فحص الببتيدات التي تنشط MRGPRX2 باستخدام خلايا HEK المهندسة

Summary

يتم وصف تقنيات إنشاء مكتبة من الببتيدات القصيرة التي يمكن تنشيط الخلايا السارية عن طريق مستقبلات MRGPRX2. التقنيات المرتبطة سهلة وغير مكلفة ، ويمكن تمديدها إلى مستقبلات الخلايا الأخرى.

Abstract

تحديد ligands محددة لمستقبلات الخلايا ذات الأهمية العلاجية أمر بالغ الأهمية بالنسبة للعديد من التطبيقات، بما في ذلك تصميم وتطوير علاجات جديدة. ماس ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2) هو مستقبل مهم ينظم تنشيط الخلايا الصاري، وبالتالي، يوجه الاستجابة المناعية العامة. وقد تم تحديد العديد من الليجاندات لMRGPRX2 وتشمل الببتيدات الذاتية مثل PAMPs، defensins، LL-37 وغيرها من شظايا البروتين (أي، الألبومين المتدهورة). ويتطلب تحديد المزيد من الليجاندات المحددة MRGPRX2 فحص عدد كبير من الببتيدات (أي مكتبة الببتيد)؛ ومع ذلك، الخلايا الصاري صعبة ومكلفة للحفاظ على في المختبر، وبالتالي، ليست اقتصادية لاستخدامها لفحص أعداد كبيرة من الجزيئات. توضح هذه الورقة طريقة لتصميم وتطوير وفحص مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة باستخدام MRGPRX2 التي تعبر عن خلايا HEK. هذا الخط الخلية سهلة نسبيا وغير مكلفة للحفاظ على ويمكن استخدامها لتحليل عالية الإنتاجية في المختبر. تم استخدام صبغة فلورية حساسة للكالسيوم Fura-2 لوضع علامة على تدفق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لمراقبة التنشيط. واستخدمت نسبة كثافة الفلورية من Fura-2 في 510 نانومتر ضد أطوال موجية الإثارة من 340 و 380 نانومتر لحساب تركيز الكالسيوم. كانت مكتبة الببتيد المستخدمة للتحقق من هذا النظام تستند إلى الإفرازات الذاتية Proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) ، والتي من المعروف أنها تربط MRGPRX2 بخصوصية وتقارب عاليين. تم إنشاء الببتيدات اللاحقة من خلال اقتطاع الأحماض الأمينية وتقنيات مسح ألانين المطبقة على PAMP-12. الطريقة الموصوفة هنا بسيطة وغير مكلفة ولكنها قوية لفحص مكتبة كبيرة من المركبات لتحديد نطاقات الربط والمعلمات الهامة الأخرى التي تلعب دورا هاما في تنشيط المستقبلات.

Introduction

الخلايا الصاري هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي وتلعب دورا حاسما في كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يتم تنشيط الخلايا الصاري في المقام الأول إما عن طريق ربط مستضد للغلوبولين المناعي E (IgE) - مجمع مستقبلات FcεRI ، أو بواسطة ماس المكتشفة مؤخرا ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2)¹. وقد تم ربط تنشيط MRGPRX2 إلى العديد من الأمراض المناعية والالتهابية، وبالتالي، من المهم أن نفهم آلية ملزمة للمستقبلات إلى ليغاندس^2. للقيام بذلك ، تم تطوير مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة وفحصها ضد مستقبلات MRGPRX2 التي تم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا HEK. في الدراسة، تم بناء مكتبة الببتيد باستخدام تقنيات بسيطة ومتعددة الاستخدامات لمسح ألانين واقتطاع الأحماض الأمينية. يتضمن مسح ألانين استبدال الأحماض الأمينية المحددة ببقايا ألانين. ألانين يجري صغيرة ومحايدة، يجرد الببتيد من خصائص محددة التي تمنحها بقايا استبدال ويسلط الضوء على التوالي على أهمية الخصائص الفيزيائية الكيميائية لكل من الأحماض الأمينية في التفاعلات مستقبلات. على العكس من ذلك، في اقتطاع الأحماض الأمينية، تم تصميم تسلسل الببتيد بحيث يفتقر إلى واحد أو أكثر من بقايا الأحماض الأمينية من محطة N، محطة C، أو كليهما. تم استخدام هذه المجموعة من الببتيدات لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية الحاسمة لربط MRGPRX2.

وقد أظهرت تجربة مع خطوط الخلايا الصاري البشري (LAD-2) أن هذه الخلايا من الصعب على الثقافة والحفاظ على في المختبر: مضاعفة الوقت لمدة أسبوعين, ملاحق متوسطة مكلفة, والاهتمام المباشر المطلوب أثناء passaging³. هذه السمات تجعل الخلايا غير مناسبة لفحص واسع النطاق من الليغاند المحتملة. هنا، استخدمت خلايا HEK المصابة بشكل ثابت التي تعبر عن مستقبلات MRGPRX2 (HEK-X2) لفحص مكتبة الببتيد¹. وتستخدم على نطاق واسع HEK-293 خلايا ودرس للتعبير heterologous من مستقبلات السطح بسبب كفاءتها عالية transfection, معدل مضاعفة أسرع, والحاجة إلى المكملات الغذائية المتوسطة غير مكلفة أن تكون مثقفة في المختبر⁴. وقد ثبت البروتوكول إلى خط الخلية HEK-293 transfect وراسخة⁵. تم تنشيط خلايا HEK-293 التي تعبر بشكل ثابت عن مستقبلات MRGPRX2 (الممر 13-19) مع الببتيدات المتولدة من خلال الاقتطاع N ، C-truncation ، N + C -truncation ، ومسح ألانين¹. استخدمت خلايا HEK البرية من النوع (HEK-WT) (الممر 16-21) كتحكم. تم رصد إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لدراسة التنشيط القائم على MRGPRX2.

ويتبع تنشيط الخلية من قبل MRGPRX2 تعبئة الكالسيوم السيتوسوليك. وينظم هذا الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا المنظمة في الخلايا الصاري من قبل مخزن تشغيل إدخال الكالسيوم (SOCE), منسقة من قبل جزيء التفاعل سترومال 1 (STIM1); وهو مركزي لسلسلة الاستجابة المناعية^6،7. وقد استخدمت أساليب مختلفة للكشف عن تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، بما في ذلك التصحيح المشابك والأصباغ الفلورية⁸. من بين جميع التقنيات المتاحة ، يتم استخدام أصباغ الكالسيوم الفلورية في اقترانها بتقنيات الكشف المختلفة على نطاق واسع⁹. نوعان من الأصباغ الفلورية التي اكتسبت مصالح هي، الأصباغ الطول الموجي واحد مثل فلوو-4، والأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج مثل الهند -1 وفورا-2. الميزة التي تجلب الأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج أكثر من الأصباغ الطول الموجي واحد هو أن الأصباغ ratiometric الصحيح للأخطاء التجريبية مثل تحميل صبغة، تبييض الصور، والتركيز^10،11.

Fura-2 أستر أسيتوكسي ميثيل (Fura-2 AM) هي خلية تتخللها صبغة خضراء فلورية يتحول الإثارة إلى طول موجي أقل عند ربط الكالسيوم. من الناحية التجريبية، Fura-2 متحمس في 340 و 380 نانومتر، في حين يتم تسجيل الانبعاثات في 510 نانومتر. عند ربط الكالسيوم، تزداد كثافة الفلورسنت عند 340 نانومتر بينما تنخفض كثافة 380 نانومتر، كما هو موضح في الشكل 1. يتم تمثيل البيانات كنسبة من كثافة الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى كثافة بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) أي F340/F380. تتناسب نسبة F340/F380 مع الكالسيوم داخل الخلايا، والتي يمكن حساب قيمتها من خلال معادلة Grynkiewicz^12. منذ يتم الحصول على إشارة مضان من إثارة الصبغة في اثنين من الأطوال الموجية (340 نانومتر و 380 نانومتر)، ونسبة إشارات مضان يصحح لعوامل تجريبية مثل تحميل صبغة، تسرب صبغ، photobleaching، وكثافات الخلية.

Protocol

1. تصميم وتطوير مكتبة الببتيد

1. لتحديد ligands من مستقبلات MRGPRX2 الخلية الصاري على أساس ligand المعروفة أي PAMP-12¹³، اتبع الخطوات التالية.
   1. توليد N-مبتورة مكتبة الببتيد عن طريق اقتطاع بقايا الأحماض الأمينية N-المحطة من ليغند, على التوالي, عن طريق تركيب الببتيد المرحلة الصلبة (SPPS).
   2. توليد مكتبة الببتيد C-مبتورة عن طريق اقتطاع بقايا الأحماض الأمينية C-المحطة الطرفية من ligand المعروفة، على التوالي، من قبل SPPS.
   3. استنادا إلى نتائج 1.1.1 و 1.1.2، قم بإنشاء مكتبة ببتيد N+C-مبتورة باستخدام SPPS عن طريق اقتطاع المخلفات المطلوبة من N و C-terminal، على التوالي.
   4. استخدام توليف الببتيد الصلبة المرحلة لتجميع الببتيدات¹³.
   5. تعديل N-المحطة الطرفية إلى أسيتيل (Ac) مجموعة و C-المحطة الطرفية إلى مجموعة أميد.
   6. تميز الببتيد لنقاوته باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) وللكتلة باستخدام مطياف الكتلة.
2. لدراسة أهمية الأحماض الأمينية المحددة داخل جزيء PAMP-12 الأم، اتبع الخطوات أدناه.
   1. توليد مكتبة الببتيد ألانين المسح الضوئي عن طريق استبدال بقايا الأحماض الأمينية المعنية في جزيء الببتيد مع ألانين، واحد في وقت واحد باستخدام SPPS. تعديل N-المحطة الطرفية إلى أسيتيل (Ac) مجموعة و C-المحطة الطرفية إلى مجموعة أميد.
   2. تميز الببتيد لنقاوته باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) وللكتلة باستخدام مطياف الكتلة.
      ملاحظة: تأكد من أن الببتيدات المركبة هي من نقاء عالية. تميز الببتيدات باستخدام التحليل الطيفي الشامل وHPLC.

2. في ثقافة الخلية المختبر

1. الثقافة HEK-X2 وخلايا HEK-WT باتباع الخطوات أدناه.
   1. إعداد الثقافة المتوسطة عن طريق استكمال DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، 100 U/mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستريبتومايسين.
   2. مرور الخلايا في زراعة الأنسجة (TC) تعامل T-75 قوارير الثقافة وتنمو في حاضنة في 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO_2،حتى أنها التقاء 75-80٪.
   3. مرة واحدة التقاء 75٪، وغسل الخلايا وإضافة 2-3 مل من تريبسين لمدة 2-3 دقائق. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO₂ لفصل الخلايا.
   4. بمجرد انفصال الخلايا، اجمع الخلايا في التريبسين. إضافة 6-9 مل من المتوسطة الطازجة.
   5. الطرد المركزي الخلايا في 1620 × ز لمدة 3-5 دقائق.
   6. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant لجمع بيليه. إعادة إنفاق الخلايا في وسط ثقافة جديدة. تمييع الخلايا وفقا للتركيز المطلوب.
      ملاحظة: خلايا HEK هي خلايا سريعة النمو وبالتالي تحسين المكملات الخلية المتوسطة. خلايا HEK هي خلايا معتنقة; تمريرها في قوارير الثقافة المعالجة ب TC لدعم التصاق.
2. إعداد لوحة 96 جيدا المقايسة للتجربة.
   1. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر، مع تركيز 200،000 خلية / مل، إلى البذور 40،000 خلية / جيدا.
   2. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO_2.
      ملاحظة: تحسين كثافة الخلية لكل بئر استنادا إلى حجم اللوحة ونوع سلالة الخلية. إجراء التجربة في ثلاثية في لوحة سوداء TC المعالجة 96 جيدا مع أسفل شفافة مسطحة.

3. Fura-2 AM فحص الكالسيوم

1. إعداد صبغ باتباع الخطوات أدناه.
   1. استخدام Fura-2 AM صبغة للتجربة.
   2. إعداد العازلة HEPES-التيرود (HTB) العازلة التي تحتوي على 25 mM HEPES العازلة، 120 mM NaCl، 5 MM KCl، 1 ملغ / مل الجلوكوز، 1 ملغ / مل ألبوم مصل البقري (BSA) وأضاف حديثا 1.8 mM CaCl₂ في الماء المعقم الأوتوكلاف.
   3. إضافة 50 ميكرولتر من DMSO في 50 ميكروغرام Fura-2 AM قارورة لإعداد 1 mM الأسهم حل من Fura-2 AM صبغ. إضافة 1 ميكرولتر من 1 م فورا-2 AM صبغ لكل مل من المتوسطة الطازجة لإعداد متوسط تحميل صبغ وجود تركيز صبغة 1 ميكرومتر.
   4. إزالة لوحة البئر 96 من الحاضنة والتخلص من المتوسطة. استبدال المتوسطة مع صبغة جديدة تحميل المتوسطة. إضافة 200 ميكرولتر من صبغة تحميل المتوسطة في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 30-40 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO_{2 .}
   5. بعد 40 دقيقة من الحضانة، قم بإزالة الوسط. اغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت HTB. أضف 100 ميكرولتر من العازلة HTB للقراءة الفلورية. خذ الطبق للقراءة الفلورية.
      ملاحظة: تحسين تركيز الصبغة في متوسط تحميل الصبغة. تسرب صبغ وphotobleaching هي المخاوف المحتملة المرتبطة الصبغة. إضافة CaCl₂ جديدة في المخزن المؤقت HTB لتجنب هطول الأمطار.

4. تنشيط الخلية والقراءة الفلورية

ملاحظة: يسمح قارئ لوحة فلورسينس مع نظام ماسورة الآلي لنقل تلقائي للمركبات من مصدر مركب إلى لوحة المقايسة دون أخذ لوحة من قارئ لوحة.

1. بينما يتم احتضان الخلايا، تعيين قارئ لوحة.
   1. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
   2. في الإعدادات، حدد فليكس.
   3. تعيين وضع القراءة إلى الفلورسينس و قراءة القاع.
   4. في الأطوال الموجية، حدد عدد الأطوال الموجية إلى 2. تعيين الإثارة إلى 340 نانومتر و 380 نانومتر. تعيين الانبعاثات إلى 510 نانومتر.
   5. اترك الحساسية إلى الافتراضي.
   6. في التوقيت، قم بتعيين الفاصل الزمني إلى 3.9 ثانية. تعيين وقت التشغيل إلى 94 s للحصول على 25 يقرأ.
   7. بعد ذلك، حدد نوع لوحة المقايسة.
   8. بعد ذلك، حدد ويلز للقراءة.
   9. في نقل المركب، تعيين التحويلات إلى 1 وحجم الأولية إلى 100 μL. تعيين ارتفاع ماصة إلى 100 ميكرولتر، وحجم إلى 50 ميكرولتر، ونقطة زمنية إلى 36 ثانية، لإضافة المركب في القراءة 10.
   10. بعد ذلك، حدد نوع لوحة المصدر المركب.
   11. ترك تريتورات إلى غير مستخدم.
   12. حدد التلميحات في تخطيط تلميحات ماصة.
   13. بالنسبة للأعمدة المركبة والأعمدة الرأسية،تأكد من أن المركبات المراد نقلها موجودة في العمود 1 من لوحة المركب. تعيين العمود تلميح إلى 1 والعمود المركب إلى 1.
   14. اترك المعايرة التلقائية على أنها ON.
   15. انقر فوق موافق.
2. عندما تصل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، قم بتحميل اللوحات في قارئ اللوحة.
   1. اضغط على غرفة القراءة لوضع لوحة المقايسة في قارئ لوحةمضان .
   2. اضغط على المصدر لوضع لوحة المركب. إعداد لوحة مركب بإضافة 200 ميكرولتر من الببتيدات ذات الصلة، أيونوميسين وإيثيلين غليكول بيس (β أمينوثيل الأثير)-N،N،N′،N′-حمض رباعي الأرجل (EGTA)-تريتون X-100 الحلول.
   3. اضغط على حامل البقشيش لوضع صندوق البقشيش. استخدام طرف أسود لتجنب الفلورة التلقائية تلميح.
   4. بمجرد تحميل لوحات، ومراجعة إعدادات البرنامج واضغط على قراءة.

5. تحليل البيانات

1. تحديد تركيز الكالسيوم من نسبة الفلورسينس بواسطة معادلة غرينكيفيتش -
   
   حيث، K_D هو ثابت التفكك من Fura-2 AM، R هو نسبة الانبعاثات بعد الإثارة في 340 نانومتر و 380 نانومتر (F340/F380) للببتيدات المعنية، R_max هو الحد الأقصى لنسبة الفلورسينس التي لوحظت بإضافة 50 ميكرولتر من 30 ميكرومتر أيونوميسين، R_min هو الحد الأدنى للفلورسينس الذي لوحظ بإضافة 50 ميكرولتر من 100 mM EGTA/2.5٪ تريتون X-100، وF380_دقيقة وF380_ماكس هي كثافة مضان المطلقة من Fura-2 AM في حالة خالية من الكالسيوم وملزمة، على التوالي.
   ملاحظة: الجهاز يوزع السائل مع بعض القوة. لا تقم بتعيين ارتفاع الاستغناء الببتيد قريبة جدا من الجزء السفلي من لوحة; قد يفصل الخلايا. استخدام نصائح ماصة سوداء لتجنب autofluorescence. اقرأ أقصى مضان والحد الأدنى من الفلورسين لكل لوحة لكل تجربة.

النتائج

يحتوي الجدول 1 على تسلسل الببتيد المتولد من خلال اقتطاع الأحماض الأمينية الطرفية ومسح ألانين. كما هو مبين في الجدول 1، تسلسل الببتيد RKKWNKWALSR يفتقر إلى N-محطة phenylalanine (F) فيما يتعلق الأم PAMP-12، وبالتالي هو الببتيد ممثل في مكتبة ن مبتورة. وبالمثل، في FRKKWNKWALS، تمت إزالة PAMP-12 C-terminal se...

Discussion

إشارات الكالسيوم أمر مركزي ل degranulation الخلايا الصاري، وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسة التفاعلات مستقبلات ليغاند, تحديد ligand, واكتشاف المخدرات¹⁴. MRGPRX2 هو مستقبلات الخلايا الصاري المكتشفة مؤخرا التي تم العثور عليها للعب دور رئيسي في العديد من الأمراض الالتهابية مثل الحكة والرب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704