Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

Resumen

Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.

Resumen

La identificación de ligandos específicos para receptores celulares terapéuticamente significativos es crucial para muchas aplicaciones, incluido el diseño y desarrollo de nuevas terapias. Mas relacionado con el receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) es un receptor importante que regula la activación de los mastocitos y, por lo tanto, dirige la respuesta inmune general. Se han identificado numerosos ligandos para MRGPRX2 e incluyen péptidos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 y otros fragmentos de proteínas (es decir, albúmina degradada). La identificación adicional de ligandos específicos de MRGPRX2 requiere la detección de un gran número de péptidos (es decir, biblioteca de péptidos); sin embargo, los mastocitos son difíciles y costosos de mantener in vitro y, por lo tanto, no son económicos de usar para el cribado de un gran número de moléculas. El presente artículo demuestra un método para diseñar, desarrollar y examinar una biblioteca de moléculas peptídicas pequeñas utilizando células HEK que expresan MRGPRX2. Esta línea celular es relativamente fácil y económica de mantener y se puede utilizar para el análisis in vitro de alto rendimiento. Se utilizó un colorante fluorescente Fura-2 sensible al calcio para marcar el flujo de calcio intracelular tras la activación para monitorear la activación. Para calcular la concentración de calcio se utilizó la relación entre la intensidad de fluorescencia de Fura-2 a 510 nm frente a longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm. La biblioteca de péptidos utilizada para verificar este sistema se basó en el secretagogo endógeno proadrenomedulina N-terminal 12 (PAMP-12), que se sabe que se une a MRGPRX2 con alta especificidad y afinidad. Los péptidos posteriores se generaron a través de técnicas de truncamiento de aminoácidos y escaneo de alanina aplicadas a PAMP-12. El método descrito aquí es simple y económico pero robusto para la detección de una gran biblioteca de compuestos para identificar dominios de unión y otros parámetros importantes que juegan un papel importante en la activación del receptor.

Introducción

Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos se activan principalmente por la unión de un antígeno al complejo receptor de inmunoglobulina E (IgE) - FcεRI, o por el recientemente descubierto receptor de proteína G relacionado con mas-X2 (MRGPRX2)¹. La activación de MRGPRX2 se ha relacionado con varias enfermedades inmunes e inflamatorias, y por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión del receptor a sus ligandos². Para hacerlo, se desarrolló una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas y se cribó contra los receptores MRGPRX2 que estaban sobreexpresados en las células HEK. En el estudio, la biblioteca de péptidos se construyó utilizando las técnicas simples y versátiles de escaneo de alanina y truncamiento de aminoácidos. La exploración con alanina implica reemplazar aminoácidos específicos con un residuo de alanina. La alanina es pequeña y neutra, despoja al péptido de las propiedades específicas conferidas por el residuo reemplazado y resalta consecutivamente la importancia de las respectivas propiedades fisicoquímicas del aminoácido en las interacciones receptoras. Por el contrario, en el truncamiento de aminoácidos, las secuencias peptídicas están diseñadas de tal manera que carecen de uno o más residuos de aminoácidos del terminal N, terminal C o ambos. Este conjunto de péptidos se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos cruciales para la unión a MRGPRX2.

La experiencia con líneas de mastocitos humanos (LAD-2) ha demostrado que estas células son difíciles de cultivar y mantener in vitro:un tiempo de duplicación de dos semanas, costosos suplementos medios y atención directa requerida durante el paso³. Estos atributos hacen que las células no sean adecuadas para el cribado a gran escala de ligandos potenciales. Aquí, se utilizaron células HEK transfectadas de manera estable que expresan el receptor MRGPRX2 (HEK-X2) para examinar la biblioteca de péptidos¹. Las células HEK-293 son ampliamente utilizadas y estudiadas para la expresión heteróloga de receptores de superficie debido a su alta eficiencia de transfección, tasa de duplicación más rápida y la necesidad de que se culticen suplementos medios no costosos en laboratorio⁴. El protocolo para transfectar la línea celular HEK-293 ha sido demostrado y está bien establecido⁵. Las células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor MRGPRX2 (paso 13-19) se activaron con los péptidos generados a través del N-truncamiento, C-truncamiento, N+C-truncamiento y escaneo de alanina¹. Se utilizaron células HEK de tipo salvaje (HEK-WT) (paso 16-21) como control. La liberación intracelular de calcio tras la activación fue monitoreada para estudiar la activación basada en MRGPRX2.

La activación celular por MRGPRX2 es seguida por una movilización de calcio citosólico. Esta liberación de calcio intracelular regulada en los mastocitos está regulada por la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), coordinada por la molécula de interacción estromal 1 (STIM1); y es central en la cascada de respuesta inmune^6,7. Se han utilizado varios métodos para detectar la concentración de calcio intracelular, incluyendo pinzas de parche y colorantes fluorescentes⁸. De todas las técnicas disponibles, los colorantes fluorométricos de calcio en conjugación con diversas técnicas de detección están siendo ampliamente utilizados⁹. Dos tipos de colorantes fluorométricos que han ganado interés son, a saber, los tintes de longitud de onda única como Fluo-4, y los tintes de relación de longitud de onda dual como Indo-1 y Fura-2. La ventaja que aportan los tintes ratiométricos de doble longitud de onda sobre los tintes de longitud de onda única es que los tintes ratiométricos corrigen errores experimentales como la carga del tinte, el fotoblanqueo y el enfoque^10,11.

El éster acetoximetílico fura-2 (Fura-2 AM) es un colorante verde-fluorescente penetrante en las células cuya excitación cambia a una longitud de onda más baja al unirse al calcio. Experimentalmente, Fura-2 se excita a 340 y 380 nm, mientras que la emisión se registra a 510 nm. Tras la unión al calcio, la intensidad fluorescente a 340 nm aumenta mientras que la de 380 nm disminuye, como se muestra en la Figura 1. Los datos se representan como una relación entre la intensidad de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la intensidad después de la excitación a 380 nm (F380), es decir, F340 / F380. La relación F340/F380 es proporcional al calcio intracelular, cuyo valor se puede calcular mediante la ecuación de Grynkiewicz¹². Dado que la señal de fluorescencia se obtiene de la excitación del tinte en dos longitudes de onda (340 nm y 380 nm), la relación de las señales de fluorescencia corrige factores experimentales como la carga del tinte, la fuga de tinte, el fotoblanqueo y las densidades celulares.

Protocolo

1. Diseño y desarrollo de la biblioteca de péptidos

1. Para identificar los ligandos del receptor MRGPRX2 de mastocitos basado en un ligando conocido, es decir, PAMP-12^13,siga los pasos a continuación.
   1. Generar una biblioteca de péptidos N-truncados truncando los residuos de aminoácidos N-terminales del ligando, sucesivamente, mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS).
   2. Generar la biblioteca de péptidos truncados C truncando los residuos de aminoácidos C-terminales del ligando conocido, en sucesión, por SPPS.
   3. Sobre la base de los resultados de 1.1.1 y 1.1.2, genere una biblioteca de péptidos truncados N + C utilizando SPPS truncando los residuos deseados del N y C-terminal, respectivamente.
   4. Utilice la síntesis de péptidos en fase sólida para sintetizar los péptidos¹³.
   5. Modifique el terminal N al grupo acetilo (Ac) y el terminal C al grupo amida.
   6. Caracterizar el péptido por su pureza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y por la masa mediante un espectrofotómetro de masas.
2. Para estudiar la importancia de aminoácidos específicos dentro de la molécula PAMP-12 madre, siga los pasos a continuación.
   1. Genere una biblioteca de péptidos de barrido de alanina reemplazando los respectivos residuos de aminoácidos en la molécula peptídica con alanina, uno a la vez utilizando SPPS. Modifique el terminal N al grupo acetilo (Ac) y el terminal C al grupo amida.
   2. Caracterizar el péptido por su pureza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y por la masa mediante un espectrofotómetro de masas.
      NOTA: Asegúrese de que los péptidos sintetizados sean de alta pureza. Caracterizar los péptidos mediante espectroscopia de masas y HPLC.

2. Cultivo celular in vitro

1. Culta células HEK-X2 y HEK-WT siguiendo los pasos a continuación.
   1. Preparar el medio de cultivo suplementando DMEM de glucosa alta con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Pasar las células en cultivo de tejidos (CT) tratado con matraces de cultivo T-75 y crecer en una incubadora a 37 °C que contiene 5% de CO_2,hasta que sean 75-80% confluentes.
   3. Una vez que el 75% sea confluente, lave las células y agregue 2-3 ml de tripsina durante 2 a 3 min. Incubar en una incubadora de 37 °C, 5% DE CO₂ para separar las células.
   4. Una vez que las células se hayan desprendido, recoja las células en tripsina. Añadir 6-9 mL de medio fresco.
   5. Centrifugar las células a 1620 x g durante 3-5 min.
   6. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante para recoger el pellet. Resuspend las células en un medio de cultivo fresco. Diluya las células según la concentración deseada.
      NOTA: Las células HEK son células de rápido crecimiento y, por lo tanto, optimizan los suplementos de medio celular. Las células HEK son células adherentes; pasarlos en matraces de cultivo tratados con CT para apoyar la adhesión.
2. Prepare una placa de ensayo de 96 pozos para el experimento.
   1. Añadir 200 μL de suspensión celular en cada pozo, con una concentración de 200.000 células/ml, para sembrar 40.000 células/pozo.
   2. Cultive las células durante 24 h en una incubadora de 37 °C, 5% de CO_2.
      NOTA: Optimice la densidad celular por pozo en función del tamaño de la placa y el tipo de cepa celular. Realice el experimento por triplicado en una placa negra de 96 pozos tratada con TC con fondo plano transparente.

3. Ensayo de calcio Fura-2 AM

1. Prepare el tinte siguiendo los pasos a continuación.
   1. Utilice el tinte Fura-2 AM para el experimento.
   2. Prepare el tampón tampón (HTB) de HEPES-Tyrode que contenga 25 mM de tampón HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mg/ml de glucosa, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y recién añadido 1,8 mM de CaCl₂ en agua esterilizada en autoclave.
   3. Añadir 50 μL de DMSO en un vial de 50 μg de Fura-2 AM para preparar una solución de 1 mM de colorante Fura-2 AM. Añadir 1 μL de colorante Fura-2 AM de 1 mM por ml de medio fresco para preparar el medio de carga de colorante con una concentración de colorante de 1 μM.
   4. Retire la placa de 96 pozos de la incubadora y deseche el medio. Reemplace el medio con un medio de carga de tinte fresco. Añadir 200 μL de medio de carga de colorante en cada pozo. Incubar las células durante 30-40 min en una incubadora de 37 °C, 5% CO_2.
   5. Después de 40 min de incubación, retire el medio. Lave las celdas con el tampón HTB. Agregue 100 μL de tampón HTB para la lectura de fluorescencia. Tome la placa para la lectura de fluorescencia.
      NOTA: Optimizar la concentración de colorante en el medio de carga del tinte. La fuga de tinte y el fotobleaching son posibles preocupaciones asociadas con el tinte. Agregue CaCl₂ fresco en el tampón HTB para evitar precipitaciones.

4. Activación celular y lectura fluorescente

NOTA: El lector de placas de fluorescencia con un sistema de pipeteo automatizado permite la transferencia automática de compuestos de una fuente compuesta a la placa de ensayo sin sacar la placa del lector de placas.

1. Mientras se incuban las células, configure el lector de placas.
   1. Ajuste la temperatura a 37 °C.
   2. En Configuración, seleccione Flex.
   3. Establezca el modo de lectura en Fluorescencia y Lectura inferior.
   4. En Longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en 2. Establezca la excitación en 340 nm y 380 nm. Establezca la emisión en 510 nm.
   5. Deje la sensibilidad al valor predeterminado.
   6. En Temporización, establezca el intervalo en 3,9 s. Establezca el tiempo de ejecución en 94 s para obtener 25 lecturas.
   7. A continuación, seleccione el Tipo de placa de ensayo.
   8. A continuación, seleccione los pozos para leer.
   9. En Transferencia de compuestos,establezca Transferencias a 1 y Volumen inicial a 100 μL. Establezca la altura de la pipeta en 100 μL, el volumen en 50 μL y el punto de tiempo en 36 s, para agregar el compuesto en la 10ª lectura.
   10. A continuación, seleccione el tipo de placa fuente compuesta.
   11. Dejar triturar a No usado.
   12. Seleccione las sugerencias en el Diseño de puntas de pipeta.
   13. Para las columnas compuestas y de punta,asegúrese de que los compuestos que se van a transferir se encuentran en la columna 1 de la placa compuesta. Establezca la columna de punta en 1 y la columna compuesta en 1.
   14. Deje el autocalibrado como ON.
   15. Haga clic en Aceptar.
2. Cuando la temperatura haya alcanzado los 37 °C, cargue las placas en el lector de placas.
   1. Presione la cámara de lectura para colocar la placa de ensayo en el lector de placas defluorescencia.
   2. Pulse la fuente para colocar la placa compuesta. Prepare la placa compuesta agregando 200 μL de péptidos respectivos, ionomicina y etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)-Tritón X-100 soluciones.
   3. Presione el bastidor de punta para colocar el cuadro de punta. Use una punta negra para evitar la autofluorescencia de la punta.
   4. Una vez cargadas las placas, revise la configuración del software y pulse Leer.

5. Análisis de datos

1. Determinar la concentración de calcio a partir de la relación de fluorescencia mediante la ecuación de Grynkiewicz -
   
   donde, K_d es la constante de disociación de Fura-2 AM, R es la relación de emisión después de la excitación a 340 nm y 380 nm (F340/F380) para los péptidos respectivos, R_max es la relación de fluorescencia máxima observada por la adición de 50 μL de ionomicina de 30 μM, R_min es la fluorescencia mínima observada por la adición de 50 μL de 100 mM EGTA/2.5%Triton X-100, y F380_min y F380_max son la intensidad de fluorescencia absoluta de Fura-2 AM en estado libre de calcio y unido, respectivamente.
   NOTA: La máquina dispensa el líquido con cierta fuerza. No ajuste la altura de dispensación del péptido demasiado cerca de la parte inferior de la placa; puede separar las células. Use puntas de pipeta negras para evitar la autofluorescencia. Lea la fluorescencia máxima y la fluorescencia mínima para cada placa para cada experimento.

Resultados

La Tabla 1 contiene las secuencias peptídicas generadas a través del truncamiento terminal de aminoácidos y el escaneo de alanina. Como se muestra en la Tabla 1,la secuencia peptídica RKKWNKWALSR carece de fenilalanina N-terminal (F) con respecto a su padre PAMP-12 y, por lo tanto, es un péptido representativo en la biblioteca N-truncada. Del mismo modo, en FRKKWNKWALS, se ha eliminado la serina C-terminal PAMP-12, lo que representa una biblioteca de péptidos truncados C derivada d...

Discusión

La señalización de calcio es fundamental para la degranulación de mastocitos y se ha utilizado ampliamente en el estudio de las interacciones receptor-ligando, la identificación de ligandos y el descubrimiento de fármacos¹⁴. MRGPRX2 es un receptor de mastocitos recientemente descubierto que se ha encontrado que desempeña un papel clave en muchas enfermedades inflamatorias como la picazón, el asma y la dermatitis atópica, entre otras². Además, se ha demostrado que v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704