وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) لإزالة غشاء الطحال.
  4. خلايا المايلوما الفأرية البذور SP2 / 0 في قارورة 25 سم 2 تحتوي على 5 مل من DMEM تستكمل مع 6٪ مصل بقري جنيني (FBS) وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ جوCO 2 للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد 5-6 أيام من المزرعة ، تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ بعد الإنعاش وهي في مرحلة سجل النمو. تحت المجهر ، تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وواضحة.
  5. قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران وفقا لطريقة منشورة مسبقا12,19.
  6. البلاعم البريتونية للبذور بكثافة 0.1-0.2 × 105 / مل في 96 صفيحة بئر ، كل بئر يحتوي على 100 ميكرولتر من وسط HAT (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1x HAT Supplement) ، وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 6٪ CO2 جو مرطب طوال الليل.
  7. للتهجين ، قم بشفط خلايا SP2 / 0 برفق باستخدام ماصة من 8-10 زجاجات ، وقم بتعليقها في 10 مل من وسط DMEM الخالي من المصل. اغسل الخلايا باستخدام DMEM الطازج ، وأجهزة الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) مرتين ، ثم أعد تعليقها في 10 مل من DMEM.
  8. امزج خلايا الطحال الكمية مع خلايا SP2 / 0 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) وتخلص من المادة الطافية. اجمع كريات الخلايا في الجزء السفلي من الأنابيب واضغط براحة اليد لفك الكريات قبل التهجين.
  9. أضف 1 مل من البولي إيثيلين جلايكول 1500 (PEG 1500) ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، بالتنقيط باستخدام قطارة إلى حبيبات الخلية المفكوكة على مدار فترة زمنية تبلغ 45 ثانية أثناء تدوير قاع الأنبوب برفق.
  10. أضف ببطء 1 مل من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط أعلاه على مدار 90 ثانية ، متبوعا ب 30 مل أخرى من DMEM الطازج. ضع أنبوب الانصهار في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. بعد الحضانة في الحمام الدافئ ، قم بحصاد الخلايا وإعادة تعليقها في وسط HAT. ثم الثقافة في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالبلاعم البريتونية.
  12. بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسط HAT الطازج إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 5 أيام إضافية ، وبعد ذلك استبدل الوسط بوسط HT (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1x HT Supplement).
  13. استخدم صفيحة عيار دقيقة مغلفة ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (درجة الحموضة 9.6) لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طافية الورم الهجين باستخدام مقايسة ELISA.
    1. عندما يتحول الوسط الموجود في آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى اللون الأصفر (بسبب نمو الخلايا وإطلاق المستقلب ، ينخفض الرقم الهيدروجيني في الوسط إلى 6.8 ، ويتحول الفينول الأحمر من الفوشيه إلى الأصفر) أو تلاحظ مجموعات الخلايا ، احصل على 100 ميكرولتر طاف من الآبار المختارة وأضفها إلى آبار صفيحة ELISA المطلية. استخدم قارئ الصفائح الدقيقة لقياس قيم OD450.
    2. استخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد APN ومصل الفأر غير المصاب كعنصر تحكم إيجابي وسلبي ، على التوالي ، واستخدم PBS كعنصر تحكم فارغ. في هذه الدراسة ، تم التعرف على نسبة OD450 للعينة إلى التحكم السلبي (P / N) ≥ 2.1 كمعيار اختيار إيجابي.
  14. بعد ثلاث جولات اختيار إيجابية متتالية ، حدد الورم الهجين الذي يظهر استجابة مصلية متزايدة ضد بروتين APN لمقايسة تخفيف محدودة.
    1. تحضير الضامة البريتونية والبذور في 96 لوحة بئر كما هو موضح سابقا.
    2. تعليق خلايا الورم الهجين في وسط HT بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر وزراعةفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 6٪. كرر هذه الخطوة ثلاث أو أربع مرات حتى يصل المعدل الإيجابي المشار إليه بواسطة المقايسة المناعية ELISA إلى 100٪.
  15. تحت ضغط التجميد والذوبان المستمر ، حدد خلايا الورم الهجين الإيجابية القادرة على إفراز الأجسام المضادة المضادة ل APN بثبات والتكاثر بشكل طبيعي.
    1. تطبيق حقنة واحدة بحجم 0.3 مل من البريستان لكل فأر (8-10 أسابيع). في 10 أيام بعد تلقي البكر ، حقن كل فأر مع 2-5 × 10 5 خلايا الورم الهجين في0.5 مل من PBS (درجة الحموضة 7.2).
    2. جمع بعناية السائل البريتوني من التجويف البريتوني لهذه الفئران بعد 8 إلى 10 أيام من الحقن.
    3. حصاد المواد الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة ، وتنقية الأجسام المضادة في المواد الطافية باستخدام 33٪ كبريتات الأمونيوم المشبعة [(NH 4) 2SO4] الترسيب وبروتين أغاروز.

4. توصيف mAbs مقابل بروتين APN

  1. تحديد النوع الفرعي للغلوبولين المناعي ل mAbs التي تم جمعها باستخدام نظام التنميط الاستنسيلي SBA-HRP20. استخدم SDS-PAGE والنشاف الغربي لتقييم نقاء mAb ونوعيته.
  2. تحليل خصوصية mAb epitope مقابل بروتين APN باستخدام ELISA21. قيمة الإضافة (AV) هي نسبة OD mAbs (a + b) إلى (OD mAbs-a + OD mAbs-b) ، والتي تستخدم لتقييم ما إذا كانتmAbs تتعرف على نفس موقع المستضد. يمثل OD mAbs-a و OD mAbs-b قيم OD450 لمختلف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد APN وحده ، ويمثل OD mAbs(a + b) قيم OD450 لمزيج 1: 1 من اثنين منmAbs ضد APN.
    1. قم بتقييم كل عينة على الأقل أربع نسخ مكررة ، وكرر التجربة بأكملها ثلاث مرات على الأقل.

5. التعبير عن rAbs ضد APN

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من خلايا الورم الهجين المذكورة أعلاه والطحال من الفئران المحصنة ضد APN (على سبيل المثال ، TRIzol) 22. توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة تخليق cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تضخيم المناطق المتغيرة من mAbs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل وتحديد تسلسل السلسلة الثقيلة (VH) والسلسلة الخفيفة (VL) باستخدام التسلسل. تحليل الجينات التي تشفر VH و VL باستخدام أداة تحليل جينوم الماوس IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
  3. اجمع بين جينات VH و VL مع التسلسلات الرائدة واستنساخها بالتتابع في متجهات pET28a (+) و pIRES2-ZsGreen1 ، على التوالي ، باستخدام تقنية الاستنساخ السلس للسماح بإدخال جزء الحمض النووي بدون ندبات. يتم سرد الاشعال المحددة في الجدول 1.
  4. تنمو البكتيريا المحولة pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 في وجود 0.4 mM IPTG في الهزازات المدارية عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. ثم حث وتنقية وتقييم للتعبير عن بروتين rAbs باستخدام تنقية البروتين الروتينية.
  5. بذرة 100 ميكرولتر 0.5 × 105 خلايا CHO لكل بئر في صفيحة 96 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 6٪ لمدة 18-24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ ، قم بتخفيف بلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN مع Opti-MEM إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ، واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه للنقل.
  6. امزج بلطف 50 ميكرولتر من بلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN المخفف مع 1 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000 و 49 ميكرولتر من Opti-MEM ، واحتضن الخليط لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على خلايا CHO واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 6٪ لمدة 4-6 ساعات.
  7. في 4-6 ساعات بعد النقل ، استبدل الوسط بوسط DMEM-F12 المكمل ب 10٪ FBS ، واحتضان اللوحة لمدة 48 ساعة أخرى. ثم أضف 400 ميكروغرام / مل G418 إلى كل بئر لتحديد الخلايا المنقولة بثبات.
  8. بعد 10 أيام من الاختيار باستخدام وسيط DMEM-F12 المكمل ب 10٪ FBS و 400 ميكروغرام / مل G418 ، قم بفرز الخلايا (3.0 × 107 خلايا / مل) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. ما يقرب من 10-15 ٪ من سكان الخلايا كانت إيجابية.
  9. الخلايا الإيجابية المحصودة المخففة بشكل متسلسل ، والبذور بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا ، والاستزراعفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 6٪. حافظ على خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO المنقولة بثبات باستخدام الانتقاء مع G418 (200 ميكروغرام / مل).
  10. ينخفض تركيز FBS في وسط زراعة الخلايا الموصوف أعلاه تدريجيا من 10٪ إلى 0٪ خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي خلال فترة زمنية مدتها 3 أسابيع. بعد ذلك ، قم بتكييف خلايا CHO الملتصقة لتعليق النمو في وسط خال من المصل.
  11. استزراع خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO البذرة في مرحلة النمو اللوغاريتمي في وسط خال من المصل بكثافة 0.8-1.0 × 105 خلايا / مل في قوارير اهتزاز بسرعة اهتزاز 80-110 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ، 6٪ CO2.
  12. اجمع معلق الخلية كل 12 ساعة لتحديد التغييرات في صلاحية الخلية وحيويتها باستخدام مجموعة عد الخلايا (على سبيل المثال ، CCK-8) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  13. يصل تعبير الأجسام المضادة إلى مستويات الذروة عندما تنخفض صلاحية الخلية إلى 80٪ وتصل كثافة الخلية إلى 1.0-2.0 × 106 خلايا / مل. طافات خلايا الحصاد باستخدام الطرد المركزي ، والتصفية باستخدام مرشح غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين 0.22 ميكرومتر ، والتنقية باستخدام بروتين أغاروز.
  14. تأكيد إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب APN باستخدام مقايسات التألق المناعي غير المباشر (IFA).
  15. حدد عيار الأجسام المضادة وتقارب الارتباط باستخدام مقايسة ELISA كما هو موضح سابقا. 23 احسب ثابت تفكك التوازن (قيمة KD ) للأجسام المضادة باستخدام معادلة لوجستية رباعية المعلمات باستخدام البرنامج.

النتائج

في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتين APN المنقى القابل للذوبان (2.12 مجم / مل) لتحصين الفئران. أظهرت الفئران المحصنة ببروتين APN أربع مرات كل 14 يوما عيار أجسام مضادة أعلى ضد APN في أمصالها. على الرغم من الحصول على 14 ورم هجين باستخدام تجارب الاندماج ، إلا أن 9 أورام هجينة فقط نجت من دورات التجميد والذوب...

Discussion

يعد تحريض المناعة المخاطية أحد أكثر الأساليب فعالية في مواجهة مسببات الأمراض وفي الوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها. يشارك APN ، وهو بروتين مرتبط بغشاء عالي التعبير في الغشاء المخاطي المعوي ، في تحريض الاستجابة المناعية التكيفية وفي التداخل الخلوي الفيروسي والبكتيري بوساطة المستقبلات

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. وافق جميع المؤلفين وأعطوا موافقتهم الصريحة على نشر المخطوطة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 32072820 ، 31702242) ، والمنح المقدمة من منحة حكومة جيانغسو للدراسات الخارجية (JS20190246) والمواهب رفيعة المستوى لمؤسسة البحث العلمي بجامعة يانغتشو ، وهو مشروع أسسه البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لتطوير مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Complete Freund’s adjuvantSigma-AldrichF5881Animal immunization
DAPIBeyotime  BiotechnologyC1002Nuclear counterstain
DMEMGibco11965092Cell culture
DMEM-F12Gibco12634010Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyAbbkineA23310Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8Beyotime  BiotechnologyC0042Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serumGibco10091Cell culture
Geneticin Selective AntibioticGibco11811098Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 softwareGraphPad8.0Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)Gibco21060017Cell selection
HT Supplement (100X)Gibco11067030Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvantSigma-AldrichF5506Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosideSigma-AldrichI5502Protein expression
kanamycinBeyotime  BiotechnologyST102Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems SP8 STEDFluorescence imaging
Lipofectamine 2000 ReagentThermofisher11668019Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sortingBDFACS LSRFortessaFlow cytometry
Microplate readerBioTekBOX 998ELISA analysis
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Opti-MEMGibco31985088Cell culture
Polyethylene glycol 1500Roche Diagnostics10783641001Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis KitTakara BioRR047qPCR
protein A agaroseBeyotime  BiotechnologyP2006Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed ColumnsMACHEREY-NAGEL745120.5Protein purification
SBA Clonotyping System-HRPSouthern BiotechMay-00Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning KitBeyotime  BiotechnologyD7010SConstruction of plasmids
Shake flasksBeyotime  BiotechnologyE3285Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate bufferBeyotime  BiotechnologyC0221ACell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-rad 170-3940Western blot
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Ultrasonic HomogenizerNingbo Xinzhi BiotechnologyJY92-IINSample homogenization
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth
96-well microplateCorning3599Cell culture

References

  1. Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
  2. Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
  3. Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
  4. Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
  5. Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
  6. Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
  7. Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
  8. Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
  9. Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
  10. Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
  11. Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
  12. Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
  13. Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
  14. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  15. El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
  16. Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
  17. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  18. Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
  19. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
  20. Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
  21. Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
  22. Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
  23. Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
  24. Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
  25. Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
  26. Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 171 Aminopeptidase N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved