الاعتبار جمع ومعالجة وتخزين أبحاث المؤشرات الحيوية البولية

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى توفير اعتبارات لجمع عينات البول ومعالجتها وتخزينها لدراسات المؤشرات الحيوية لعدوى المسالك البولية.

Abstract

هناك العديد من البروتينات البولية التي تظهر نتائج واعدة كعلامات جديدة لالتهابات المسالك البولية. إن تحديد مؤشر حيوي جديد يتمتع بدقة تنبؤية أكبر مقارنة بطرق التشخيص الحالية لديه القدرة على تحسين القدرة على إدارة المرضى الذين يعانون من التهابات المسالك البولية بشكل كبير. ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر جمع العينات ومعالجتها وتخزينها على نتائج أبحاث المؤشرات الحيوية. يعد فهم تأثيرات كل مرحلة من هذه المراحل على دراسات المؤشرات الحيوية أمرا ضروريا لإبلاغ الأبحاث المستقبلية عالية الجودة في هذا المجال ، وكذلك لمراجعة الدراسات الأخرى في هذا المجال بشكل نقدي. هنا ، تستعرض الدراسة الأدبيات المتعلقة بتأثيرات كل مرحلة من مراحل معالجة عينات البول وتبلغ عن تأثيرات الحالات المختلفة على البروتينات البولية. سيركز البروتوكول على تقنيات التجميع ، ووقت ودرجة حرارة التخزين ، وتقنيات المعالجة ، واستخدام الكواشف ، والتجميد طويل الأجل على استقرار المؤشرات الحيوية. سيركز على البروتينات ولكنه سيناقش بإيجاز المواد الأخرى التي يمكن استخدامها في أبحاث المؤشرات الحيوية. عند القيام بذلك ، سيوفر هذا البروتوكول دليلا للباحثين المستقبليين للمساعدة في تصميم دراسات المؤشرات الحيوية البولية.

Introduction

التهابات المسالك البولية (UTI) هي واحدة من أكثر الالتهابات البكتيرية شيوعا عند كل من الأطفال^{والبالغين 1}. في حين أن تشخيص التهاب المسالك البولية في بعض السكان يمكن أن يكون غير معقد ، إلا أنه يمكن أن يكون أكثر تعقيدا في البعض الآخر ، مثل أولئك الذين يعانون من المثانة العصبية². ستساعد القدرة على تشخيص عدوى المسالك البولية بدقة على تحسين جهود الإشراف على المضادات الحيوية عن طريق تقليل استخدام المضادات الحيوية غير الضرورية وربما المساعدة في التشخيص المبكر لالتهاب المسالك البولية ، وبالتالي تقليل مخاطر المراضة. نظرا لانتشار عدوى المسالك البولية ، هناك اهتمام كبير بتحسين التدبير العلاجي لهذه العدوى الشائعة.

هناك عدد متزايد من المؤشرات الحيوية الجديدة في الأدبيات التي تظهر وعدا في قدرتها على تشخيص التهاب المسالك البولية^{3،4،5،6،7}. ومع ذلك ، هناك العديد من العوامل المرتبطة بمعالجة عينات البول التي لديها القدرة على تغيير النتائج. تتراوح هذه العوامل من طرق التجميع ودرجة الحرارة ومدة التخزين على المدى القصير والطويل وتقنيات المعالجة واستخدام الكاشف ودورات التجميد^{والذوبان 8}. يعد فهم كيف يمكن أن تؤثر التغييرات في كل منها على قراءات المؤشرات الحيوية أمرا ضروريا لتفسير البحث بشكل نقدي داخل الأدبيات بالإضافة إلى تصميم دراسات عالية الجودة تركز على المؤشرات الحيوية للبول.

هنا ، يتم توفير مراجعة سردية للأدبيات حول تأثيرات كل عامل ، بما في ذلك تقنيات التجميع ، ودرجة حرارة التخزين قصيرة وطويلة الأجل ومدتها ، واستخدام الكاشف ، وتأثير دورات التجميد والذوبان ، على البروتينات التي قد يكون لها فائدة كمؤشرات حيوية للبول وتقديم توصيات للمعالجة المثلى بناء على هذه المراجعة للأدبيات. سيركز هذا البروتوكول على المؤشرات الحيوية للبروتين التي تم قياسها باستخدام البقع الغربية أو ELISAs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في المؤسسة. التأكد من الحصول على الموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) قبل جمع العينات البيولوجية واستخدامها في البحث.

1. المجموعة

1. احصل على عينة بول في كوب عينة معقم. حدد نوع عينة البول ، بالإضافة إلى معايير التضمين والاستبعاد المحددة ، بناء على تصميم الدراسة المحدد. بالنسبة لدراسات التهاب المسالك البولية ، استخدم إما طريقة الصيد النظيف أو القسطرة لتجنب تلوث العجان.
2. للحصول على عينة بول نظيفة ، اطلب من المشاركين مسح المنطقة حول الإحليل بمنشفة ، وإفراغ كمية صغيرة في المرحاض ، ثم التبول في كوب العينة.
3. اطلب من النساء استخدام أصابعهن لنشر الشفرين والرجال لسحب القلفة (إن أمكن) قبل التبول لتجنب التلوث.
4. سجل وقت التحصيل.
5. جمع البيانات السريرية ذات الصلة من كل مشارك ، كما هو مطلوب في تصميم الدراسة الفردية وسؤال البحث.
6. ضع في اعتبارك إجراء تحليل البول أو مقياس البول على كل عينة قبل المعالجة والتخزين إذا لم تكن هذه البيانات متاحة بشكل موثوق من السجل الصحي الإلكتروني.

2. معالجة العينات وتخزينها

1. قم بمعالجة العينات على الفور. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فقم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
2. إذا تعذر تخزين العينات عند 4 درجات مئوية أو تحتاج إلى تخزينها عند 4 درجات مئوية أطول من 24 ساعة ، أضف 0.2 M حمض البوريك أو 10 ملي مولار من NaN₃ إلى العينات. تحقق للتأكد من أن هذه الكواشف متوافقة مع تطبيقات المصب المخطط لها.
3. سجل مدة الوقت الذي تقضيه العينات عند 4 درجات مئوية.
4. الطرد المركزي للعينات عند 1000-1500 × جم لمدة 10-20 دقيقة. لا يلزم أن يكون الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.
5. اجمع المادة الطافية وقم بتقسيمها إلى أنابيب منفصلة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
6. قم بتسمية الأنابيب بمعرفات متعددة وواضحة (مثل التاريخ وتحديد العينة (ID)). ضع في اعتبارك استخدام الرموز الشريطية التي تم إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر والمصممة خصيصا لتخزين العينات البيولوجية عند -80 درجة مئوية. إذا لم يكن متاحا، فتأكد من أن القلم المستخدم لوضع العلامات على العينات مقاوم للماء.
7. قم بتسمية كل صندوق تجميد بحيث يكون لكل موقع رمز محدد. لهذا ، قم بترقيم كل عمود بحرف مختلف وكل صف برقم. سيسمح ذلك بإنشاء خرائط أو أدلة أخرى لسهولة موقع العينة.
8. قم بتجميد العينات على الفور عند -80 درجة مئوية. سجل وقت التجميد.
9. قم بإذابة العينات في حمام مائي 37 درجة مئوية في يوم القياس لتقليل التخزين غير الضروري في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
10. سجل أوقات وعدد دورات التجميد والذوبان الإضافية لكل حصة.

3. التحليل

1. عند استخدام ELISA المتوفرة تجاريا، اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بتشغيل النماذج بشكل مكرر.
3. حدد التركيز المتوقع للبروتين محل الاهتمام للتأكد من أن مستويات البروتين في العينات تقع ضمن نطاق المجموعة. إذا تجاوز المستوى المتوقع للبروتين المعيار الأعلى ، فقم بتخفيف العينات.
4. بعد الحصول على البيانات من قارئ اللوحة (ELISA) أو اللطخة الغربية ، حدد تركيز كل مؤشر حيوي في العينة يدويا (غير مستحسن) أو باستخدام أي برنامج.
5. تحليل النتائج. يعتمد تحليل البيانات على تصميم الدراسة الفردية.
6. ضع في اعتبارك ضبط قيم المؤشرات الحيوية لمراعاة تركيز البول.
   ملاحظة: تقليديا ، استخدم باحثو المؤشرات الحيوية الكرياتينين في البول كطريقة للتطبيع ، خاصة في المشاركين الذين يعانون من وظائف الكلى الطبيعية ، لحساب تركيز البول. ومع ذلك ، أفاد آخرون أن التطبيع لا يحدث فرقا في النتائج⁴. للتغلب على هذه العقبة ، أبلغ بعض الباحثين عن نتائج طبيعية وغير طبيعية.
7. التوصية بالإبلاغ عن نطاقات الأوقات من الجمع إلى التجميد، بالإضافة إلى المدة الزمنية عند 4 درجات مئوية قبل المعالجة في المخطوطات المنشورة للسماح بتفسير النتائج في سياق معالجة العينات (الشكل 1)

4. تأثير ظروف التخزين المختلفة على ليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز (NGAL).

1. سبايك البول الطازج مع 2 نانوغرام / مل من NGAL المؤتلف.
2. اقتبس البول وإخضاعه لظروف معالجة وتخزين مختلفة.
   1. الطرد المركزي للبول عند 1000-1500 × جم لمدة 10-20 دقيقة. لا يلزم أن يكون الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. يحفظ في ظروف مختلفة (20 درجة مئوية ، 4 درجات مئوية ، -20 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 72 ساعة.
   2. قم بتخزين حصة العينة عند -80 درجة مئوية للمقارنة.
3. بعد الحفاظ على العينات في الظروف المختلفة كما هو مذكور في الخطوة 4.2.1 ، قم بقياس مستويات NGAL في العينات باستخدام مجموعة ELISA المتوفرة تجاريا والتي تتضمن عناصر التحكم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان للطرد المركزي تأثير ضئيل على مستويات NGAL. وكانت عينات الطرد المركزي المخزنة عند -80 درجة مئوية تحتوي على مستويات أقل من NGAL مقارنة بالعينات غير بالطرد المركزي (2.17 نانوغرام/مل ± 0.32 نانوغرام/مل، 2.77 نانوغرام/مل ± 0.21 نانوغرام/مل). كان لدورات التجميد أيضا تأثير على مستويات NGAL ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لا تقتصر أهمية إنتاج نتائج متسقة وقابلة للتكرار على نجاح الدراسات الفردية ولكنها ستمكن أيضا من مقارنة أفضل للنتائج داخل الأدبيات⁹. يمكن أن يؤدي التباين بين الدراسات في الخطوات الإجرائية الرئيسية إلى تحيز لا رجعة فيه قد يؤثر على إشارات الواسمات الحيوية وتفس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies