Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Özet

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Özet

İnce bağırsak mukozasında bol miktarda bulunan membrana bağlı bir metallopeptidaz olan domuz aminopeptidaz N (APN), düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler gibi herhangi bir müdahale olmaksızın mukozal bir bağışıklık tepkisi başlatabilir. Bu, APN'yi mukozal epiteli seçici olarak hedef alan aşıların geliştirilmesinde çekici bir aday haline getirmektedir. Önceki çalışmalar, APN'nin hem enterotoksijenik Escherichia coli (E. coli) F4 hem de bulaşıcı gastroenterit virüsü için bir reseptör proteini olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, APN, antikor-ilaç konjugatlarının veya APN'ye özgü antikorlara dayanan yeni aşıların geliştirilmesinde umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, APN'ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimini geleneksel hibridoma teknolojisi ve rekombinant antikor ekspresyon yöntemi kullanılarak karşılaştırdık. Ayrıca, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN ve pET28a (+)-rAbs-APN vektörünü barındıran bir E. coli ekspresyonu BL21 (DE3) suşu kullanarak kararlı bir şekilde transfekte edilmiş bir Çin hamster yumurtalık (CHO) hücre hattı oluşturduk. Sonuçlar, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen antikorların ve hibridomlar kullanılarak üretilen mAbs'nin APN proteinini tanıyabileceğini ve bağlanabileceğini göstermektedir. Bu, farklı APN'ye özgü epitopları hedef alan terapötiklerin geliştirilmesi için APN reseptör fonksiyonunun daha fazla aydınlatılması için temel sağlar.

Giriş

Metalloproteinaz M1 ailesine ait bir ay ışığı enzimi olan Aminopeptidaz N (APN), enzime bağımlı ve enzimden bağımsız yollar^1,2 aracılığıyla bir tümör belirteci^, reseptör ve sinyal molekülü olarak işlev görür. APN, biyolojik aktivitelerinin düzenlenmesi için çeşitli biyoaktif peptitlerin N-terminal amino-asit kalıntılarını ayırmanın yanı sıra, çeşitli enflamatuar hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. APN, majör histokompatibilite kompleksi sınıf II molekülleri ^2,3'e sıkıca bağlanan kesilmiş peptitler tarafından antijen işleme ve sunumuna katılır. APN ayrıca çoklu sinyal iletimine katılan G proteinine bağlı reseptörlere bağlanarak, sitokin sekresyonunu modüle ederek ve immün yanıtta Fc gama reseptörü aracılı fagositoza katkıda bulunarak anti-enflamatuar etkiler gösterir ^4,5,6,7.

Yaygın olarak dağılmış membrana bağlı bir ekzopeptidaz olarak APN, domuz ince bağırsak mukozasında bol miktarda bulunur ve reseptör aracılı endositoz ^1,5,8 ile yakından ilişkilidir. APN, hücre girişi için bulaşıcı gastroenterit virüsünün başak proteinini tanır ve bağlar ve konakçı hücrelerle bakteriyel uyumu etkilemek için enterotoksijenik Escherichia coli F4 fimbriae'nin FaeG alt birimi ile doğrudan etkileşime girer ^9,10,11. Bu nedenle APN, viral ve bakteriyel enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde potansiyel bir terapötik hedeftir.

1975 yılında hibridoma teknolojisinin ve monoklonal antikorların (mAbs) üretimi için diğer stratejilerin geliştirilmesinden bu yana, mAbs immünoterapi, ilaç dağıtımı ve tanıda yaygın olarak kullanılmaktadır^12,13,14. Şu anda, mAbs kanser, enflamatuar bağırsak hastalığı ve multipl skleroz gibi hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmaktadır^12,15. Güçlü afiniteleri ve özgüllükleri nedeniyle, mAb'ler antikor-ilaç konjugatlarının (ADC) veya yeni aşıların geliştirilmesinde ideal hedefler olabilir^16,17. APN proteini, antijenleri spesifik hücrelere seçici olarak vermek için kritik öneme sahiptir ve düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler dahil olmak üzere herhangi bir müdahale olmaksızın patojenlere karşı spesifik ve güçlü bir mukozal bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabilir ^5,8,18. Bu nedenle, APN'ye özgü mAb'lere dayanan terapötik ürünler, bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, hibridoma teknolojisi kullanılarak APN'ye özgü mAbs üretimi ve prokaryotik ve ökaryotik vektörler kullanılarak anti-APN rekombinant antikorların (rAbs) ekspresyonu anlatılmaktadır. Sonuç, APN proteininin hem pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde hem de hibriddom türevi mAbs'de eksprese edilen rAbs tarafından tanındığını göstermektedir.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri Yangzhou Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (SYXK20200041) tarafından onaylanmıştır.

1. Domuz APN protein antijeninin hazırlanması

NOT: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) suşu ve APN kararlı bir şekilde eksprese edilen hücreler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2, önceki bir çalışmada^{inşa edilmiştir 11}.

1. Dondurulmuş bir gliserol stoğundan bakterileri geri kazanın ve tek koloni izolasyonu için 50 μg / mL kanamisin (Km ⁺) içeren Luria-Bertani (LB) plakalarına çizin.
2. Taze çizgili plakadan tek bir koloni seçin, Km⁺ (50 μg / mL) ile desteklenmiş 4 mL LB ortamında (10 g / L tripton, 10 g / L sodyum klorür (NaCl) ve 5 g / L maya ekstraktı, pH 7.2) kültür ve 37 ° C'de ajitasyon (178 rpm) ile gece boyunca (12-16 saat) büyümeye bırakın.
3. Hazırlanan bakterileri taze Km ⁺ LB suyunda 1:100'de seyreltin ve OD₆₀₀ 0.4-0.6'ya ulaşana kadar 2-3 saat çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin.
4. Ortama izopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek 0.4 mM'lik bir son konsantrasyona kadar ekleyin ve kültürleri 16 ° C'de 10 saat daha inkübe edin.
5. Sonuç olarak, IPTG indüksiyonunu kullanarak bakterileri santrifüj edin ve hasat edin (10.000 × g, 4 °C 15 dakika).
6. 1 mg/mL lizozim içeren 5 mL LEW (Lizis/Dengeleme/Yıkama) tamponu (50 mM susuz sodyum fosfat monobazik (NaH₂PO₄) ve 300 mM NaCl, pH 8.0) kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Bakteriyel süspansiyonu buz üzerinde 30 dakika karıştırın ve ultrasonik bir homojenleştirici kullanarak tamamen (15 s nabız ve 20 s kapalı, 15 dakika) sonikleştirin.
7. Hücresel kalıntıları gidermek için ham hücre lizatını 4 ° C'de ve 10.000 × g'da 30 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı önceden dengelenmiş bir kolona aktarın ve yerçekimi drenajından 1-2 dakika önce inkübe edin. Bu adımı üç kez yineleyin.
8. Kolonu 20 mL LEW tampon kullanarak yıkayın ve yerçekimi kullanarak boşaltın. Histidin etiketli APN proteinini 9 mL elüsyon tamponu (50 mM NaH,₂PO₄, 300 mM NaCl ve 250 mM imidazol, pH 8.0) kullanarak elute edin ve diyaliz tüpünde toplayın.
9. Protein çözeltisini gece boyunca 4 °C'de sodyum karbonat-sodyum bikarbonat (PBS, 135 mM NaCl, 4.7 mM potasyum klorür, 2 mM NaH 2 PO₄ ve 10 mM dodekahidrat sodyum fosfat dibazik, pH_7.2) tamponunda diyaliz edin.
10. APN proteininin saflığını değerlendirmek için %12.0 SDS-PAGE jel ve batı lekelemesi kullanarak analiz edin.
    1. Jelin her bir kuyucuğuna 5 μg protein yükleyin ve 1,5 saat boyunca 110 V'ta çalışmasına izin verin. Daha sonra, proteini 15 V'ta 50 dakika boyunca bir PVDF membranına aktarın.

2. Hayvan bağışıklaması

1. Subkutan (s.c), 6-8 haftalık dişi BALB / c farelerine, her 2 haftada bir adjuvanlarla karıştırılmış 50 μg APN proteini veya PBS (negatif kontrol) enjekte eder. İlk bağışıklama için ısıyla öldürülen Mikobakterileri içeren Freund'un adjuvanının tamamını ve güçlendirici bağışıklamalar için eksik Freund'un adjuvanını kullanın. Sırasıyla eşit miktarda APN proteini (veya PBS) ve Freund'un adjuvanını veya Freund'un eksik adjuvanını karıştırın.
2. 0.05 M PBS (pH 9.6) içinde seyreltilmiş 5 μg / mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotiter plakası kullanarak dolaylı enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile bu farelerin serumlarında APN'ye karşı antikor titrelerini tespit edin. .

3. APN'ye karşı monoklonal antikorlar üretmek için hibridoma teknolojisi

1. İntraperitoneal olarak (i.p.), son bir antijen artışı için seçilen farelere 100 μg APN proteini enjekte eder.
2. Üç gün sonra, pentobarbital sodyum (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) ve servikal çıkık kullanarak fareleri ötenazi yapın.
3. Dalakları toplayın ve kan ve yağ hücrelerini çıkarmak için DMEM ile iki kez yıkayın. Doku kalıntılarını gidermek için 200 örgülü bir bakır ızgara kullanarak dalak hücresi süspansiyonunu filtreleyin ve dalağın zarını çıkarmak için santrifüjleme (1500 × g, 10 dakika) kullanarak dalak hücrelerini toplayın.
4. 5 mL DMEM içeren 25 cm2'lik bir şişedeki tohum fare miyelom^SP2 /0 hücreleri, hücre canlılığını korumak için% 6 fetal sığır serumu (FBS) ve 37 ° C'de kültür,% 6 CO₂ atmosferi ile desteklenmiştir. 5-6 günlük kültürden sonra, hücreler resüsitasyon sonrası% 80-90 birleşmeye ulaşır ve büyüme günlüğü fazındadır. Mikroskop altında, hücreler yuvarlak, parlak ve berraktır.
5. Hibridizasyondan bir gün önce, daha önce yayınlanmış bir yönteme göre farelerin periton boşluklarından makrofajları toplayın^12,19.
6. Her biri 100 μL HAT ortamı (DMEM% 10 FBS ve 1x HAT Takviyesi ile desteklenmiş) içeren 96 delikli plakalarda 0.1-0.2 × 10⁵ / mL yoğunlukta peritoneal makrofajları tohumlayın ve gece boyunca 37 ° C'de,% 6 CO₂ nemlendirilmiş atmosferde inkübe edin.
7. Hibridizasyon için, SP2/0 hücrelerini 8-10 şişeden bir pipetle nazikçe aspire edin ve 10 mL serumsuz DMEM ortamında askıya alın. Hücreleri taze DMEM, santrifüj (1500 × g, 10 dakika) ile iki kez yıkayın ve ardından 10 mL DMEM'de tekrar askıya alın.
8. Niceliklendirilmiş dalak hücrelerini SP2/0 hücreleri ile 10:1 oranında karıştırın ve 50 mL tüplere aktarın. Santrifüj (1500 × g, 10 dk) ve süpernatanı atın. Tüplerin altındaki hücre peletlerini toplayın ve hibridizasyondan önce peletleri gevşetmek için avuç içi ile hafifçe vurun.
9. Önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 1 mL polietilen glikol 1500 (PEG 1500), tüpün tabanını yavaşça döndürürken, 45 s'lik bir süre boyunca gevşemiş hücre peletine bir damlalık kullanarak damla damla ekleyin.
10. Yukarıdaki karışıma 90 s boyunca 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 1 mL DMEM'i yavaşça ekleyin, ardından 30 mL taze DMEM daha ekleyin. Füzyon tüpünü 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
11. Sıcak banyoda inkübasyondan sonra, hücreleri toplayın ve HAT ortamında tekrar askıya alın. Daha sonra periton makrofajları ile aşılanmış 96 kuyucuklu bir plakada kültür.
12. Beş gün sonra, her bir oyuğa 100 μL taze HAT ortamı ekleyin ve plakayı 5 gün daha inkübe edin, ardından ortamı HT ortamı ile değiştirin (DMEM% 10 FBS ve 1x HT Takviyesi ile desteklenmiştir).
13. ELISA testi kullanarak hibridoma süpernatantındaki monoklonal antikorları analiz etmek için 0.05 M PBS (pH 9.6) içinde seyreltilmiş 5 μg / mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanın.
    1. 96 delikli plakanın kuyucuklarındaki ortam sarardığında (hücre büyümesi ve metabolit salınımı nedeniyle, ortamdaki pH 6.8'e düşer ve fenol kırmızısı fuşyadan sarıya döner) veya hücre kümeleri gözlendiğinde, seçilen kuyucuklardan 100 μL süpernatant elde edin ve kaplanmış ELISA plakasının kuyucuklarına ekleyin. OD450 değerlerini ölçmek için bir mikro plaka okuyucu kullanın.
    2. APN ve enfekte olmayan fare serumuna karşı poliklonal antikorları sırasıyla pozitif ve negatif kontrol olarak kullanın ve PBS'yi boş kontrol olarak kullanın. Bu çalışmada örneklemin OD450'nin negatif kontrole (P/N) oranı ≥ 2.1 pozitif seleksiyon standardı olarak kabul edilmiştir.
14. Üç ardışık pozitif seleksiyon turundan sonra, sınırlı bir seyreltme testi için APN proteinine karşı artan seroloji tepkisi gösteren hibridomayı seçin.
    1. Periton makrofajlarını ve tohumlarını daha önce tarif edildiği gibi 96 kuyucuklu plakalarda hazırlayın.
    2. HT ortamındaki hibridoma hücrelerini kuyucuk başına ortalama 0.5-2 hücrede ve kültürü 37 ° C,% 6 CO₂ inkübatörde askıya alın. ELISA immünoassay tarafından belirtilen pozitif oran% 100'e ulaşana kadar bu adımı üç veya dört kez tekrarlayın.
15. Sürekli donma ve çözülme baskısı altında, anti-APN antikorlarını kararlı bir şekilde salgılayabilen ve normal şekilde çoğalabilen pozitif hibridom hücrelerini seçin.
    1. Her fareye tek bir i.p. enjeksiyonu uygulayın 0.3 mL pristan (8-10 hafta). Bozulmamış aldıktan 10 gün sonra, her fareye 0.5 mL PBS (pH 7.2) içinde 2-5 x 10⁵ hibridoma hücresi enjekte edin.
    2. Enjeksiyondan 8 ila 10 gün sonra bu farelerin periton boşluğundan periton sıvısını dikkatlice toplayın.
    3. Süpernatantları 15 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin ve% 33 doymuş amonyum sülfat [(NH 4)₂SO₄] çökeltme ve protein A agaroz kullanarak süpernatantlardaki antikorları saflaştırın.

4. APN proteinine karşı mAbs'nin karakterizasyonu

1. SBA Klonotipleme Sistemi-HRP²⁰ kullanarak toplanan mAb'lerin immünoglobulin alt tipini belirleyin. mAb saflığını ve özgüllüğünü değerlendirmek için SDS-PAGE ve western blotting kullanın.
2. ELISA²¹ kullanarak APN proteinine karşı mAb epitop özgüllüğünü analiz edin. Katkı değeri (AV), mAbs'nin aynı antijenik bölgeyi tanıyıp tanımadığını değerlendirmek için kullanılan OD mAbs'nin (a + b) (OD mAbs-a_{+ OD mAbs-b)} oranıdır; OD_mAbs-a ve OD mAbs-b, tek başına APN'ye karşı farklı monoklonal antikorların OD450 değerlerini temsil eder ve OD_{mAbs (a + b),} APN'ye karşı iki_mAb'nin 1: 1 karışımının OD450 değerlerini temsil eder.
   1. Her numuneyi en az dört kopya olarak değerlendirin ve tüm deneyi en az üç kez tekrarlayın.

5. APN'ye karşı rAbs ifadesi

1. Yukarıda bahsedilen hibridoma hücrelerinden ve APN ile bağışıklanmış farelerin dalaklarından (örneğin, TRIzol^{) toplam} RNA'yı çıkarın22. Üreticinin talimatlarına göre bir cDNA sentez kiti kullanarak tamamlayıcı DNA'yı (cDNA) sentezleyin.
2. İç içe geçmiş PCR kullanarak mAbs'nin değişken bölgelerini yükseltin ve dizilemeyi kullanarak ağır zincir (VH) ve hafif zincir (VL) dizilerini belirleyin. IMGT fare genomu analiz aracını (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php) kullanarak VH ve VL'yi kodlayan genleri analiz edin.
3. VH ve VL genlerini lider dizilerle birleştirin ve izsiz DNA fragmanı yerleştirmeye izin vermek için dikişsiz klonlama teknolojisini kullanarak bunları sırasıyla pET28a (+) ve pIRES2-ZsGreen1 vektörlerine alt klonlayın. Belirli astarlar Tablo 1'de listelenmiştir.
4. pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transforme bakterileri, 10 saat boyunca 37 ° C'de orbital çalkalayıcılarda 0.4 mM IPTG varlığında büyütün. Daha sonra rutin protein saflaştırmasını kullanarak rAbs proteininin ekspresyonunu indükleyin, saflaştırın ve değerlendirin.
5. Kuyucuk başına 100 μL 0,5 x 10⁵ CHO hücresini 96 delikli bir plakaya tohumlayın ve 18-24 saat boyunca% 6 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler% 80-90 birleşime ulaştığında, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plazmidini Opti-MEM ile 0.1 μg / μL'lik son bir konsantrasyona seyreltin ve transfeksiyon için kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. 50 μL seyreltilmiş pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plazmidini 1 μL Lipofectamine 2000 ve 49 μL Opti-MEM ile yavaşça karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin. CHO hücreleri içeren 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL karışım ekleyin ve 4-6 saat boyunca% 6 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
7. Transfeksiyon sonrası 4-6 saatte, ortamı% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı ile değiştirin ve plakayı 48 saat daha inkübe edin. Ardından, kararlı şekilde transfekte edilmiş hücreleri seçmek için her bir kuyucuğa 400 μg / mL G418 ekleyin.
8. % 10 FBS ve 400 μg / mL G418 ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamını kullanarak 10 günlük seçimden sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasına göre hücreleri (3.0 × 10⁷ hücre / mL) sıralayın. Hücre popülasyonunun yaklaşık %10-15'i pozitifti.
9. Hasat edilen pozitif hücreleri seri olarak seyreltin, 96 delikli bir plakada kuyu başına ortalama 0.5-2 hücrede tohum ve 37 ° C,% 6 CO₂ inkübatörde kültür. G418 (200 μg/mL) ile seçilimi kullanarak kararlı şekilde transfekte edilmiş pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerini koruyun.
10. Yukarıda tarif edilen hücre kültürü ortamındaki FBS konsantrasyonu, 3 haftalık süre boyunca logaritmik büyüme fazı sırasında% 10'dan% 0'a kademeli olarak azalır. Ardından, yapışkan CHO hücrelerini serumsuz bir ortamda büyümeyi askıya almak için uyarlayın.
11. Serumsuz ortamda logaritmik büyüme fazında tohumlanmış pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerini 80-110 rpm sallama hızında ve 37 ° C, % 6 CO₂ sallama şişelerinde 0.8-1.0^× 10 5 hücre / mL yoğunlukta kültürleyin.
12. Üreticinin talimatlarına göre bir hücre sayma kiti (örneğin, CCK-8) kullanarak hücre canlılığı ve canlılığındaki değişiklikleri belirlemek için her 12 saatte bir hücre süspansiyonunu toplayın.
13. Antikor ekspresyonu, hücre canlılığı% 80'e düştüğünde ve hücre yoğunluğu 10⁶ hücre / mL× 1.0-2.0'a ulaştığında pik seviyelere ulaşır. Santrifüjleme kullanarak hücre süpernatantlarını toplayın, 0.22 μm politetrafloroetilen membran filtresi kullanarak filtreleyin ve protein A agarozu kullanarak saflaştırın.
14. Dolaylı immünofloresan testleri (IFA) kullanarak APN'ye özgü antikorların üretimini doğrulayın.
15. Daha önce tarif edildiği gibi ELISA testini kullanarak antikor titrelerini ve bağlanma afinitelerini belirleyin. ²³ Antikorların denge ayrışma sabitini (K_D değeri) yazılım kullanarak dört parametreli bir lojistik denklemle hesaplayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, fare bağışıklaması için saflaştırılmış çözünür APN proteini (2.12 mg / mL) kullanılmıştır. APN proteini ile 14 günlük aralıklarla dört kez aşılanan fareler, serumlarında APN'ye karşı daha yüksek bir antikor titresi sergiledi. Füzyon deneyleri kullanılarak 14 hibridom elde edilmesine rağmen, üç sürekli donma-çözülme döngüsünden sadece 9 hibridoma hayatta kaldı ve APN'ye karşı antikor salgılayan 9 kararlı klon ile sonuçlandı. Tüm bu hücreler yuvarlak, parla...

Tartışmalar

Mukozal immünitenin indüklenmesi, patojenlere karşı koymada ve çeşitli hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde en etkili yaklaşımlardan biridir. Bağırsak mukozasında yüksek oranda eksprese edilen membrana bağlı bir protein olan APN, adaptif immün yanıtın indüklenmesinde ve reseptör aracılı viral ve bakteriyel endositozda rol oynar ^1,5,8. APN, antijen yüklemesi ve aşı dağıtımının birçok formatı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture