돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

요약

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현되는 재조합 항체 단백질과 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체는 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질을 인식하고 결합할 수 있습니다.

초록

소장 점막에 풍부하게 존재하는 막 결합 메탈로펩티다아제인 돼지 아미노펩티다아제 N(APN)은 낮은 단백질 발현, 효소 비활성 또는 구조적 변화와 같은 간섭 없이 점막 면역 반응을 시작할 수 있습니다. 따라서 APN은 점막 상피를 선택적으로 표적으로 하는 백신 개발에서 매력적인 후보가 됩니다. 이전 연구에서는 APN이 장독소성 대장균 (E. coli) F4와 전염성 위장염 바이러스 모두에 대한 수용체 단백질임을 보여주었습니다. 따라서 APN은 APN 특이적 항체를 기반으로 하는 항체-약물 접합체 또는 새로운 백신 개발에 대한 가능성을 보여줍니다. 본 연구에서는 전통적인 하이브리도마 기술과 재조합 항체 발현 방법을 이용한 APN 특이적 단일클론항체(mAb)의 생산을 비교하였다. 우리는 또한 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN 및 pET28a(+)-rAbs-APN 벡터를 보유하는 대장균 발현 BL21(DE3) 균 주를 사용하여 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 확립했습니다. 상기 결과는 하이브리도마를 사용하여 생산된 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포 및 mAbs에서 발현된 항체가 APN 단백질을 인식하고 결합할 수 있음을 보여줍니다. 이는 다양한 APN 특이적 에피토프를 표적으로 하는 치료제 개발을 위한 APN 수용체 기능의 추가 설명의 기초를 제공합니다.

서문

메탈로프로테이나제 M1 계열에 속하는 달빛 효소인 아미노펩티다아제 N(APN)은 효소 의존성 및 효소 비의존성 경로를 통해 종양 표지자, 수용체 및 신호 분자로 작용합니다 ^1,2. APN은 생물학적 활성을 조절하기 위해 다양한 생리활성 펩타이드의 N-말단 아미노산 잔기를 절단하는 것 외에도 다양한 염증성 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. APN은 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II 분자 ^2,3에 밀접하게 결합하는 절제된 펩타이드에 의한 항원 처리 및 제시에 참여합니다. APN은 또한 다중 신호 전달에 참여하는 G 단백질 결합 수용체와 결합하여 사이토카인 분비를 조절하고 면역 반응에서 Fc 감마 수용체 매개 식균 작용에 기여함으로써 항염증 효과를 발휘합니다 4,5,6,7.

널리 분포된 막 결합 엑소펩티다아제로서, APN은 돼지 소장 점막에 풍부하며 수용체 매개 엔도사이토시스(endocytosis)와 밀접한 관련이 있다 ^1,5,8. APN은 세포 진입을 위해 전염성 위장염 바이러스의 스파이크 단백질을 인식하고 결합하며, 장독소성 대장균 F4 섬유질의 FaeG 서브유닛과 직접 상호작용하여 숙주 세포에 대한 박테리아 부착에 영향을 미칩니다 9,10,11. 따라서, APN은 바이러스 및 세균성 감염성 질환의 치료에서 잠재적인 치료 표적이다.

1975년 하이브리도마 기술 및 단일클론항체(mAb) 생산을 위한 다른 전략의 개발 이후, mAbs는 면역요법, 약물 전달 및 진단에 널리 사용되어 왔다^12,13,14. 현재, mAbs는 암, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증과 같은 질병을 치료하는데 성공적으로 사용되고 있다^12,15. 강한 친화력과 특이성으로 인해, mAbs는 항체-약물 접합체(ADC) 또는 새로운 백신의 개발에서 이상적인 표적이 될 수 있다^16,17. APN 단백질은 항원을 특정 세포에 선택적으로 전달하는 데 중요하며 낮은 단백질 발현, 효소 불활성 또는 구조적 변화를 포함한 간섭 없이 병원체에 대한 특이적이고 강력한 점막 면역 반응을 유도할 수 있습니다 ^5,8,18. 따라서 APN 특이적 mAb를 기반으로 하는 치료제는 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 가능성을 보여줍니다. 이 연구에서는 하이브리도마 기술을 사용한 APN 특이적 mAb의 생산과 원핵 및 진핵 벡터를 사용한 항-APN 재조합 항체(rAb)의 발현에 대해 설명합니다. 상기 결과는 APN 단백질이 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현된 rAb 및 하이브리도마 유래 mAb 모두에 의해 인식되었음을 나타낸다.

프로토콜

본 연구의 모든 동물 실험은 양저우 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(SYXK20200041)의 승인을 받았습니다.

1. 돼지 APN 단백질 항원의 제조

참고: pET28a(+)-APN-BL21(DE3) 균주와 APN이 안정적으로 발현된 세포인 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2를 이전 연구¹¹에서 구성하였다.

1. 냉동 글리세롤 스톡에서 박테리아를 회수하고 단일 집락 분리를 위해 50μg/mL 카나마이신(Km⁺)이 포함된 Luria-Bertani(LB) 플레이트에 줄무늬를 붙입니다.
2. 갓 줄무늬가 있는 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 Km⁺ (50μg/mL)가 보충된 LB 배지(10g/L 트립톤, 10g/L 염화나트륨(NaCl) 및 5g/L 효모 추출물, pH 7.2) 4mL에서 배양하고 37°C에서 교반(178rpm)하여 밤새(12-16시간) 성장하도록 둡니다.
3. 준비된 박테리아를 신선한 Km⁺ LB 배지에 1:100으로 희석하고 OD₃₇ 이 2-3에 도달할 때까지 0.4-0.6시간 동안 진탕하면서 0.4°C에서 배양합니다.
4. 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도 0.4mM로 배지에 첨가하고, 배양물을 16°C에서 추가로 10시간 동안 배양한다.
5. 결론적으로, 원심분리는 IPTG 유도(10,000 × g, 4°C 15분)를 사용하여 박테리아를 수확한다.
6. 1mg/mL 리소자임이 포함된 50mL의 LEW(Lysis/Equilibration/Wash) 완충액(50mM 무수 인산나트륨 일염기성(NaH_2PO4) 및 300mM NaCl, pH 8.0)을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 박테리아 현탁액을 얼음 위에서 30 분 동안 저어주고 초음파 균질기를 사용하여 완전히 초음파 처리합니다 (15 초 펄스 및 20 초 오프, 15 분).
7. 미정제 세포 용해물을 4°C에서 30분 동안 10,000×g으로 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 상청액을 사전 평형화된 컬럼으로 옮기고 중력 배수 전에 1-2분 동안 배양합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
8. 20mL의 LEW 버퍼를 사용하여 컬럼을 세척하고 중력을 사용하여 배출합니다. 9mL의 용출 완충액(50mM_NaH2PO4, 300mM NaCl 및 250mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 히스티딘 태그가 부착된 APN 단백질을 용출하고 투석 튜브에 수집합니다.
9. 단백질 용액을 탄산나트륨-탄산수소나트륨(PBS, 135 mM NaCl, 4.7 mM 염화칼륨, 2 mM_NaH2PO4, 및 10 mM 도데카하이드레이트 소듐 포스페이트 이염기성, pH 7.2) 완충액에서 밤새 투석한다.
10. 12.0% SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블랏팅을 이용하여 분석하여 APN 단백질의 순도를 평가하였다.
    1. 5μg의 단백질을 젤의 각 웰에 로드하고 1.5시간 동안 110V에서 실행합니다. 그런 다음 단백질을 15V에서 50분 동안 PVDF 멤브레인으로 옮기고 BCA 분석을 사용하여 정제된 단백질의 농도를 결정합니다.

2. 동물 예방 접종

1. 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스에 2주에 한 번씩 50μg의 APN 단백질 또는 보조제와 혼합된 PBS(음성 대조군)를 피하(s.c)로 주사합니다. 초기 예방접종에는 열에 의해 사멸된 마이코박테리아가 포함된 완전한 프로인트 보조제를 사용하고, 추가 면역에는 불완전한 프로인트 보조제를 사용하십시오. 동일한 부피의 APN 단백질(또는 PBS)과 프로인트 보조제 또는 불완전 프로인트 보조제를 각각 혼합합니다.
2. 0.05M PBS(pH 9.6)에 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 간접 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 이들 마우스의 혈청에서 APN에 대한 항체 역가를 검출합니다. .

3. APN에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술

1. 최종 항원 부스트를 위해 선택된 마우스에 100μg의 APN 단백질을 복강내(i.p.) 주입합니다.
2. 3일 후, 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg, v/v, 복강내)과 자궁경부 탈구를 사용하여 생쥐를 안락사시킨다.
3. 비장을 채취한 후 DMEM으로 2회 세척하여 혈액과 지방세포를 제거합니다. 200-메쉬 구리 그리드를 이용하여 비장세포 현탁액을 여과하여 조직 파편을 제거하고, 원심분리(1500 × g, 10분)를 이용하여 비장 세포를 채취하여 비장의 막을 제거한다.
4. 시드 마우스 SP2/0 세포를 6% 소태아혈청(FBS)이 보충된 5 mL의 DMEM을 함유하는 25 cm2 플라스크에서 세포 생존율을 유지하기 위해 37°C, 6%^CO2 분위기에서 배양하였다. 배양 5-6일 후, 세포는 소생술 후 80%-90% 합류에 도달하고 성장 로그 단계에 있습니다. 현미경으로 보면 세포는 둥글고 밝고 투명합니다.
5. 혼성화 하루 전, 이전에 발표된 방법^12,19에 따라 마우스의 복강으로부터 대식세포를 수집한다.
6. 100 μL의 HAT 배지 (10 % FBS 및 1x HAT 보충으로 보충 된 DMEM)를 함유하는 96 웰 플레이트에서 0.1-0.2 × 10⁵ / mL의 밀도로 복막 대 식세포를 시드하고, 37 °C, 6 %_CO2 가습 분위기에서 밤새 배양한다.
7. 하이브리드화를 위해 8-10병의 피펫으로 SP2/0 세포를 부드럽게 흡인하고 10mL의 무혈청 DMEM 배지에 현탁합니다. 신선한 DMEM으로 세포를 세척하고, 원심분리기(1500 × g, 10 분)를 2회 세척한 다음, 10 mL의 DMEM에 재현탁시킨다.
8. 정량화된 비장 세포를 SP2/0 세포와 10:1의 비율로 혼합하고 50mL 튜브로 옮깁니다. 원심분리기(1500 × g, 10분)하고 상층액을 버린다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 수집하고 손바닥으로 두드려 하이브리드화 전에 펠릿을 풉니다.
9. 37°C로 예열된 폴리에틸렌 글리콜 1500 (PEG 1500) 1 mL를 추가하고, 튜브의 바닥을 부드럽게 회전시키면서 45초의 시간 동안 느슨해진 세포 펠릿에 스포이드를 사용하여 적가한다.
10. 37°C로 예열된 DMEM 1mL를 90초에 걸쳐 상기 혼합물에 천천히 첨가한 다음, 새로운 DMEM 30mL를 추가로 첨가한다. 융합 튜브를 37°C 수조에 30분 동안 넣습니다.
11. 온욕에서 인큐베이션한 후, 세포를 수확하고 HAT 배지에 재현탁시킨다. 그런 다음 복막 대식세포가 접종된 96웰 플레이트에서 배양합니다.
12. 5일 후, 100 μL의 신선한 HAT 배지를 각 웰에 추가하고, 플레이트를 추가로 5일 동안 인큐베이션한 후, 배지를 HT 배지(10% FBS 및 1x HT 보충으로 보충된 DMEM)로 교체합니다.
13. 0.05M PBS(pH 9.6)에 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 사용하여 하이브리도마 상층액의 단클론 항체를 분석합니다.
    1. 96 웰 플레이트의 웰에있는 배지가 노랗게 변하거나 (세포 성장 및 대사 산물 방출로 인해 배지의 pH가 6.8로 감소하고 페놀 레드가 자홍색에서 노란색으로 변함) 세포 클러스터가 관찰되면 선택된 웰에서 100 μL 상청액을 획득하고 코팅 된 ELISA 플레이트의 웰에 첨가한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD450 값을 측정합니다.
    2. APN 및 비감염 마우스 혈청에 대한 다클론 항체를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하고 PBS를 블랭크 대조군으로 사용합니다. 이 연구에서는 2.1≥ 음성 대조군에 대한 샘플의 OD450 비율이 양성 선택 표준으로 인식되었습니다.
14. 3회 연속 양성 선택 라운드 후, 제한된 희석 분석을 위해 APN 단백질에 대해 증가된 혈청학적 반응을 보이는 하이브리도마를 선택합니다.
    1. 복막 대식세포를 준비하고 앞에서 설명한 대로 96웰 플레이트에 시드합니다.
    2. 하이브리도마 세포를 HT 배지에 웰 당 평균 0.5-2 세포로 현탁하고, 37°C, 6%_CO2 배양기에서 배양하였다. ELISA 면역 측정법에 의해 표시된 양성률이 100 %에 도달 할 때까지이 단계를 3-4 회 반복하십시오.
15. 지속적인 동결 및 해동의 압력 하에서, 항 APN 항체를 안정적으로 분비하고 정상적으로 증식 할 수있는 양성 하이브리도마 세포를 선택하십시오.
    1. 각 마우스에 0.3mL의 프리스탄을 단일 i.p. 주사합니다(8-10주). 프리스틴을 투여받은 후 10일째에, 각 마우스에 2-5 x 10 5 하이브리도마 세포를^0.5 mL의 PBS(pH 7.2)에 주입한다.
    2. 주사 후 8-10 일 동안이 생쥐의 복막 구멍에서 복막을 조심스럽게 수집하십시오.
    3. 5,000 × g에서 15 분 동안 원심 분리하여 상청액을 수확하고, 33 % 포화 황산 암모늄 [(NH 4) _2SO4] 침전 및 단백질 A 아가로스를 사용하여 상청액에서 항체를 정제한다.

4. APN 단백질에 대한 mAb의 특성 분석

1. SBA 클로노타이핑 시스템(Clonotyping System-HRP)을 사용하여 수집된 mAb의 면역글로불린 아형을 결정합니다²⁰. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 mAb 순도 및 특이성을 평가합니다.
2. ELISA²¹을 사용하여 APN 단백질에 대한 mAb 에피토프 특이성을 분석합니다. 첨가제 값(AV)은 OD mAb(a+b)와 (OD_mAb-a+OD_mAbs-b)의 비율로,_mAb가 동일한 항원 부위를 인식하는지 여부를 평가하는 데 사용됩니다. OD_mAb-a 및 OD_mAbs-b는 APN 단독에 대한 서로 다른 단일클론 항체의 OD450 값을 나타내고, OD_mAbs(a+b)는 APN에 대한 두 mAb의 1:1 혼합물의 OD450 값을 나타냅니다.
   1. 각 표본을 4회 이상 반복실험 검정하고 전체 실험을 3회 이상 반복합니다.

5. APN에 대한 rAb의 표현

1. 상기 언급된 하이브리도마 세포 및 APN-면역화된 마우스의 비장(예: 트리졸)²²에서 총 RNA를 추출합니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성합니다.
2. 중첩 PCR을 사용하여 mAb의 가변 영역을 증폭하고 염기서열 분석을 사용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 염기서열을 측정합니다. IMGT 마우스 게놈 분석 도구(http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php)를 사용하여 VH 및 VL을 코딩하는 유전자를 분석합니다.
3. VH 및 VL 유전자를 리더 서열과 결합하고 이들을 각각 pET28a(+) 및 pIRES2-ZsGreen1 벡터에 순차적으로 서브클로닝하여 이음매 없는 DNA 단편 삽입을 가능하게 하는 이음매 없는 클로닝 기술을 사용합니다. 구체적인 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.
4. pET28a(+)-rAbs-APN-BL21-형질전환된 박테리아를 37°C에서 10시간 동안 궤도 쉐이커에서 0.4mM IPTG의 존재 하에 성장시킵니다. 그런 다음 일상적인 단백질 정제를 사용하여 rAbs 단백질의 발현을 유도, 정제 및 평가합니다.
5. 웰 당^0.5 x 10 5 CHO 세포를 96-웰 플레이트에 넣고 37°C에서 18-24시간 동안 6%_CO2 분위기에서 배양한다. 세포가 80-90% 합류에 도달하면 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN 플라스미드를 Opti-MEM으로 최종 농도 0.1μg/μL로 희석하고 실온에서 5분 배양한 후 트랜스펙션에 사용합니다.
6. 희석된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN 플라스미드 50μL와 리포펙타민 2000 1μL 및 Opti-MEM 49μL를 부드럽게 혼합하고 실온에서 추가로 20분 동안 혼합물을 배양합니다. 혼합물 100 μL를 CHO 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37°C에서 4-6시간 동안 6%_CO2 분위기에서 인큐베이션한다.
7. 형질감염 후 4-6시간 후, 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM-F12 배지로 교체하고 플레이트를 48시간 더 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 400μg/mL G418을 추가하여 안정적으로 형질감염된 세포를 선택합니다.
8. 10% FBS 및 400μg/mL G418이 보충된 DMEM-F12 배지를 사용하여 10일 동안 선택한 후 형광 활성화 세포 분류로 세포(3.0 ×^{10 7} cells/mL)를 분류합니다. 세포 집단의 약 10-15%가 양성이었다.
9. 수확된 양성 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 평균 0.5-2 세포로 시딩하고, 37°C, 6%_CO2 인큐베이터에서 배양하여 연속적으로 희석하였다. G418(200μg/mL)과 함께 선별을 사용하여 안정적으로 형질주입된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO 세포를 유지합니다.
10. 상술한 세포-배양 배지 중의 FBS 농도는 3주의 기간에 걸쳐 대수 성장 단계 동안 10%에서 0%로 점진적으로 감소한다. 이어서, 부착성 CHO 세포를 무혈청 배지에서 현탁액 성장에 적응시킨다.
11. 80-110 rpm의 진탕 플라스크에서 0.8-1.0 × 10⁵ cells/mL의 밀도로 무혈청 배지에서 대수 성장 단계의 시딩된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO 세포를 80-110 rpm의 진탕 속도 및 37°C, 6%_CO2로 배양합니다.
12. 제조업체의 지침에 따라 세포 계수 키트(예: CCK-8)를 사용하여 세포 생존율 및 활력의 변화를 확인하기 위해 12시간마다 세포 현탁액을 수집합니다.
13. 항체 발현은 세포 생존율이 80%로 감소하고 세포 밀도가 1.0-2.0 × 10⁶ cells/mL에 도달하면 최고 수준에 도달합니다. 원심분리를 이용하여 세포 상층액을 수확하고, 0.22 μm 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인 필터를 이용하여 여과하고, 단백질 A 아가로스를 사용하여 정제한다.
14. 간접 면역형광 분석법(IFA)을 사용하여 APN 특이적 항체의 생산을 확인합니다.
15. 앞서 설명한 대로 ELISA 분석을 사용하여 항체 역가 및 결합 친화도를 결정합니다. ⁽²³ ) 소프트웨어를 사용하여 항체의 평형 해리 상수_{(KD 값} )를 4파라미터 로지스틱 방정식으로 계산한다.

결과

이 연구에서는 정제된 가용성 APN 단백질(2.12mg/mL)을 마우스 면역에 사용했습니다. APN 단백질로 14일 간격으로 4회 면역화된 마우스는 혈청에서 APN에 대해 더 높은 항체 역가를 나타냈다. 융합 실험을 사용하여 14개의 하이브리도마를 얻었지만, 3개의 연속 동결-해동 주기에서 9개의 하이브리도마만이 살아남았고, 그 결과 APN에 대한 항체를 분비하는 9개의 안정적인 클론이 생성되었습니다. 이 모든 ?...

토론

점막 면역의 유도는 병원체에 대항하고 다양한 질병의 예방 및 치료에 가장 효과적인 접근법 중 하나입니다. 장 점막에서 고도로 발현되는 막 결합 단백질인 APN은 적응 면역 반응의 유도와 수용체 매개 바이러스 및 박테리아 엔도사이토시스에 관여한다 ^1,5,8. APN은 다양한 형태의 항원 로딩 및 백신 전달에서 항원 미립자로 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture