Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

Zusammenfassung

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Zusammenfassung

Porcine Aminopeptidase N (APN), eine membrangebundene Metallopeptidase, die reichlich in der Dünndarmschleimhaut vorkommt, kann eine mukosale Immunantwort auslösen, ohne dass es zu Störungen wie geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder strukturellen Veränderungen kommt. Dies macht APN zu einem attraktiven Kandidaten für die Entwicklung von Impfstoffen, die selektiv auf das Schleimhautepithel abzielen. Frühere Studien haben gezeigt, dass APN ein Rezeptorprotein sowohl für enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als auch für das übertragbare Gastroenteritisvirus ist. Daher ist APN vielversprechend bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten oder neuartigen Impfstoffen auf Basis von APN-spezifischen Antikörpern. In dieser Studie verglichen wir die Produktion von APN-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) unter Verwendung der traditionellen Hybridomtechnologie und der rekombinanten Antikörperexpressionsmethode. Wir etablierten auch eine stabil transfizierte Ovarialzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO) unter Verwendung von pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN und einem E. coli-Expressionsstamm BL21(DE3), der den pET28a (+)-rAbs-APN-Vektor beherbergt . Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, und mAbs, die mit Hilfe von Hybridomen hergestellt werden, das APN-Protein erkennen und daran binden können. Dies bildet die Grundlage für die weitere Aufklärung der Funktion des APN-Rezeptors für die Entwicklung von Therapeutika, die auf verschiedene APN-spezifische Epitope abzielen.

Einleitung

Aminopeptidase N (APN), ein Schwarzlichtenzym, das zur Familie der Metalloproteinase M1 gehört, fungiert über enzymabhängige und enzymunabhängige Signalwege als Tumormarker, Rezeptor und Signalmolekül ^1,2. Neben der Spaltung der N-terminalen Aminosäurereste verschiedener bioaktiver Peptide zur Regulation ihrer biologischen Aktivität spielt APN eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener entzündlicher Erkrankungen. APN ist an der Antigenprozessierung und -präsentation durch getrimmte Peptide beteiligt, die fest an wichtige Histokompatibilitätskomplexe der Klasse II binden ^2,3. APN übt auch entzündungshemmende Wirkungen aus, indem es an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bindet, die an der multiplen Signaltransduktion beteiligt sind, die Zytokinsekretion moduliert und zur Fc-Gammarezeptor-vermittelten Phagozytose in der Immunantwort beiträgt 4,5,6,7.

Als weit verbreitete membrangebundene Exopeptidase ist APN in der Dünndarmschleimhaut des Schweins reichlich vorhanden und steht in engem Zusammenhang mit der rezeptorvermittelten Endozytose ^1,5,8. APN erkennt und bindet das Spike-Protein des transmissiblen Gastroenteritis-Virus für den Zelleintritt und interagiert direkt mit der FaeG-Untereinheit der enterotoxigenen Escherichia coli F4-Fimbrien, um die bakterielle Adhärenz mit Wirtszellen zu beeinflussen 9,10,11. Damit ist APN ein potenzielles therapeutisches Ziel bei der Behandlung viraler und bakterieller Infektionskrankheiten.

Seit der Entwicklung der Hybridomtechnologie und anderer Strategien für die Produktion monoklonaler Antikörper (mAbs) im Jahr 1975 werden mAbs in großem Umfang in der Immuntherapie, der Verabreichung von Medikamenten und der Diagnose eingesetzt^12,13,14. Derzeit werden mAbs erfolgreich zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs, entzündlichen Darmerkrankungen und Multipler Sklerose eingesetzt^12,15. Aufgrund ihrer starken Affinität und Spezifität können mAbs ideale Ziele bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADC) oder neuen Impfstoffen sein^16,17. Das APN-Protein ist entscheidend für die selektive Abgabe von Antigenen an bestimmte Zellen und kann eine spezifische und starke mukosale Immunantwort gegen Krankheitserreger hervorrufen, ohne dass es zu Störungen kommt, einschließlich geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder struktureller Veränderungen ^5,8,18. Daher sind Therapeutika, die auf APN-spezifischen mAbs basieren, vielversprechend gegen bakterielle und virale Infektionen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Produktion von APN-spezifischen mAbs mit Hilfe der Hybridomtechnologie und die Expression von anti-APN rekombinanten Antikörpern (rAbs) mit Hilfe von prokaryotischen und eukaryotischen Vektoren. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass das APN-Protein sowohl von rAbs, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, als auch von Hybridom-abgeleiteten mAbs erkannt wurde.

Protokoll

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Yangzhou genehmigt (SYXK20200041).

1. Herstellung des porcinen APN-Protein-Antigens

ANMERKUNG: Der Stamm pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) und die stabil exprimierten APN-Zellen pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 wurden in einer früheren Studie konstruiert¹¹.

1. Bakterien aus einem gefrorenen Glycerinvorrat gewinnen und auf Luria-Bertani (LB)-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin (Km⁺) streifen, um eine einzelne Kolonie zu isolieren.
2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der frisch gestreiften Platte aus, kultivieren Sie sie in 4 ml LB-Medium (10 g/L Trypton, 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) und 5 g/L Hefeextrakt, pH 7,2), ergänzt mit Km⁺ (50 μg/ml), und lassen Sie sie über Nacht (12-16 h) unter Rühren (178 U/min) bei 37 °C wachsen.
3. Die vorbereiteten Bakterien im Verhältnis 1:100 in frischer Km⁺ LB-Brühe verdünnen und bei 37 °C unter Schütteln 2-3 h inkubieren, bis der OD₆₀₀ 0,4-0,6 erreicht.
4. Dem Medium wird Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben und die Kulturen weitere 10 h bei 16 °C inkubiert.
5. Anschließend werden die Bakterien mittels IPTG-Induktion (10.000 × g, 4 °C 15 min) zentrifugiert und geerntet.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 mL LEW-Puffer (Lyse/Äquilibration/Wash) (50 mM wasserfreies Natriumphosphat monobasisch (_NaH2PO4) und 300 mM NaCl, pH 8,0), das 1 mg/ml Lysozym enthält. Rühren Sie die Bakteriensuspension 30 Minuten lang auf Eis und beschallen Sie sie vollständig (15 s Impuls und 20 s aus, 15 min) mit einem Ultraschallhomogenisator.
7. Zentrifugieren Sie das Rohzelllysat bei 4 °C und 10.000 × g für 30 Minuten, um Zellreste zu entfernen. Überstand in eine voräquilibrierte Säule überführen und 1-2 Minuten vor der Schwerkraftdrainage inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
8. Waschen Sie die Säule mit 20 ml LEW-Puffer und lassen Sie sie mit Hilfe der Schwerkraft abtropfen. Das Histidin-markierte APN-Protein wird mit 9 ml Elutionspuffer (50 mM_NaH2PO₄, 300 mM NaCl und 250 mM Imidazol, pH 8,0) eluiert und in Dialyseschläuche gesammelt.
9. Dialysieren Sie die Proteinlösung über Nacht bei 4 °C in Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM Kaliumchlorid, 2 mM_NaH2PO4und 10 mM Dodecahydrat Natriumphosphat zweibasisch, pH 7,2).
10. Analysieren Sie mit einem 12,0%igen SDS-PAGE-Gel und Western Blotting, um die Reinheit des APN-Proteins zu beurteilen.
    1. Geben Sie 5 μg Protein in jede Vertiefung des Gels und lassen Sie es 1,5 Stunden lang bei 110 V laufen. Übertragen Sie dann das Protein 50 Minuten lang bei 15 V auf eine PVDF-Membran. Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Proteins mit einem BCA-Assay.

2. Immunisierung von Tieren

1. Subkutane (s.c) injizierte weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen mit 50 μg APN-Protein oder PBS (Negativkontrolle) gemischt mit Adjuvantien alle 2 Wochen. Verwenden Sie für die Erstimmunisierung ein vollständiges Freund-Adjuvans, das die hitzeabgetöteten Mykobakterien enthält, und ein unvollständiges Freund-Adjuvans für Auffrischungsimpfungen. Mischen Sie gleiche Mengen APN-Protein (oder PBS) und Freund-Adjuvans bzw. unvollständiges Freund-Adjuvans.
2. Nachweis von Antikörpertitern gegen APN in den Seren dieser Mäuse mittels indirektem ELISA-Assay (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, das in 0,05 M PBS (pH 9,6) verdünnt ist. .

3. Hybridom-Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen APN

1. Intraperitoneal (i.p.) werden 100 μg APN-Protein in die ausgewählten Mäuse injiziert, um einen abschließenden Antigen-Boost zu erhalten.
2. Drei Tage später werden die Mäuse mit Pentobarbitalnatrium (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) und Zervixluxation eingeschläfert.
3. Milz sammeln und zweimal mit DMEM waschen, um Blut- und Fettzellen zu entfernen. Filtern Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Mesh-Kupfergitter, um Gewebereste zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen durch Zentrifugation (1500 × g, 10 min), um die Milzmembran zu entfernen.
4. Samenzellen des Maus-Myeloms SP2/0 in einem 25-cm-2-Kolben mit 5 ml DMEM, ergänzt mit 6 % fötalem Kälberserum (FBS) und Kultur bei 37 °C, 6 % CO₂ -Atmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach 5-6 Tagen Kultur erreichen die Zellen nach der Reanimation eine Konfluenz von 80%-90% und befinden sich in der Wachstumsphase. Unter dem Mikroskop sind die Zellen rund, hell und klar.
5. Einen Tag vor der Hybridisierung werden Makrophagen aus den Peritonealhöhlen der Mäuse nach einer zuvor veröffentlichten Methode gesammelt^12,19.
6. Peritonealmakrophagen mit einer Dichte von 0,1-0,2 × 10⁵/ml in 96-Well-Platten, die jeweils 100 μl HAT-Medium enthalten (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1x HAT-Supplement), und inkubieren über Nacht bei 37 °C, 6 % CO₂ befeuchteter Atmosphäre.
7. Für die Hybridisierung werden SP2/0-Zellen vorsichtig mit einer Pipette aus 8-10 Flaschen abgesaugt und in 10 ml serumfreiem DMEM-Medium suspendiert. Zellen mit frischem DMEM waschen, zweimal zentrifugieren (1500 × g, 10 min) und dann in 10 ml DMEM resuspendieren.
8. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SP2/0-Zellen im Verhältnis 10:1 und überführen Sie sie in 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren (1500 × g, 10 min) und den Überstand entsorgen. Sammeln Sie die Zellpellets am Boden der Röhrchen und klopfen Sie mit der Handfläche, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen.
9. 1 ml Polyethylenglykol 1500 (PEG 1500), vorgewärmt auf 37 °C, mit einer Pipette über einen Zeitraum von 45 s tropfenweise auf das gelöste Zellpellet geben, dabei den Boden des Röhrchens vorsichtig drehen.
10. Fügen Sie der obigen Mischung über einen Zeitraum von 90 s langsam 1 ml auf 37 °C vorgewärmtes DMEM hinzu, gefolgt von weiteren 30 ml frischem DMEM. Legen Sie das Fusionsröhrchen für 30 min in ein 37 °C warmes Wasserbad.
11. Nach der Inkubation im warmen Bad werden die Zellen geerntet und in HAT-Medium resuspendiert. Dann Kultur in einer 96-Well-Platte, die mit Peritonealmakrophagen inokuliert wurde.
12. Fünf Tage später geben Sie 100 μl frisches HAT-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für weitere 5 Tage, danach ersetzen Sie das Medium durch HT-Medium (DMEM ergänzt mit 10% FBS und 1x HT Supplement).
13. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, das in 0,05 M PBS (pH 9,6) verdünnt ist, um monoklonale Antikörper im Hybridomüberstand mittels ELISA-Assay zu analysieren.
    1. Wenn sich das Medium in den Vertiefungen der 96-Well-Platte gelb verfärbt (aufgrund des Zellwachstums und der Freisetzung von Metaboliten sinkt der pH-Wert im Medium auf 6,8 und Phenolrot verfärbt sich von Fuchsia zu Gelb) oder Zellcluster beobachtet werden, nehmen Sie 100 μl Überstand aus den ausgewählten Wells und geben Sie es in die Wells der beschichteten ELISA-Platte. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die OD450-Werte zu messen.
    2. Verwenden Sie die polyklonalen Antikörper gegen APN und nicht infiziertes Mausserum als Positiv- bzw. Negativkontrolle und verwenden Sie PBS als Blankokontrolle. In dieser Studie wurde das OD450-Verhältnis von Probe zu Negativkontrolle (P/N) ≥ 2,1 als positiver Selektionsstandard anerkannt.
14. Nach drei aufeinanderfolgenden positiven Selektionsrunden wird das Hybridom ausgewählt, das ein erhöhtes serlogisches Ansprechen gegen das APN-Protein zeigt, um einen begrenzten Verdünnungstest durchzuführen.
    1. Präparation von Peritonealmakrophagen und Samen in 96-Well-Platten, wie zuvor beschrieben.
    2. Hybridomzellen werden in HT-Medium bei durchschnittlich 0,5-2 Zellen pro Well suspendiert und in einem Inkubator mit 6 % CO₂ -Gehalt bei 37 °C kultiviert. Wiederholen Sie diesen Schritt drei- bis viermal, bis die durch den ELISA-Immunoassay angezeigte Positivrate 100 % erreicht.
15. Wählen Sie unter dem Druck des kontinuierlichen Einfrierens und Auftauens die positiven Hybridomzellen aus, die in der Lage sind, stabil Anti-APN-Antikörper zu sezernieren und sich normal zu vermehren.
    1. Verabreichen Sie jeder Maus eine einmalige i.p. Injektion von 0,3 ml Pristane (8-10 Wochen). 10 Tage nach Erhalt von Pristine injizieren Sie jeder Maus 2-5 x 10 5 Hybridomzellen in^{0,5 ml} PBS (pH 7,2).
    2. Sammeln Sie 8 bis 10 Tage nach der Injektion vorsichtig Peritonealflüssigkeit aus der Bauchhöhle dieser Mäuse.
    3. Die Überstände werden durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 15 Minuten geerntet und die Antikörper in den Überständen mit 33 % gesättigtem Ammoniumsulfat [(NH 4)₂SO₄]-Fällung und Protein-A-Agarose gereinigt.

4. Charakterisierung von mAbs gegen APN-Protein

1. Bestimmung des Immunglobulin-Subtyps der entnommenen mAbs mit einem SBA Clonotyping System-HRP²⁰. Verwenden Sie SDS-PAGE und Western Blotting, um die Reinheit und Spezifität von mAb zu beurteilen.
2. Analyse der mAb-Epitopspezifität gegen das APN-Protein mittels ELISA²¹. Der Additivitätswert (AV) ist das Verhältnis von OD-mAbs (a+_{b) zu (OD mAbs-a+} OD_mAbs-b), das verwendet wird, um zu beurteilen, ob_mAbs dieselbe antigene Stelle erkennen; OD_mAbs-a und OD_mAbs-b repräsentieren die OD450-Werte verschiedener monoklonaler Antikörper gegen APN allein, und OD-mAbs_(a+b) repräsentieren die OD450-Werte einer 1:1-Mischung von zwei mAbs gegen APN.
   1. Bewerten Sie jede Probe mit mindestens vier Wiederholungen und wiederholen Sie das gesamte Experiment mindestens dreimal.

5. Ausprägung von rAbs gegen APN

1. Extraktion der Gesamt-RNA aus den oben genannten Hybridomzellen und der Milz von APN-immunisierten Mäusen (z. B. TRIzol)²². Synthetisieren Sie komplementäre DNA (cDNA) mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Amplifizieren Sie variable Regionen von mAbs mittels verschachtelter PCR und bestimmen Sie Sequenzen von schweren Ketten (VH) und leichten Ketten (VL) mithilfe von Sequenzierung. Analysieren Sie die Gene, die VH und VL kodieren, mit dem IMGT-Mausgenomanalyse-Tool (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Kombinieren Sie die VH- und VL-Gene mit Leader-Sequenzen und subklonieren Sie sie sequenziell in die vektoren pET28a (+) bzw. pIRES2-ZsGreen1, wobei die nahtlose Klonierungstechnologie verwendet wird, um eine narbenfreie Insertion von DNA-Fragmenten zu ermöglichen. Die spezifischen Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Die pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformierten Bakterien wurden in Gegenwart von 0,4 mM IPTG in Orbitalschüttlern bei 37 °C für 10 h gezüchtet. Anschließend induzieren, reinigen und untersuchen Sie die Expression des rAbs-Proteins mithilfe der routinemäßigen Proteinreinigung.
5. 100 μL 0,5 x 10⁵ CHO-Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte geben und bei 37 °C in einer 6%igen CO₂ -Atmosphäre 18-24 h inkubieren. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80-90% erreicht haben, wird das pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-Plasmid mit Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 0,1 μg/μl verdünnt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor es für die Transfektion verwendet wird.
6. Mischen Sie vorsichtig 50 μl verdünntes pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-Plasmid mit 1 μl Lipofectamin 2000 und 49 μl Opti-MEM und inkubieren Sie die Mischung weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. 100 μl der Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit CHO-Zellen geben und bei 37 °C in 6%iger CO₂ -Atmosphäre 4-6 h inkubieren.
7. 4-6 h nach der Transfektion wird das Medium durch ein DMEM-F12-Medium ersetzt, das mit 10 % FBS angereichert ist, und die Platte für weitere 48 h inkubiert. Geben Sie dann 400 μg/ml G418 in jede Vertiefung, um die stabil transfizierten Zellen auszuwählen.
8. Nach 10-tägiger Selektion mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 400 μg/mL G418, werden die Zellen (3,0 × 10⁷ Zellen/ml) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung sortiert. Etwa 10-15% der Zellpopulation waren positiv.
9. Erntete positive Zellen seriell verdünnen, mit durchschnittlich 0,5-2 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte aussaaten und in einem Inkubator mit 67 °C und 6 % CO₂ kultivieren. Die stabil transfizierten pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen werden durch Selektion mit G418 (200 μg/mL) erhalten.
10. Die FBS-Konzentration im oben beschriebenen Zellkulturmedium nimmt während der logarithmischen Wachstumsphase über einen Zeitraum von 3 Wochen allmählich von 10 % auf 0 % ab. Passen Sie dann die adhärenten CHO-Zellen an das Suspensionswachstum in einem serumfreien Medium an.
11. Kultivieren Sie die ausgesäten pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in serumfreiem Medium mit einer Dichte von 0,8-1,0 ×^10,5 Zellen/ml in Schüttelkolben bei 80-110 U/min Schüttelgeschwindigkeit und 37°C, 6%_CO2.
12. Sammeln Sie die Zellsuspension alle 12 Stunden, um Veränderungen der Zellviabilität und Vitalität mit einem Zellzählkit (z. B. CCK-8) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
13. Die Antikörperexpression erreicht ein Höchstniveau, wenn die Zellviabilität auf 80 % sinkt und die Zelldichte 1,0-2,0 × 10⁶ Zellen/ml erreicht. Zellüberstände mittels Zentrifugation ernten, mit einem 0,22-μm-Polytetrafluorethylen-Membranfilter filtrieren und mit Protein-A-Agarose reinigen.
14. Bestätigung der Produktion von APN-spezifischen Antikörpern mit indirekten Immunfluoreszenz-Assays (IFA).
15. Bestimmen Sie Antikörpertiter und Bindungsaffinitäten mit einem ELISA-Assay, wie zuvor beschrieben. ²³ Berechnen Sie die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (_K-D-Wert ) der Antikörper mit einer logistischen Gleichung mit vier Parametern unter Verwendung einer Software.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde das gereinigte lösliche APN-Protein (2,12 mg/ml) für die Immunisierung von Mäusen verwendet. Mäuse, die viermal im Abstand von 14 Tagen mit dem APN-Protein immunisiert wurden, wiesen in ihren Seren einen höheren Antikörpertiter gegen APN auf. Obwohl mit den Fusionsexperimenten 14 Hybridome gewonnen wurden, überlebten nur 9 Hybridome die drei kontinuierlichen Gefrier-Tau-Zyklen, was zu 9 stabilen Klonen führte, die Antikörper gegen APN sezernierten. Alle diese Zellen sind rund, hell und kla...

Diskussion

Die Induktion der Schleimhautimmunität ist einer der effektivsten Ansätze zur Bekämpfung von Krankheitserregern und zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten. APN, ein hochexprimiertes membrangebundenes Protein in der Darmschleimhaut, ist an der Induktion der adaptiven Immunantwort und an der rezeptorvermittelten viralen und bakteriellen Endozytose beteiligt ^1,5,8. APN wird als Antigenpartikel in vielen Formaten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture