Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Riepilogo

La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).

Abstract

L'aminopeptidasi suina N (APN), una metallopeptidasi legata alla membrana abbondantemente presente nella mucosa dell'intestino tenue, può avviare una risposta immunitaria della mucosa senza alcuna interferenza come bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali. Ciò rende APN un candidato interessante nello sviluppo di vaccini che colpiscono selettivamente l'epitelio della mucosa. Studi precedenti hanno dimostrato che l'APN è una proteina recettore sia per l'Escherichia coli enterotossigenico (E. coli) F4 che per il virus della gastroenterite trasmissibile. Pertanto, APN mostra risultati promettenti nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco o nuovi vaccini basati su anticorpi APN-specifici. In questo studio, abbiamo confrontato la produzione di anticorpi monoclonali APN-specifici (mAbs) utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma e il metodo di espressione degli anticorpi ricombinanti. Abbiamo anche stabilito una linea cellulare di ovaio di criceto cinese (CHO) stabilmente trasfettata utilizzando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e un ceppo di espressione BL21 (DE3) di E. coli che ospita il vettore pET28a (+)-rAbs-APN. I risultati mostrano che gli anticorpi espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs prodotti utilizzando ibridomi potrebbero riconoscere e legarsi alla proteina APN. Ciò fornisce la base per ulteriori chiarimenti sulla funzione del recettore APN per lo sviluppo di terapie mirate a diversi epitopi specifici dell'APN.

Introduzione

L'aminopeptidasi N (APN), un enzima che appartiene alla famiglia delle metalloproteinasi M1, agisce come marcatore tumorale, recettore e molecola di segnalazione attraverso vie enzima-dipendenti ed enzima-indipendenti ^1,2. Oltre a scindere i residui aminoacidici N-terminali di vari peptidi bioattivi per la regolazione della loro attività biologica, l'APN svolge un ruolo importante nella patogenesi di varie malattie infiammatorie. APN partecipa all'elaborazione e alla presentazione dell'antigene da parte di peptidi tagliati che si legano strettamente alle principali molecole di classe II del complesso di istocompatibilità ^2,3. APN esercita anche effetti antinfiammatori legandosi con i recettori accoppiati a proteine G che partecipano alla trasduzione del segnale multiplo, modulando la secrezione di citochine e contribuendo alla fagocitosi mediata dal recettore Fc gamma nella risposta immunitaria 4,5,6,7.

Come esopeptidasi legata alla membrana ampiamente distribuita, l'APN è abbondante nella mucosa dell'intestino tenue suino ed è strettamente associata all'endocitosi mediata dal recettore ^1,5,8. APN riconosce e lega la proteina spike del virus della gastroenterite trasmissibile per l'ingresso cellulare e interagisce direttamente con la subunità FaeG delle fimbrie enterotossigeniche di Escherichia coli F4 per influenzare l'aderenza batterica con le cellule ospiti 9,10,11. Pertanto, APN è un potenziale bersaglio terapeutico nel trattamento delle malattie infettive virali e batteriche.

Dopo lo sviluppo della tecnologia dell'ibridoma e di altre strategie per la produzione di anticorpi monoclonali (mAbs) nel 1975, i mAb sono stati ampiamente utilizzati nell'immunoterapia, nella somministrazione di farmaci e nella diagnosi^12,13,14. Attualmente, i mAbs sono usati con successo per trattare malattie come il cancro, le malattie infiammatorie intestinali e la sclerosi multipla^12,15. A causa della loro forte affinità e specificità, i mAb possono essere bersagli ideali nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco (ADC) o di nuovi vaccini^16,17. La proteina APN è fondamentale per la somministrazione selettiva di antigeni a cellule specifiche e può suscitare una risposta immunitaria mucosa specifica e forte contro i patogeni senza alcuna interferenza, tra cui bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali ^5,8,18. Pertanto, gli agenti terapeutici a base di mAbs specifici per APN mostrano risultati promettenti contro le infezioni batteriche e virali. In questo studio, descriviamo la produzione di mAbs APN-specifici utilizzando la tecnologia dell'ibridoma e l'espressione di anticorpi ricombinanti anti-APN (rAbs) utilizzando vettori procariotici ed eucariotici. Il risultato indica che la proteina APN è stata riconosciuta sia dagli rAbs espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO che dai mAb derivati dall'ibridoma.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou (SYXK20200041).

1. Preparazione dell'antigene della proteina APN suina

NOTA: Il ceppo pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e le cellule APN stabilmente espresse pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 sono stati costruiti in uno studio precedente¹¹.

1. Recuperare i batteri da uno stock di glicerolo congelato e strisciare su piastre di Luria-Bertani (LB) contenenti 50 μg/mL di kanamicina (Km⁺) per l'isolamento di una singola colonia.
2. Selezionare una singola colonia dalla piastra appena striata, coltura in 4 mL di terreno LB (10 g/L triptone, 10 g/L cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito, pH 7,2) integrata con Km⁺ (50 μg/mL), e lasciare crescere per una notte (12-16 h) agitando (178 rpm) a 37 °C.
3. Diluire i batteri preparati a 1:100 in brodo fresco Km⁺ LB e incubare a 37 °C agitando per 2-3 ore fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,4-0,6.
4. Aggiungere isopropile β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) al terreno fino a una concentrazione finale di 0,4 mM e incubare le colture per altre 10 ore a 16 °C.
5. Di conseguenza, centrifugare e raccogliere i batteri utilizzando l'induzione IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
6. Risospendere il pellet cellulare utilizzando 5 mL di tampone LEW (Lisi/Bilanciazione/Lavaggio) (50 mM di fosfato di sodio anidro monobasico (NaH₂PO₄) e 300 mM NaCl, pH 8,0) contenente 1 mg/mL di lisozima. Mescolare la sospensione batterica per 30 minuti sul ghiaccio e sonicare completamente (15 s di impulso e 20 s di spegnimento, 15 min) utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni.
7. Centrifugare il lisato di cellule grezze a 4 °C e 10.000 × g per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in una colonna pre-equilibrata e incubare 1-2 minuti prima del drenaggio per gravità. Ripetere questo passaggio tre volte.
8. Lavare la colonna con 20 ml di tampone LEW e scaricare per gravità. Eluire la proteina APN marcata con istidina utilizzando 9 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl e 250 mM imidazolo, pH 8,0) e raccogliere nel tubo di dialisi.
9. Dializzare la soluzione proteica per una notte a 4 °C in tampone bicarbonato di sodio-bicarbonato di sodio (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM cloruro di potassio, 2 mM NaH 2 PO₄ e 10 mM di fosfato di sodio dodecaidrato bibasico, pH_7,2).
10. Analizzare utilizzando un gel SDS-PAGE al 12,0% e western blotting per valutare la purezza della proteina APN.
    1. Caricare 5 μg di proteine in ciascun pozzetto del gel e lasciare funzionare a 110 V per 1,5 ore. Quindi, trasferire la proteina su una membrana PVDF per 50 minuti a 15 V. Determinare la concentrazione della proteina purificata utilizzando un test BCA.

2. Immunizzazione animale

1. Sottocutaneo (s.c) iniettare topi femmina BALB/c, 6-8 settimane di età, con 50 μg di proteina APN o PBS (controllo negativo) miscelati con adiuvanti una volta ogni 2 settimane. Utilizzare l'adiuvante completo di Freund che contiene i micobatteri uccisi dal calore per l'immunizzazione iniziale e l'adiuvante incompleto di Freund per le vaccinazioni di richiamo. Mescolare volumi uguali di proteina APN (o PBS) e adiuvante di Freund o adiuvante di Freund incompleto, rispettivamente.
2. Rilevare i titoli anticorpali contro APN nei sieri di questi topi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico indiretto (ELISA) utilizzando una piastra di microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6). .

3. Tecnologia dell'ibridoma per produrre anticorpi monoclonali contro APN

1. Per via intraperitoneale (i.p.) iniettare 100 μg di proteina APN nei topi selezionati per un boost finale dell'antigene.
2. Tre giorni dopo, eutanasia i topi usando pentobarbital sodico (50 mg / kg, v / v, intraperitoneale) e lussazione cervicale.
3. Raccogliere la milza e lavare con DMEM due volte per rimuovere il sangue e le cellule adipose. Filtrare la sospensione di cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione (1500 × g, 10 min) per rimuovere la membrana della milza.
4. Cellule SP2/0 del mieloma di topo da seme in un matraccio di 25 cm² contenente 5 ml di DMEM integrato con siero bovino fetale al 6% (FBS) e coltura a 37 °C, atmosfera al 6% di CO₂ per mantenere la vitalità cellulare. Dopo 5-6 giorni di coltura, le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza post-rianimazione e sono in fase di log di crescita. Al microscopio, le cellule sono rotonde, luminose e chiare.
5. Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi secondo un metodo precedentemente pubblicato^12,19.
6. Seminare macrofagi peritoneali ad una densità di 0,1-0,2 × 10⁵/mL in piastre da 96 pozzetti, ciascuno contenente 100 μL di mezzo HAT (DMEM integrato con 10% FBS e 1x HAT Supplement), e incubare a 37 °C, 6 % CO₂ atmosfera umidificata durante la notte.
7. Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP2/0 con una pipetta da 8-10 flaconi e sospenderle in 10 ml di mezzo DMEM privo di siero. Lavare le celle con DMEM fresco, centrifugare (1500 × g, 10 min) due volte, quindi risospendere in 10 mL di DMEM.
8. Mescolare le cellule quantificate della milza con cellule SP2/0 in un rapporto di 10:1 e trasferirle in provette da 50 ml. Centrifugare (1500 × g, 10 min) e scartare il surnatante. Raccogliere i pellet cellulari sul fondo dei tubi e picchiettare con il palmo per allentare i pellet prima dell'ibridazione.
9. Aggiungere 1 mL di polietilenglicole 1500 (PEG 1500), preriscaldato a 37 °C, goccia a goccia utilizzando un contagocce al pellet cellulare allentato per un periodo di tempo di 45 s mentre si ruota delicatamente il fondo del tubo.
10. Aggiungere lentamente 1 mL di DMEM preriscaldato a 37 °C alla miscela di cui sopra per un periodo di 90 s, seguito da altri 30 mL di DMEM fresco. Mettere il tubo di fusione a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
11. Dopo l'incubazione nel bagno caldo, raccogliere le cellule e risospenderle nel mezzo HAT. Quindi coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali.
12. Cinque giorni dopo, aggiungere 100 μL di terreno HAT fresco a ciascun pozzetto e incubare la piastra per altri 5 giorni, dopodiché sostituire il mezzo con il mezzo HT (DMEM integrato con 10% FBS e 1x HT Supplement).
13. Utilizzare una piastra di microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6) per analizzare gli anticorpi monoclonali nell'ibridoma surnatante utilizzando il test ELISA.
    1. Quando il mezzo nei pozzetti della piastra a 96 pozzetti diventa giallo (a causa della crescita cellulare e del rilascio di metaboliti, il pH nel mezzo diminuisce a 6,8 e il rosso fenolo passa dal fucsia al giallo) o si osservano cluster di cellule, acquisire 100 μL di surnatante dai pozzetti selezionati e aggiungere ai pozzetti della piastra ELISA rivestita. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare i valori OD450.
    2. Utilizzare gli anticorpi policlonali contro APN e siero di topo non infetto come controllo positivo e negativo, rispettivamente, e utilizzare PBS come controllo in bianco. In questo studio, il rapporto OD450 tra campione e controllo negativo (P/N) ≥ 2,1 è stato riconosciuto come standard di selezione positivo.
14. Dopo tre cicli consecutivi di selezione positiva, selezionare l'ibridoma che mostra una maggiore risposta sierologica contro la proteina APN per un test di diluizione limitato.
    1. Preparare i macrofagi peritoneali e il seme in piastre a 96 pozzetti come descritto in precedenza.
    2. Sospendere le cellule di ibridoma in mezzo HT ad una media di 0,5-2 cellule per pozzetto e coltura in un incubatore a 37 °C, 6% di CO₂ . Ripetere questo passaggio tre o quattro volte fino a quando il tasso di positività indicato dal test immunologico ELISA raggiunge il 100%.
15. Sotto la pressione del continuo congelamento e scongelamento, selezionare le cellule di ibridoma positivo in grado di secernere stabilmente anticorpi anti-APN e proliferare normalmente.
    1. Somministrare una singola iniezione i.p. di 0,3 mL di pristane a ciascun topo (8-10 settimane). A 10 giorni dalla somministrazione di materiale incontaminato, iniettare a ciascun topo 2-5 x 10 5 cellule di ibridoma in^0,5 mL di PBS (pH 7,2).
    2. Raccogliere con cura il liquido peritoneale dalla cavità peritoneale di questi topi da 8 a 10 giorni dopo l'iniezione.
    3. Raccogliere i supernatanti mediante centrifugazione a 5.000 × g per 15 minuti e purificare gli anticorpi nei surnatanti utilizzando il 33% di precipitazione satura di solfato di ammonio [(NH 4) ₂SO₄] e agarosio di proteina A.

4. Caratterizzazione di mAbs contro la proteina APN

1. Determinare il sottotipo di immunoglobuline dei mAbs raccolti utilizzando un SBA Clonotyping System-HRP²⁰. Utilizzare SDS-PAGE e western blotting per valutare la purezza e la specificità di mAb.
2. Analizzare la specificità dell'epitopo mAb rispetto alla proteina APN utilizzando ELISA²¹. Il valore di additività (AV) è il rapporto tra OD mAbs (a+b) e (OD mAbs-a+OD_mAbs-b), che viene utilizzato per valutare se i_mAb riconoscono lo stesso sito antigenico; OD_mAbs-a e OD mAbs-b rappresentano i valori OD450 di diversi anticorpi monoclonali contro APN da solo, e OD mAbs_(a+b) rappresentano i valori OD450 di una miscela 1:1 di due_mAbs contro APN.
   1. Valutare ogni campione almeno quattro repliche e ripetere l'intero esperimento almeno tre volte.

5. Espressione di rAbs contro APN

1. Estrarre l'RNA totale dalle cellule di ibridoma sopra menzionate e dalla milza di topi immunizzati APN (ad esempio, TRIzol)²². Sintetizzare il DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
2. Amplifica le regioni variabili di mAbs utilizzando la PCR nidificata e determina le sequenze a catena pesante (VH) e a catena leggera (VL) utilizzando il sequenziamento. Analizza i geni che codificano VH e VL utilizzando lo strumento di analisi del genoma del topo IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Combinare i geni VH e VL con le sequenze leader e subclonarli sequenzialmente rispettivamente nei vettori pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, utilizzando la tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità per consentire l'inserimento di frammenti di DNA senza cicatrici. I primer specifici sono elencati nella Tabella 1.
4. Far crescere i batteri trasformati in pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 in presenza di 0,4 mM IPTG in agitatori orbitali a 37 °C per 10 ore. Quindi inducere, purificare e valutare l'espressione della proteina rAbs utilizzando la purificazione proteica di routine.
5. Seminare 100 μL 0,5 x 10⁵ cellule CHO per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 6% per 18-24 ore. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, diluire il plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM a una concentrazione finale di 0,1 μg/μL e incubare 5 minuti a temperatura ambiente prima di utilizzarlo per la trasfezione.
6. Mescolare delicatamente 50 μL di plasmide diluito pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con 1 μL di Lipofectamine 2000 e 49 μL di Opti-MEM e incubare la miscela per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μL di miscela a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente celle CHO e incubare a 37 °C in atmosfera di CO₂ al 6% per 4-6 ore.
7. A 4-6 ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM-F12 integrato con il 10% di FBS e incubare la piastra per altre 48 ore. Quindi, aggiungere 400 μg / mL G418 a ciascun pozzetto per selezionare le celle stabilmente trasfettate.
8. Dopo 10 giorni di selezione utilizzando terreno DMEM-F12 integrato con FBS al 10% e 400 μg/mL G418, ordinare le cellule (3,0 × 10⁷ cellule/ml) mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Circa il 10-15% della popolazione cellulare era positiva.
9. Cellule positive raccolte in serie, semina in media di 0,5-2 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e coltura in un incubatore a 37 °C, 6% di CO₂ . Mantenere le cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO stabilmente trasfettate utilizzando la selezione con G418 (200 μg/mL).
10. La concentrazione di FBS nel terreno di coltura cellulare sopra descritto diminuisce gradualmente dal 10% allo 0% durante la fase di crescita logaritmica nel periodo di tempo di 3 settimane. Quindi, adattare le cellule CHO aderenti alla crescita della sospensione in un mezzo privo di siero.
11. Coltura delle cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO seminate nella fase di crescita logaritmica in mezzo privo di siero ad una densità di 0,8-1,0 × 10⁵ cellule/ml in matraccio di agitazione a 80-110 giri/min velocità di agitazione e 37°C, 6% CO₂.
12. Raccogliere la sospensione cellulare ogni 12 ore per determinare i cambiamenti nella vitalità e nella vitalità delle cellule utilizzando un kit di conteggio delle cellule (ad esempio, CCK-8) secondo le istruzioni del produttore.
13. L'espressione anticorpale raggiunge i livelli di picco quando la vitalità cellulare diminuisce all'80% e la densità cellulare raggiunge 1,0-2,0 × 10⁶ cellule/ml. Raccogliere i surnatanti cellulari mediante centrifugazione, filtrare utilizzando un filtro a membrana in politetrafluoroetilene da 0,22 μm e purificare utilizzando la proteina A agarosio.
14. Confermare la produzione di anticorpi APN-specifici utilizzando saggi di immunofluorescenza indiretta (IFA).
15. Determinare i titoli anticorpali e le affinità di legame utilizzando il test ELISA come descritto in precedenza. ²³ Calcolare la costante di dissociazione all'equilibrio (valore K_D ) degli anticorpi con un'equazione logistica a quattro parametri utilizzando un software.

Risultati

In questo studio, la proteina APN solubile purificata (2,12 mg / ml) è stata utilizzata per l'immunizzazione del topo. I topi immunizzati con la proteina APN quattro volte a intervalli di 14 giorni hanno mostrato un titolo anticorpale più elevato contro APN nei loro sieri. Sebbene siano stati ottenuti 14 ibridomi utilizzando gli esperimenti di fusione, solo 9 ibridomi sono sopravvissuti ai tre cicli continui di congelamento-disgelo, risultando in 9 cloni stabili che hanno secreto anticorpi contro APN. Tutte queste cell...

Discussione

L'induzione dell'immunità mucosale è uno degli approcci più efficaci nel contrastare gli agenti patogeni e nella prevenzione e nel trattamento di varie malattie. L'APN, una proteina legata alla membrana altamente espressa nella mucosa intestinale, è coinvolta nell'induzione della risposta immunitaria adattativa e nell'endocitosi virale e batterica mediata dai recettori ^1,5,8. APN è usato come antigene particolato in molti f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture