Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток

Резюме

Описаны методы генерации библиотеки коротких пептидов, которые могут активировать тучные клетки через рецептор MRGPRX2. Связанные методы просты, недороги и могут быть распространены на другие клеточные рецепторы.

Аннотация

Идентификация лигандов, специфичных для терапевтически значимых клеточных рецепторов, имеет решающее значение для многих применений, включая проектирование и разработку новых терапевтических средств. Связанный с Mas рецептор G-белка-X2 (MRGPRX2) является важным рецептором, который регулирует активацию тучных клеток и, таким образом, направляет общий иммунный ответ. Многочисленные лиганды для MRGPRX2 были идентифицированы и включают эндогенные пептиды, такие как PAMP, defensins, LL-37 и другие фрагменты белка (т.е. деградированный альбумин). Дальнейшая идентификация специфических лигандов MRGPRX2 требует скрининга большого количества пептидов (т.е. пептидной библиотеки); однако тучные клетки трудно и дорого поддерживать in vitro и, следовательно, не экономично использовать для скрининга большого количества молекул. В настоящей статье демонстрируется способ проектирования, разработки и экранирования библиотеки небольших пептидных молекул с использованием MRGPRX2, экспрессивных HEK-клеток. Эта клеточная линия относительно проста и недорога в обслуживании и может быть использована для высокопроизводительного анализа in vitro. Чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель Fura-2 для маркировки внутриклеточного потока кальция при активации использовался для мониторинга активации. Для расчета концентрации кальция использовалось отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при 510 нм к длинам волн возбуждения 340 и 380 нм. Пептидная библиотека, используемая для проверки этой системы, была основана на секретагоге эндогенного проадреномедуллина N-терминала 12 (PAMP-12), который, как известно, связывает MRGPRX2 с высокой специфичностью и аффинностью. Последующие пептиды были получены с помощью методов усечения аминокислот и аланина, примененных к PAMP-12. Метод, описанный здесь, прост и недорог, но при этом надежен для скрининга большой библиотеки соединений для идентификации связующих доменов и других важных параметров, которые играют важную роль в активации рецепторов.

Введение

Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки в основном активируются либо связыванием антигена с иммуноглобулином E (IgE) - рецепторным комплексом FcεRI, либо недавно обнаруженным mas-родственным рецептором G-белка-X2 (MRGPRX2)^1. Активация MRGPRX2 была связана с несколькими иммунными и воспалительными заболеваниями, и, следовательно, важно понимать механизм связывания рецептора с его лигандами^2. Для этого была разработана библиотека небольших пептидных молекул, которые были экранированы против рецепторов MRGPRX2....

протокол

1. Проектирование и разработка библиотеки пептидов

1. Чтобы идентифицировать лиганды рецептора MRGPRX2 тучных клеток на основе известного лиганда, т.е. PAMP-12^13,выполните следующие действия.
   1. Генерация N-усеченной пептидной библиотеки путем усечения N-концевых аминокислотных остатков лиганда последовательно путем синтеза твердофазных пептидов (SPPS).
   2. Генерация библиотеки С-усеченных пептидов путем усечения С-концевые аминокислотные остатки известного лиганда последовательно с помощью SPPS.
   3. Основываясь на результатах 1.1.1 и 1.1.2, генерируйте N+C-усеченную пептидную библиотеку с использовани....

Результаты

Таблица 1 содержит пептидные последовательности, генерируемые путем терминального усечения аминокислот и сканирования аланина. Как показано в таблице 1, пептиднаяпоследовательность RKKWNKWALSR не содержит N-концевой фенилаланин (F) по отношению к своему родительскому PAMP-12.......

Обсуждение

Передача сигналов кальция занимает центральное место в дегрануляции тучных клеток и широко используется в изучении взаимодействий рецептор-лиганд, идентификации лигандов и открытии лекарств^14. MRGPRX2 является недавно обнаруженным рецептором тучных клеток, который, как был?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704