Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Resumen

La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).

Resumen

La aminopeptidasa porcina N (APN), una metalopeptidasa unida a la membrana abundantemente presente en la mucosa del intestino delgado, puede iniciar una respuesta inmune de la mucosa sin ninguna interferencia, como baja expresión de proteínas, inactividad enzimática o cambios estructurales. Esto hace que APN sea un candidato atractivo en el desarrollo de vacunas que se dirigen selectivamente al epitelio de la mucosa. Estudios previos han demostrado que la APN es una proteína receptora tanto para la Escherichia coli enterotoxigénica (E. coli) F4 como para el virus de la gastroenteritis transmisible. Por lo tanto, APN se muestra prometedora en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco o nuevas vacunas basadas en anticuerpos específicos de APN. En este estudio, comparamos la producción de anticuerpos monoclonales específicos de APN (mAbs) utilizando la tecnología tradicional de hibridoma y el método de expresión de anticuerpos recombinantes. También establecimos una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transfectada de manera estable utilizando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN y una cepa BL21 (DE3) de expresión de E. coli que alberga el vector pET28a (+)-rAbs-APN. Los resultados muestran que los anticuerpos expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y mAbs producidos mediante hibridomas podrían reconocer y unirse a la proteína APN. Esto proporciona la base para una mayor elucidación de la función del receptor de APN para el desarrollo de terapias dirigidas a diferentes epítopos específicos de APN.

Introducción

La aminopeptidasa N (APN), una enzima moonlighting que pertenece a la familia de la metaloproteinasa M1, actúa como marcador tumoral, receptor y molécula de señalización a través de vías dependientes de enzimas e independientes de enzimas ^1,2. Además de escindir los residuos de aminoácidos N-terminales de varios péptidos bioactivos para la regulación de su actividad biológica, APN juega un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias. La NPA participa en el procesamiento y presentación de antígenos por péptidos recortados que se unen estrechamente a las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad de clase II ^2,3. La NPA también ejerce efectos antiinflamatorios al unirse con receptores acoplados a proteínas G que participan en la transducción de señales múltiples, modulando la secreción de citoquinas y contribuyendo a la fagocitosis mediada por el receptor gamma Fc en la respuesta inmune 4,5,6,7.

Como exopeptidasa unida a la membrana ampliamente distribuida, la NPA es abundante en la mucosa del intestino delgado porcino y está estrechamente asociada con la endocitosis mediada por receptores ^1,5,8. La NPA reconoce y se une a la proteína espiga del virus de la gastroenteritis transmisible para la entrada celular, e interactúa directamente con la subunidad FaeG de las fimbrias enterotoxigénicas Escherichia coli F4 para afectar la adherencia bacteriana con las células huésped 9,10,11. Por lo tanto, la NPA es una potencial diana terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales y bacterianas.

Desde el desarrollo de la tecnología de hibridoma y otras estrategias para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) en 1975, los mAbs se han utilizado ampliamente en inmunoterapia, administración de fármacos y diagnóstico^12,13,14. Actualmente, los mAbs se utilizan con éxito para tratar enfermedades como el cáncer, la enfermedad inflamatoria intestinal y la esclerosis múltiple^12,15. Debido a su fuerte afinidad y especificidad, los mAbs pueden ser objetivos ideales en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) o nuevas vacunas^16,17. La proteína APN es crítica para la entrega selectiva de antígenos a células específicas, y puede provocar una respuesta inmune de la mucosa específica y fuerte contra patógenos sin ninguna interferencia, incluida la baja expresión de proteínas, la inactividad enzimática o los cambios estructurales ^5,8,18. Por lo tanto, los productos terapéuticos basados en mAbs específicos de APN son prometedores contra las infecciones bacterianas y virales. En este estudio, describimos la producción de mAbs específicos de APN utilizando tecnología de hibridoma y la expresión de anticuerpos recombinantes anti-APN (rAbs) utilizando vectores procariotas y eucariotas. El resultado indica que la proteína APN fue reconocida tanto por rAbs expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO como por mAbs derivadas de hibridomas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yangzhou (SYXK20200041).

1. Preparación del antígeno de la proteína APN porcina

NOTA: La cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) y las células APN expresadas establemente pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 fueron construidas en un estudio previo¹¹.

1. Recuperar bacterias de una cepa de glicerol congelada y rayar en placas de Luria-Bertani (LB) que contienen 50 μg / ml de kanamicina (Km⁺) para el aislamiento de colonias individuales.
2. Seleccionar una sola colonia de la placa recién rayada, cultivar en 4 mL de medio LB (10 g/L triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura, pH 7.2) suplementado con Km⁺ (50 μg/mL), y dejar crecer durante la noche (12-16 h) con agitación (178 rpm) a 37 °C.
3. Diluir las bacterias preparadas a 1:100 en caldo fresco Km⁺ LB e incubar a 37 °C agitando durante 2-3 h hasta que el OD₆₀₀ alcance 0,4-0,6.
4. Añadir isopropil β-d-1-tiogalactopiranosido (IPTG) al medio hasta una concentración final de 0,4 mM, e incubar los cultivos durante 10 h adicionales a 16 °C.
5. En consecuencia, centrifugar y cosechar las bacterias mediante inducción IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
6. Resuspender el pellet celular utilizando 5 mL de tampón LEW (Lisis/Equilibrio/Lavado) (50 mM fosfato sódico anhidro monobásico (NaH₂PO₄) y 300 mM NaCl, pH 8.0) que contiene 1 mg/ml lisozima. Revuelva la suspensión bacteriana durante 30 minutos sobre hielo y sonicar completamente (15 s pulso y 20 s apagado, 15 min) usando un homogeneizador ultrasónico.
7. Centrifugar el lisado de células crudas a 4 °C y 10.000 × g durante 30 min para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a una columna preequilibrada e incube 1-2 minutos antes del drenaje por gravedad. Repita este paso tres veces.
8. Lave la columna con 20 ml de tampón LEW y drene por gravedad. Eluya la proteína APN marcada con histidina, utilizando 9 ml de tampón de elución (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl y 250 mM de imidazol, pH 8.0) y recoja en un tubo de diálisis.
9. Dializar la solución proteica durante la noche a 4 °C en tampón carbonato de sodio-bicarbonato sódico (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM cloruro de potasio, 2 mM_NaH2PO₄ y 10 mM dodecahidrato fosfato sódico dibásico, pH 7,2).
10. Analizar utilizando un gel SDS-PAGE al 12,0% y Western blotting para evaluar la pureza de la proteína APN.
    1. Cargue 5 μg de proteína en cada pocillo del gel y deje correr a 110 V durante 1,5 h. Luego, transfiera la proteína a una membrana de PVDF durante 50 minutos a 15 V. Determine la concentración de la proteína purificada mediante un ensayo de BCA.

2. Inmunización animal

1. Subcutáneos (s.c) inyectan ratones hembra BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, con 50 μg de proteína APN o PBS (control negativo) mezclado con adyuvantes una vez cada 2 semanas. Use el adyuvante de Freund completo que contiene las micobacterias muertas por calor para la inmunización inicial, y el adyuvante de Freund incompleto para las vacunas de refuerzo. Mezcle volúmenes iguales de proteína APN (o PBS) y adyuvante de Freund o adyuvante de Freund incompleto, respectivamente.
2. Detectar títulos de anticuerpos contra APN en sueros de estos ratones mediante ensayo indirecto de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) utilizando una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/ml de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6). .

3. Tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra APN

1. Intraperitoneally (i.p.) inyectar 100 μg de proteína APN en los ratones seleccionados para un refuerzo final del antígeno.
2. Tres días después, eutanasia a los ratones usando pentobarbital sódico (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) y luxación cervical.
3. Recoja los bazos y lávese con DMEM dos veces para eliminar la sangre y las células grasas. Filtre la suspensión de células de bazo con una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido y recolecte las células del bazo mediante centrifugación (1500 × g, 10 min) para eliminar la membrana del bazo.
4. Células de mieloma de ratón SP2/0 en un matraz de 25 cm² que contiene 5 ml de DMEM suplementado con 6% de suero fetal bovino (FBS) y cultivo a 37 °C, 6% de_CO2 atmósfera para mantener la viabilidad celular. Después de 5-6 días de cultivo, las células alcanzan el 80%-90% de confluencia después de la reanimación y están en fase de registro de crecimiento. Bajo el microscopio, las células son redondas, brillantes y claras.
5. Un día antes de la hibridación, recolectar macrófagos de cavidades peritoneales de los ratones de acuerdo con un método previamente publicado^12,19.
6. Macrófagos peritoneales de semilla a una densidad de 0.1-0.2 × 10⁵/mL en placas de 96 pocillos, cada pocillo conteniendo 100 μL de medio HAT (DMEM suplementado con 10% FBS y 1x suplemento de HAT), e incubar a 37 °C, 6 % de_CO2 en atmósfera humidificada durante la noche.
7. Para la hibridación, aspire suavemente las células SP2/0 con una pipeta de 8-10 botellas y suspenda en 10 ml de medio DMEM sin suero. Lave las celdas con DMEM fresco, centrifugar (1500 × g, 10 min) dos veces y luego vuelva a suspender en 10 ml de DMEM.
8. Mezclar las células cuantificadas del bazo con células SP2/0 en una proporción de 10:1 y transferir a tubos de 50 ml. Centrifugar (1500 × g, 10 min) y desechar el sobrenadante. Recoja los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos y golpee con la palma de la mano para aflojar los gránulos antes de la hibridación.
9. Añadir 1 ml de polietilenglicol 1500 (PEG 1500), precalentado a 37 °C, gotero a gotero en el pellet de celda aflojado durante el período de 45 s mientras gira suavemente el fondo del tubo.
10. Agregue lentamente 1 ml de DMEM precalentado a 37 °C a la mezcla anterior durante el período de 90 s, seguido de otros 30 ml de DMEM fresco. Coloque el tubo de fusión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
11. Después de la incubación en el baño caliente, cosechar las células y volver a suspender en medio HAT. Luego cultivo en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales.
12. Cinco días después, agregue 100 μL de medio HAT fresco a cada pocillo e incube la placa durante 5 días adicionales, después de lo cual reemplace el medio con medio HT (DMEM suplementado con 10% FBS y 1x suplemento HT).
13. Utilice una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/ml de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6) para analizar anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de hibridoma mediante ensayo ELISA.
    1. Cuando el medio en los pocillos de la placa de 96 pocillos se vuelve amarillo (debido al crecimiento celular y la liberación de metabolitos, el pH en el medio disminuye a 6.8, y el rojo fenol cambia de fucsia a amarillo) o se observan grupos de células, adquiera 100 μL de sobrenadante de los pocillos seleccionados y agregue a los pocillos de la placa ELISA recubierta. Utilice un lector de microplacas para medir los valores OD450.
    2. Utilice los anticuerpos policlonales contra APN y suero de ratón no infectado como control positivo y negativo, respectivamente, y use PBS como control en blanco. En este estudio, la relación OD450 de muestra a control negativo (P/N) ≥ 2,1 fue reconocida como estándar de selección positiva.
14. Después de tres rondas consecutivas de selección positiva, seleccione el hibridoma que muestra una mayor respuesta serológica contra la proteína APN para un ensayo de dilución limitada.
    1. Prepare macrófagos peritoneales y semillas en placas de 96 pocillos como se describió anteriormente.
    2. Suspender células de hibridoma en medio HT a un promedio de 0,5-2 células por pocillo y cultivo en una incubadora de 37 °C, 6% de CO₂ . Repita este paso tres o cuatro veces hasta que la tasa de positivos indicada por el inmunoensayo ELISA alcance el 100%.
15. Bajo la presión de congelación y descongelación continuas, seleccione las células de hibridoma positivas capaces de secretar de manera estable anticuerpos anti-APN y proliferar normalmente.
    1. Administrar una única inyección i.p. de 0,3 ml de pristano a cada ratón (8-10 semanas). A los 10 días después de recibir prístino, inyecte a cada ratón 2-5 x 10 5 células de hibridoma en^0,5 ml de PBS (pH 7,2).
    2. Recoja cuidadosamente el líquido peritoneal de la cavidad peritoneal de estos ratones de 8 a 10 días después de la inyección.
    3. Cosechar los sobrenadantes por centrifugación a 5.000 × g durante 15 minutos, y purificar los anticuerpos en los sobrenadantes utilizando sulfato de amonio saturado al 33% [(NH 4)₂SO₄] precipitación y proteína A agarosa.

4. Caracterización de mAbs frente a proteína APN

1. Determinar el subtipo de inmunoglobulina de los mAbs recolectados utilizando un Sistema de Clonotipado SBA-HRP²⁰. Use SDS-PAGE y Western blot para evaluar la pureza y especificidad de mAb.
2. Analizar la especificidad del epítopo mAb contra la proteína APN utilizando ELISA²¹. El valor de aditividad (AV) es la relación entre OD mAbs (a+_{b) y (OD mAbs-a+}OD_mAbs-b), que se utiliza para evaluar si los mAbs reconocen el mismo sitio antigénico; OD mAbs-a y OD_mAbs-b representan los valores de OD450 de diferentes anticuerpos monoclonales contra APN solo, y_OD mAbs_{(a + b)} representan los valores de OD450 de una mezcla 1: 1 de dos mAbs contra APN.
   1. Evalúe cada muestra al menos cuatro réplicas y repita todo el experimento al menos tres veces.

5. Expresión de rAbs contra APN

1. Extraer ARN total de las células de hibridoma y bazo mencionadas anteriormente de ratones inmunizados con APN (por ejemplo, TRIzol)²². Sintetice ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante.
2. Amplíe regiones variables de mAbs mediante PCR anidada y determine secuencias de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) mediante secuenciación. Analice los genes que codifican VH y VL utilizando la herramienta de análisis del genoma del ratón IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Combine los genes VH y VL con secuencias líderes y subclónelos secuencialmente en los vectores pET28a (+) y pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, utilizando tecnología de clonación sin fisuras para permitir la inserción de fragmentos de ADN sin cicatrices. Los cebadores específicos se enumeran en la Tabla 1.
4. Cultivar la bacteria transformada pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 en presencia de 0,4 mM de IPTG en agitadores orbitales a 37 °C durante 10 h. Luego induzca, purifique y evalúe la expresión de la proteína rAbs utilizando la purificación rutinaria de proteínas.
5. Sembrar 100 μL 0,5 x 10⁵ células CHO por pocillo en una placa de 96 pocillos e incubar a 37 °C en una atmósfera de_CO2 al 6% durante 18-24 h. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, diluir el plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM a una concentración final de 0,1 μg/μL, e incubar 5 min a temperatura ambiente antes de usarlo para la transfección.
6. Mezclar suavemente 50 μL de plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluido con 1 μL de lipofectamina 2000 y 49 μL de Opti-MEM, e incubar la mezcla durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Añadir 100 μL de mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga células CHO e incubar a 37 °C en atmósfera de_CO2 al 6% durante 4-6 h.
7. A las 4-6 h después de la transfección, reemplace el medio con medio DMEM-F12 suplementado con 10% de FBS e incube la placa durante otras 48 h. Luego, agregue 400 μg / ml de G418 a cada pocillo para seleccionar las células transfectadas de manera estable.
8. Después de 10 días de selección utilizando medio DMEM-F12 suplementado con 10% FBS y 400 μg/mL G418, clasifique las células (3.0 × 10⁷ células/mL) por clasificación celular activada por fluorescencia. Aproximadamente el 10-15% de la población celular fue positiva.
9. Diluir en serie las células positivas cosechadas, sembrar a un promedio de 0.5-2 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y cultivar en una incubadora de 37 °C, 6% de_CO2 . Mantener las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estable mediante selección con G418 (200 μg/ml).
10. La concentración de FBS en el medio de cultivo celular descrito anteriormente disminuye gradualmente del 10% al 0% durante la fase de crecimiento logarítmico durante el período de tiempo de 3 semanas. Luego, adapte las células CHO adherentes al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero.
11. Cultivar las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO sembradas en la fase de crecimiento logarítmico en medio libre de suero a una densidad de 0,8-1,0 × 10⁵ células/ml en matraces de batido a una velocidad de agitación de 80-110 rpm y 37°C, 6% de_CO2.
12. Recoja la suspensión celular cada 12 h para determinar los cambios en la viabilidad y vitalidad celular utilizando un kit de conteo celular (por ejemplo, CCK-8) según las instrucciones del fabricante.
13. La expresión de anticuerpos alcanza niveles máximos cuando la viabilidad celular disminuye al 80% y la densidad celular alcanza 1.0-2.0 × 10⁶ células / ml. Recolectar sobrenadantes celulares mediante centrifugación, filtrar con un filtro de membrana de politetrafluoroetileno de 0,22 μm y purificar con agarosa de proteína A.
14. Confirmar la producción de anticuerpos específicos de APN mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA).
15. Determinar los títulos de anticuerpos y las afinidades de unión mediante el ensayo ELISA como se describió anteriormente. ²³ Calcular la constante de disociación de equilibrio (valor K_D ) de los anticuerpos con una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando software.

Resultados

En este estudio, la proteína APN soluble purificada (2,12 mg/ml) se utilizó para la inmunización con ratones. Los ratones inmunizados con la proteína APN cuatro veces a intervalos de 14 días exhibieron un título de anticuerpos más alto contra APN en sus sueros. Aunque se obtuvieron 14 hibridomas utilizando los experimentos de fusión, solo 9 hibridomas sobrevivieron a los tres ciclos continuos de congelación-descongelación, lo que resultó en 9 clones estables que secretaron anticuerpos contra APN. Todas estas c...

Discusión

La inducción de la inmunidad de la mucosa es uno de los enfoques más efectivos para contrarrestar los patógenos y en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. La NPA, una proteína unida a la membrana altamente expresada en la mucosa intestinal, está implicada en la inducción de la respuesta inmune adaptativa y en la endocitosis viral y bacteriana mediada por receptores ^1,5,8. La NPA se utiliza como partícu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture