הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

Summary

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

Abstract

זיהוי ליגנדים ספציפיים קולטני תאים משמעותיים מבחינה טיפולית הוא חיוני עבור יישומים רבים, כולל עיצוב ופיתוח של טיפולים חדשים. קולטן G-חלבון-X2 (MRGPRX2) הקשור ל-Mas הוא קולטן חשוב המווסת את הפעלת תאי התורן, ולכן מכוון את התגובה החיסונית הכללית. ליגנדים רבים עבור MRGPRX2 זוהו וכוללים פפטידים אנדוגניים כמו PAMPs, defensins, LL-37 ורסיסי חלבון אחרים (כלומר, אלבומין מושפל). זיהוי נוסף של ליגנדים ספציפיים MRGPRX2 דורש הקרנה של מספר רב של פפטידים (כלומר, ספריית פפטיד); עם זאת, תאי פיסט קשה ויקרים לתחזוקה במבחנה, ולכן, לא חסכוני להשתמש עבור הקרנת מספר גדול של מולקולות. המאמר הנוכחי מדגים שיטה לעיצוב, פיתוח ומסך של ספריה של מולקולות פפטיד קטנות באמצעות MRGPRX2 המבטאות תאי HEK. קו תא זה הוא קל יחסית וזול לתחזוקה וניתן להשתמש בו לניתוח תפוקה גבוהה במבחנה. צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Fura-2 לסימון שטף סידן תאי בעת ההפעלה שימש לניטור ההפעלה. היחס בין עוצמת הפלואורסצנטיות של Fura-2 ב 510 ננומטר נגד אורכי גל עירור של 340 ו 380 ננומטר שימש לחישוב ריכוז סידן. ספריית הפפטיד המשמשת לאימות מערכת זו התבססה על סוד ה- N-terminal 12 (PAMP-12) האנדוגני, הידוע כאגוגה של MRGPRX2 עם ספציפיות גבוהה וזיקה. פפטידים הבאים נוצרו באמצעות truncation חומצת אמינו וטכניקות סריקת אלנין להחיל PAMP-12. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וזולה אך חסון להקרנת ספרייה גדולה של תרכובות לזיהוי תחומים מחייבים ופרמטרים חשובים אחרים הממלאים תפקיד חשוב בהפעלת קולטן.

Introduction

תאי פיסט הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון וממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים בעיקר על ידי כריכת אנטיגן לאימונוגלובולין E (IgE) - קומפלקס קולטני FcεRI, או על ידי קולטן G-חלבון הקשור ל- G-X2 (MRGPRX2)^שהתגלהלאחרונה . הפעלת MRGPRX2 נקשרה למספר מחלות חיסוניות ודלקתיות, ולכן חשוב להבין את מנגנון המחייב של הקולטן לליגנדים²שלו . כדי לעשות זאת, ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות פותחה והוקרנה נגד קולטני MRGPRX2 שהתבטאו יתר על המידה בתאי HEK. במחקר, ספריית הפפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין וגזמת חומצות אמינו. סריקת אלנין כרוכה בהחלפת חומצות אמינו ספציפיות בשאריות אלנין. אלנין להיות קטן ונייטרלי, מפשיט את הפפטיד של המאפיינים הספציפיים שהוענקו על ידי שאריות מוחלף ברצף מדגיש את המשמעות של המאפיינים הפיזיוכימיים בהתאמה של חומצת האמינו באינטראקציות קולטן. להיפך, ב truncation חומצת אמינו, רצפי פפטיד מתוכננים כך שהוא חסר אחד או יותר שאריות חומצת אמינו מן מסוף N-terminal, C, או שניהם. קבוצה זו של פפטידים שימשה לזיהוי רצפי חומצות האמינו החיוניים לכריכת MRGPRX2.

ניסיון עם קווי תאי פיסט אנושיים (LAD-2) הראה כי תאים אלה קשים לתרבות ולשמור במבחנה: זמן הכפלה של שבועיים, תוספי מזון בינוניים יקרים, ותשומת לב ישירה הנדרשת במהלך passaging³. תכונות אלה הופכות את התאים ללא מתאימים להקרנה בקנה מידה גדול של ליגנדים פוטנציאליים. בזאת, תאי HEK מהודבקים בייצוב המבטאים קולטן MRGPRX2 (HEK-X2) שימשו להקרנת ספריית הפפטיד¹. תאי HEK-293 נמצאים בשימוש נרחב ונחקרים עבור הביטוי ההטרולוגי של קולטני פני השטח בשל יעילות ההדבקה הגבוהה שלהם, קצב הכפלה מהיר יותר, והצורך בתוספי מזון בינוניים לא יקרים להיות מתורבתים במעבדה⁴. הפרוטוקול כדי להעביר את קו התא HEK-293 הוכח והוא מבוסס היטב⁵. תאי HEK-293 המביעים ביציבות קולטן MRGPRX2 (מעבר 13-19) הופעלו עם הפפטידים שנוצרו באמצעות N-truncation, C-truncation, N + C-truncation, וסריקת אלנין¹. תאי HEK מסוג פראי (HEK-WT) (מעבר 16-21) שימשו כפקד. שחרור סידן תאי בעת ההפעלה היה במעקב כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת MRGPRX2.

הפעלת תאים על ידי MRGPRX2 מלווה בגיוס סידן ציטוטוסולי. שחרור סידן תאי מוסדר זה בתאי פיסט מוסדר על ידי הזנת סידן המופעלת על ידי החנות (SOCE), מתואם על ידי מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1); והוא מרכזי מפל התגובה החיסונית^6,7. שיטות שונות שימשו כדי לזהות ריכוז סידן תאי, כולל מהדקי תיקון וצבעים פלואורסצנטיים⁸. מכל הטכניקות הזמינות, צבעי סידן פלואורומטריים בהטיה עם טכניקות זיהוי שונות נמצאים בשימוש נרחב⁹. שני סוגים של צבעים פלואורומטריים שצברו תחומי עניין הם כלומר, צבעי אורך גל יחידים כמו Fluo-4, וצבעים רציאליים באורך גל כפול כמו Indo -1 ו Fura-2. היתרון שצבעים רציוניים אורך גל כפולים מביאים על צבעי אורך גל יחיד הוא שהצבעים היחסיים נכונים לטעויות ניסיוניות כמו טעינת צבע, הלבנת תמונות ומיקוד^10,11.

אצטטוקסימתיל אסתר (Fura-2 AM) הוא צבע מחלחל לירוק-פלואורסצנטי, אשר עירורו עובר לאורך גל נמוך יותר עם כריכת סידן. באופן ניסיוני, Fura-2 מתרגש ב 340 ו 380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב 510 ננומטר. לאחר כריכת הסידן, עוצמת הפלואורסצנט ב-340 ננומטר עולה בעוד זו של 380 ננומטר פוחתת, כפי שמוצג באיור 1. הנתונים מיוצגים כיחס של עוצמת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של עוצמה לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) כלומר, F340/F380. יחס F340/F380 הוא פרופורציונלי לסידן תאי, אשר הערך של אשר ניתן לחשב על ידי משוואת Grynkiewicz¹². מכיוון שאות הפלואורסצנטיות מתקבל מערעור הצבע בשני אורכי גל (340 ננומטר ו-380 ננומטר), היחס בין אותות הפלואורסצנטיות מתקן גורמים ניסיוניים כמו טעינת צבע, דליפת צבע, ליחתום תמונות וצפיפות תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. עיצוב ופיתוח של ספריית פפטיד

1. כדי לזהות את הליגנדים של קולטן MRGPRX2 של תא התורן בהתבסס על ליגנד ידוע כלומר, PAMP-12¹³, בצע את השלבים הבאים.
   1. צור ספריית פפטיד N-קטוע על ידי חיתוך שאריות חומצת האמינו N-terminal של ליגנד, ברצף, על ידי סינתזת פפטידים שלב מוצק (SPPS).
   2. צור ספריית פפטיד C-קיצר על ידי חיתוך שאריות חומצת אמינו C-מסוף של ליגנד ידוע, ברציפות, על ידי SPPS.
   3. בהתבסס על התוצאות של 1.1.1 ו- 1.1.2, צור ספריית פפטידים חתוכה N+C באמצעות SPPS על-ידי חיתוך השאריות הרצויות ממסוף N ו- C, בהתאמה.
   4. השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים¹³.
   5. שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.
   6. לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה.
2. כדי לחקור את המשמעות של חומצות אמינו ספציפיות בתוך מולקולת ה- PAMP-12 של האב, בצע את השלבים הבאים.
   1. צור ספריית פפטיד סריקת אלנין על ידי החלפת שאריות חומצת האמינו המתאימות במולקולת הפפטיד באלנין, אחת בכל פעם באמצעות SPPS. שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.
   2. לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה.
      הערה: ודא כי פפטידים מסונתזים הם של טוהר גבוה. אפיינו את הפפטידים באמצעות ספקטרוסקופיית מסה ו-HPLC.

2. בתרבית תאי במבחנה

1. תאי HEK-X2 ו- HEK-WT של תרבות על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.
   1. הכן את המדיום של תרבות על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה עם סרום בקר עוברי 10%(FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL של פניצילין ו 100 מיקרוגרם /mL של סטרפטומיצין.
   2. מעבר התאים בתרבית הרקמות (TC) טיפל T-75 תרבית בקבוקונים ולגדול באינקובטור ב 37 °C המכיל 5% CO₂, עד שהם 75-80% confluent.
   3. פעם 75% confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין במשך 2 - 3 דקות. דגירה באינקובטור 37 °C (5%), 5% CO₂ כדי לנתק את התאים.
   4. לאחר שהתאים מנותקים, לאסוף את התאים טריפסין. מוסיפים 6-9 מ"ל של מדיום טרי.
   5. צנטריפוגות התאים ב 1620 x גרם במשך 3-5 דקות.
   6. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי. לדלל את התאים לפי הריכוז הרצוי.
      הערה: תאי HEK הם תאים הגדלים במהירות ולכן למטב את תוספי התא בינוני. תאי HEK הם תאים חסידים; להעביר אותם בבקבוקי תרבות שטופלו TC כדי לתמוך בהידבקות.
2. הכינו צלחת 96 באר לניסוי.
   1. הוסף 200 μL של השעיית התא בכל באר, עם ריכוז של 200,000 תאים / מ"ל, לזרוע 40,000 תאים / טוב.
   2. לגדל את התאים עבור 24 שעות ב 37 °C (5°F), 5% CO₂ אינקובטור.
      הערה: מטב את צפיפות התא לבאר בהתבסס על גודל הצלחת וסוג המתח של התא. ערוך את הניסוי במשולשים בצלחת 96 שחורה שטופלו ב- TC עם תחתית שקופה שטוחה.

3. פיה-2 AM סידן

1. הכן צבע על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.
   1. השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי.
   2. הכן את מאגר החיץ (HTB) של HEPES-Tyrode המכיל 25 מ"מ חיץ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז, אלבומין סרום בקר מ"ג / מ"ל (BSA) ו- 1.8 מ"מ CaCl₂ במים מעוקרים אוטומטיים.
   3. הוסף 50 μL של DMSO ב 50 מיקרוגרם פורה-2 בבוקר בון כדי להכין פתרון מלאי 1 mM של צבע Fura-2 AM. הוסף 1 μL של 1 mM Fura-2 AM צבע לכל mL של מדיום טרי כדי להכין את מדיום טעינת צבע בעל ריכוז צבע 1μM.
   4. מוציאים את צלחת 96 היטב מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום טעינת צבע טרי. הוסף 200 μL של צבע טעינה בינוני בכל באר. לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 °C (5 °F), 5% CO₂ אינקובטור_.
   5. לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום. לשטוף את התאים עם מאגר HTB. הוסף 100 μL של מאגר HTB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות.
      הערה: מטב את ריכוז הצבע במדיום הטעינה של הצבע. דליפת צבע והלבנת תמונות הם חששות אפשריים הקשורים לצבע. הוסף CaCl₂ טרי למאגר HTB כדי למנוע משקעים.

4. הפעלת תאים וקריאה פלואורסצנטית

הערה: קורא לוחות פלואורסצנטיות עם מערכת צנרת אוטומטית מאפשר העברה אוטומטית של תרכובות ממקור מורכב לצלחת הבדיקה מבלי להוציא את הצלחת מקורא הלוחות.

1. בזמן שהתאים דוגרים, הגדר את קורא הלוחות.
   1. הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (7 °F).
   2. בהגדרות , בחר Flex.
   3. הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקראה התחתונה.
   4. באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל ל-2. הגדר את העירור ל- 340 ננומטר ו- 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר.
   5. השאר את הרגישות לברירת המחדל.
   6. בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר זמן ריצה ל- 94 s כדי לקבל 25 קריאות.
   7. לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.
   8. לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה.
   9. בהעברה מורכבת, הגדר העברות ל- 1 ונפח התחלתי ל- 100 μL. הגדר את גובה הפיפטה ל- 100 μL, אמצעי אחסון ל- 50 μL ונקודת זמן ל- 36 s, כדי להוסיף את המתחם בקריאה העשירית.
   10. לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב.
   11. השאר את Triturate ללא שימוש.
   12. בחר את העצות בפריסת עצות Pipette.
   13. עבור עמודות מורכבות ועמודות קצה, ודא שהתרכובות שיש להעביר נמצאות בעמודה 1 של הלוח המורכב. הגדר את עמודת העצות לעמודה 1 ולעמודה מורכבת ל- 1.
   14. השאר את הכיול האוטומטי כ- ON.
   15. לחץ על אישור.
2. כאשר הטמפרטורה הגיעה ל 37 °C (50 °F), לטעון את הצלחות לתוך קורא הלוחות.
   1. לחץ על תא הקריאה כדי להכניס את צלחת ה- Assay לקורא לוחותהפלואורסצנטיות .
   2. לחץ על המקור כדי לשים את הלוח המורכב. הכן את הלוח המורכב על ידי הוספת 200 μL של פפטידים בהתאמה, היונומיצין ואתילן גליקול-ביס (β-אמינואתיל אתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)-טריטון X-100 פתרונות.
   3. לחץ על ארון התקשורת כדי למקם את תיבת העצים. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ.
   4. לאחר טעינת הלוחות, סקור את הגדרות התוכנה והקש קרא.

5. ניתוח נתונים

1. לקבוע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ ' -
   
   כאשר, K_d הוא קבוע הניתוק של Fura-2 AM, R הוא יחס הפליטה לאחר עירור ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר (F340 /F380) עבור פפטידים בהתאמה, R_max הוא יחס פלואורסצנטיות מקסימלי שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 30 μM ionomycin, R_min הוא פלואורסצנטיות מינימלית שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 100 mM EGTA / 2.5% טריטון X-100, ו- F380_דקות ו- F380_{מקסימום} הם עוצמת הפלואורסצנטיות המוחלטת של Fura-2 AM במצב ללא סידן וכבול, בהתאמה.
   הערה: המכונה מחלקת את הנוזל בכוח מסוים. אין להגדיר את גובה חלוקת הפפטיד קרוב מדי לתחתית הצלחת; זה עלול לנתק את התאים. השתמש בטיפים פיפטה שחורים כדי למנוע פלואורסצנטיות אוטומטית. קרא את הפלואורסצנטיות המרבית ואת הפלואורסצנטיות המינימלית לכל צלחת עבור כל ניסוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טבלה 1 מכילה את רצפי הפפטיד הנוצרים באמצעות טריון חומצות אמינו סופניות וסריקה אלנין. כפי שמוצג בטבלה 1, רצף פפטיד RKKWNKWALSR חסר פנילאלנין N-מסוף (F) ביחס להורה שלה PAMP-12 ולכן הוא פפטיד מייצג בספרייה N-קאט. באופן דומה, ב- FRKKWNKWALS, סרין מסוף C PAMP-12 הוסר, המייצג ספריית פפטיד חתוכה C המופק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

איתות סידן הוא מרכזי לפירוק תאי התורן והיה בשימוש נרחב במחקר של אינטראקציות קולטן-ליגנד, זיהוי ליגנד, וגילוי סמים¹⁴. MRGPRX2 הוא קולטן תא תורן שהתגלה לאחרונה ונמצא ממלא תפקיד מפתח במחלות דלקתיות רבות כמו גירוד, אסטמה, אטופיק דרמטיטיס, בין היתר². יתר על כן, מספר תרופות ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704