Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées

Résumé

Les techniques de génération d’une bibliothèque de peptides courts pouvant activer les mastocytes via le récepteur MRGPRX2 sont décrites. Les techniques associées sont faciles, peu coûteuses et peuvent être étendues à d’autres récepteurs cellulaires.

Résumé

L’identification de ligands spécifiques aux récepteurs cellulaires d’importance thérapeutique est cruciale pour de nombreuses applications, y compris la conception et le développement de nouveaux traitements. Le récepteur X2 de la protéine G lié au Mas (MRGPRX2) est un récepteur important qui régule l’activation des mastocytes et, par conséquent, dirige la réponse immunitaire générale. De nombreux ligands pour MRGPRX2 ont été identifiés et comprennent des peptides endogènes comme les PAMPs, les défensines, le LL-37 et d’autres fragments de protéines (c.-à-d. l’albumine dégradée). Une identification plus poussée des ligands spécifiques à MRGPRX2 nécessite le dépistage d’un grand nombre de peptides (c.-à-d. bibliothèque de peptides); cependant, les mastocytes sont difficiles et coûteux à entretenir in vitro et, par conséquent, pas économiques à utiliser pour le criblage d’un grand nombre de molécules. Le présent article démontre une méthode pour concevoir, développer et filtrer une bibliothèque de petites molécules peptidiques utilisant des cellules HEK exprimant MRGPRX2. Cette lignée cellulaire est relativement facile et peu coûteuse à entretenir et peut être utilisée pour l’analyse in vitro à haut débit. Un colorant fluorescent Fura-2 sensible au calcium pour marquer le flux de calcium intracellulaire lors de l’activation a été utilisé pour surveiller l’activation. Le rapport entre l’intensité de fluorescence de Fura-2 à 510 nm et les longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm a été utilisé pour calculer la concentration en calcium. La bibliothèque peptidique utilisée pour vérifier ce système était basée sur le sécréagogue endogène de la proadrénomédiline N-terminale 12 (PAMP-12), connu pour se lier à MRGPRX2 avec une spécificité et une affinité élevées. Les peptides suivants ont été générés par troncature d’acides aminés et techniques de balayage de l’alanine appliquées à PAMP-12. La méthode décrite ici est simple et peu coûteuse mais robuste pour le criblage d’une grande bibliothèque de composés afin d’identifier les domaines de liaison et d’autres paramètres importants qui jouent un rôle important dans l’activation des récepteurs.

Introduction

Les mastocytes font partie intégrante du système immunitaire et jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les mastocytes sont principalement activés soit par la liaison d’un antigène au complexe de récepteurs immunoglobuline E (IgE) - FcεRI, soit par le récepteur X2 de la protéine G (MRGPRX2)récemment découvert. L’activation de MRGPRX2 a été liée à plusieurs maladies immunitaires et inflammatoires, et par conséquent, il est important de comprendre le mécanisme de liaison du récepteur à ses ligands². Pour ce faire, une bibliothèque de petites molécules peptidiques a été développée et filtrée contre les récepteurs MRGPRX2 qui étaient surexprimés dans les cellules HEK. Dans l’étude, la bibliothèque de peptides a été construite en utilisant les techniques simples et polyvalentes de balayage de l’alanine et de troncature d’acides aminés. Le balayage de l’alanine consiste à remplacer des acides aminés spécifiques par un résidu d’alanine. L’alanine étant petite et neutre, dépouille le peptide des propriétés spécifiques conférées par le résidu remplacé et souligne consécutivement l’importance des propriétés physiochimiques respectives de l’acide aminé dans les interactions avec les récepteurs. Au contraire, dans la troncature d’acides aminés, les séquences peptidiques sont conçues de telle sorte qu’il manque un ou plusieurs résidus d’acides aminés du terminal N, du terminal C ou des deux. Cet ensemble de peptides a été utilisé pour identifier les séquences d’acides aminés cruciales pour la liaison MRGPRX2.

L’expérience avec les lignées de mastocytes humains (LAD-2) a montré que ces cellules sont difficiles à mettre en culture et à maintenir in vitro: un temps de doublement de deux semaines, des suppléments de milieu coûteux, et une attention directe requise lors du passage^3. Ces attributs rendent les cellules impropres au dépistage à grande échelle de ligands potentiels. Ici, des cellules HEK transfectées de manière stable exprimant le récepteur MRGPRX2 (HEK-X2) ont été utilisées pour filtrer la bibliothèque peptidique¹. Les cellules HEK-293 sont largement utilisées et étudiées pour l’expression hétérologue des récepteurs de surface en raison de leur efficacité de transfection élevée, de leur taux de doublement plus rapide et de la nécessité de mettre en culture des suppléments de milieu non coûteux en laboratoire^4. Le protocole de transfecter la lignée cellulaire HEK-293 a été démontré et est bien établi⁵. Les cellules HEK-293 exprimant de manière stable le récepteur MRGPRX2 (passage 13-19) ont été activées avec les peptides générés par N-troncature, C-troncature, N+C-troncature et balayage de l’alanine^1. Des cellules HEK de type sauvage (HEK-WT) (passage 16-21) ont été utilisées comme témoins. La libération intracellulaire de calcium lors de l’activation a été surveillée pour étudier l’activation basée sur MRGPRX2.

L’activation cellulaire par MRGPRX2 est suivie d’une mobilisation cytosolique du calcium. Cette libération intracellulaire régulée de calcium dans les mastocytes est régulée par l’entrée de calcium opérée par le magasin (SOCE), coordonnée par la molécule d’interaction stromale 1 (STIM1); et est au cœur de la cascade de réponse immunitaire^6,7. Diverses méthodes ont été utilisées pour détecter la concentration intracellulaire de calcium, y compris les patch-clamps et les colorants fluorescents⁸. De toutes les techniques disponibles, les colorants calciques fluorométriques en conjugaison avec diverses techniques de détection sont largement utilisés⁹. Deux types de colorants fluorométriques qui ont gagné en intérêt sont, à savoir, les colorants à longueur d’onde unique comme Fluo-4 et les colorants ratiométriques à double longueur d’onde comme Indo-1 et Fura-2. L’avantage que les colorants ratiométriques à double longueur d’onde apportent par rapport aux colorants à longueur d’onde unique est que les colorants ratiométriques corrigent les erreurs expérimentales telles que le chargement des colorants, le photo-blanchiment et la mise au point^10,11.

L’ester acétoxyméthylé de Fura-2 (Fura-2 AM) est un colorant fluorescent vert imprégné de cellules dont l’excitation se déplace vers une longueur d’onde inférieure lors de la liaison au calcium. Expérimentalement, Fura-2 est excité à 340 et 380 nm, tandis que l’émission est enregistrée à 510 nm. Lors de la liaison au calcium, l’intensité fluorescente à 340 nm augmente tandis que celle de 380 nm diminue, comme le montre la figure 1. Les données sont représentées sous la forme d’un rapport entre l’intensité de fluorescence après excitation à 340 nm (F340) et celle de l’intensité après excitation à 380 nm (F380), c’est-à-dire F340/F380. Le rapport F340/F380 est proportionnel au calcium intracellulaire, dont la valeur peut être calculée par l’équation de Grynkiewicz¹². Étant donné que le signal de fluorescence est obtenu à partir de l’excitation du colorant à deux longueurs d’onde (340 nm et 380 nm), le rapport des signaux de fluorescence corrige les facteurs expérimentaux tels que la charge en colorant, les fuites de colorant, le photomélancage et les densités cellulaires.

Protocole

1. Conception et développement d’une bibliothèque de peptides

1. Pour identifier les ligands du récepteur MRGPRX2 des mastocytes à base d’un ligand connu, c’est-à-dire PAMP-12^13,suivez les étapes ci-dessous.
   1. Générer une bibliothèque de peptides N-tronqués en tronquant successivement les résidus d’acides aminés N-terminaux du ligand par synthèse peptidique en phase solide (SPPS).
   2. Générer une bibliothèque de peptides tronqués C en tronquant successivement les résidus d’acides aminés C-terminal du ligand connu, successivement.
   3. Sur la base des résultats des 1.1.1 et 1.1.2, générez une bibliothèque de peptides tronqués N+ C à l’aide de SPPS en tronquant les résidus souhaités du N et du C-terminal, respectivement.
   4. Utilisez la synthèse peptidique en phase solide pour synthétiser les peptides¹³.
   5. Modifier le groupe N-terminal en acétyle (Ac) et le groupe C-terminal en groupe amide.
   6. Caractériser le peptide pour sa pureté par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) et pour la masse à l’aide d’un spectrophotomètre de masse.
2. Pour étudier l’importance d’acides aminés spécifiques dans la molécule PAMP-12 mère, suivez les étapes ci-dessous.
   1. Générez une bibliothèque de peptides à balayage de l’alanine en remplaçant les résidus d’acides aminés respectifs dans la molécule peptidique par de l’alanine, un à la fois en utilisant SPPS. Modifier le groupe N-terminal en acétyle (Ac) et le groupe C-terminal en groupe amide.
   2. Caractériser le peptide pour sa pureté par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) et pour la masse à l’aide d’un spectrophotomètre de masse.
      REMARQUE: Assurez-vous que les peptides synthétisés sont de haute pureté. Caractériser les peptides à l’aide de la spectroscopie de masse et de la CLHP.

2. Culture cellulaire in vitro

1. Culturez les cellules HEK-X2 et HEK-WT en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Préparer le milieu de culture en complétant le DMEM à haute teneur en glucose avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
   2. Passer les cellules dans des flacons de culture T-75 traités en culture tissulaire (TC) et croître dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO_2,jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 75-80%.
   3. Une fois confluent à 75%, lavez les cellules et ajoutez 2-3 mL de trypsine pendant 2 à 3 min. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pour détacher les cellules.
   4. Une fois que les cellules se sont détachées, collectez les cellules dans la trypsine. Ajouter 6-9 mL de milieu frais.
   5. Centrifuger les cellules à 1620 x g pendant 3-5 min.
   6. Après centrifugation, jeter le surnageant pour recueillir la pastille. Resuspendez les cellules dans un milieu de culture frais. Diluer les cellules selon la concentration souhaitée.
      REMARQUE: Les cellules HEK sont des cellules à croissance rapide et optimisent donc les suppléments de milieu cellulaire. Les cellules HEK sont des cellules adhérentes; les passer dans des flacons de culture traités par TC pour soutenir l’adhérence.
2. Préparez une plaque d’essai de 96 puits pour l’expérience.
   1. Ajouter 200 μL de suspension cellulaire dans chaque puits, avec une concentration de 200 000 cellules/mL, pour ensemencer 40 000 cellules/puits.
   2. Cultivez les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO_2.
      REMARQUE: Optimisez la densité cellulaire par puits en fonction de la taille de la plaque et du type de souche cellulaire. Effectuez l’expérience en trois exemplaires dans une plaque de puits 96 noire traitée par TC avec un fond plat transparent.

3. Dosage du calcium Fura-2 AM

1. Préparez le colorant en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Utilisez le colorant Fura-2 AM pour l’expérience.
   2. Préparer le tampon HEPES-Tyrode (HTB) contenant 25 mM de tampon HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mg/mL de glucose, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1,8 mM de_CaCl2 fraîchement ajouté dans de l’eau stérilisée en autoclave.
   3. Ajouter 50 μL de DMSO dans un flacon de 50 μg de Fura-2 AM pour préparer une solution mère de 1 mM de colorant Fura-2 AM. Ajouter 1 μL de colorant Fura-2 AM de 1 mM par mL de milieu frais pour préparer le milieu de chargement du colorant ayant une concentration de colorant de 1 μM.
   4. Retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et jetez le milieu. Remplacez le milieu par un milieu de chargement de colorant frais. Ajouter 200 μL de milieu de chargement de colorant dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 30-40 min dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO_2.
   5. Après 40 min d’incubation, retirer le milieu. Lavez les cellules avec le tampon HTB. Ajouter 100 μL de tampon HTB pour la lecture de fluorescence. Prenez la plaque pour la lecture de fluorescence.
      REMARQUE: Optimiser la concentration de colorant dans le milieu de chargement du colorant. Les fuites de colorant et le photobleachage sont des préoccupations possibles associées au colorant. Ajouter caCl₂ frais dans le tampon HTB pour éviter les précipitations.

4. Activation cellulaire et lecture fluorescente

REMARQUE: Le lecteur de plaques de fluorescence avec un système de pipetage automatisé permet le transfert automatique de composés d’une source de composés à la plaque d’essai sans retirer la plaque du lecteur de plaques.

1. Pendant l’incubage des cellules, réglez le lecteur de plaques.
   1. Réglez la température sur 37 °C.
   2. Dans Paramètres, sélectionnez Flex.
   3. Réglez le mode de lecture sur Fluorescence et Lecture inférieure.
   4. Dans Longueurs d’onde, définissez le nombre de longueurs d’onde sur 2. Réglez l’excitation sur 340 nm et 380 nm. Réglez l’émission sur 510 nm.
   5. Laissez la sensibilité à valeur par défaut.
   6. Dans Timing, définissez l’intervalle sur 3,9 s. Définissez le temps d’exécution sur 94 s pour obtenir 25 lectures.
   7. Ensuite, sélectionnez le type de plaque d’essai.
   8. Ensuite, sélectionnez les puits à lire.
   9. Dans Transfert de composé, réglez Transferts à 1 et Volume initial à 100 μL. Réglez la hauteur de la pipette à 100 μL, le volume à 50 μL et le point temporel à 36 s, pour ajouter le composé à la 10e lecture.
   10. Ensuite, sélectionnez le type de plaque Source composée.
   11. Laisser Triturate à Non utilisé.
   12. Sélectionnez les embouts dans la disposition des embouts de pipette.
   13. Pour les colonnes composées et tips,assurez-vous que les composés à transférer se trouvent dans la colonne 1 de la plaque composée. Définissez la colonne De pointe sur 1 et La Colonne composée sur 1.
   14. Laissez le calibrez automatique sur ON.
   15. Cliquez sur OK.
2. Lorsque la température a atteint 37 °C, chargez les plaques dans le lecteur de plaques.
   1. Appuyez sur la chambre de lecture pour placer la plaque d’essai dans le lecteur de plaque defluorescence.
   2. Appuyez sur la source pour placer la plaque composée. Préparer la plaque composée en ajoutant 200 μL de peptides respectifs, d’ionomycine et de solutions d’acide éthylène glycol-bis(β-aminoéthylique)-N,N′,N′-tétraacétique (EGTA)-Triton X-100.
   3. Appuyez sur le porte-embouts pour placer la boîte à pourboires. Utilisez une pointe noire pour éviter l’autofluorescence de la pointe.
   4. Une fois les plaques chargées, passez en revue les paramètres du logiciel et appuyezsur Lire .

5. Analyse des données

1. Déterminer la concentration de calcium à partir du rapport de fluorescence par l’équation de Grynkiewicz -
   
   où, K_d est la constante de dissociation de Fura-2 AM, R est le rapport d’émission après excitation à 340 nm et 380 nm (F340/F380) pour les peptides respectifs, R_max est le rapport de fluorescence maximal observé par l’addition de 50 μL de 30 μM d’ionomycine, R_min est la fluorescence minimale observée par l’addition de 50 μL de 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100, et F380_min et F380_max sont l’intensité de fluorescence absolue de Fura-2 AM à l’état libre de calcium et lié, respectivement.
   REMARQUE: La machine distribue le liquide avec une certaine force. Ne fixez pas la hauteur de distribution du peptide trop près du bas de la plaque; il peut détacher les cellules. Utilisez des embouts de pipette noirs pour éviter l’autofluorescence. Lisez la fluorescence maximale et la fluorescence minimale pour chaque plaque pour chaque expérience.

Résultats

Le tableau 1 contient les séquences peptidiques générées par troncature d’acides aminés terminaux et balayage de l’alanine. Comme le montre le tableau 1,la séquence peptidique RKKWNKWALSR manque de phénylalanine N-terminale (F) par rapport à son parent PAMP-12 et est donc un peptide représentatif dans la bibliothèque N-tronquée. De même, dans FRKKWNKWALS, la sérine C-terminalE PAMP-12 a été éliminée, représentant une bibliothèque peptidique tronquée C dérivée de...

Discussion

La signalisation du calcium est au cœur de la dégranulation des mastocytes et a été largement utilisée dans l’étude des interactions récepteur-ligand, l’identification des ligands et la découverte de médicaments^14. MRGPRX2 est un récepteur de mastocytes récemment découvert qui s’est avéré jouer un rôle clé dans de nombreuses maladies inflammatoires comme les démangeaisons, l’asthme et la dermatite atopique, entre autres². En outre, il a été démon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704