שיקולי איסוף, עיבוד ואחסון למחקר סמנים ביולוגיים בשתן

Summary

פרוטוקול זה נועד לספק שיקולים לאיסוף, עיבוד ואחסון דגימות שתן למחקרי סמנים ביולוגיים של זיהום בדרכי השתן.

Abstract

ישנם מספר חלבוני שתן המראים הבטחה כסמנים חדשים לדלקות בדרכי השתן. לזיהוי של סמן ביולוגי חדש בעל דיוק ניבוי גדול יותר בהשוואה לשיטות האבחון הנוכחיות יש פוטנציאל לשפר מאוד את היכולת לנהל חולים עם דלקות בדרכי השתן. עם זאת, איסוף דגימות, עיבוד ואחסון יכולים להשפיע על תוצאות מחקר הסמנים הביולוגיים. הבנת ההשפעות של כל אחד מהשלבים הללו על מחקרי סמנים ביולוגיים נחוצה כדי ליידע מחקר עתידי ואיכותי בתחום זה, כמו גם כדי לסקור באופן ביקורתי מחקרים אחרים בתחום זה. כאן, המחקר סוקר את הספרות לגבי ההשפעות של כל שלב בעיבוד דגימות השתן ומדווח על ההשפעות של מצבים שונים על חלבוני השתן. הפרוטוקול יתמקד בטכניקות איסוף, זמן וטמפרטורת האחסון, טכניקות עיבוד, שימוש בריאגנטים והקפאה ארוכת טווח על יציבות הסמנים הביולוגיים. הוא יתמקד בחלבונים אך ידון בקצרה בחומרים אחרים שעשויים לשמש במחקר סמנים ביולוגיים. בכך, פרוטוקול זה יספק מדריך לחוקרים עתידיים שיסייעו בתכנון מחקרי סמנים ביולוגיים בשתן.

Introduction

דלקות בדרכי השתן (UTI) הן אחד הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בקרב ילדים ומבוגרים^כאחד. בעוד שהאבחנה של דלקת בדרכי השתן באוכלוסיות מסוימות יכולה להיות לא מסובכת, היא יכולה להיות מורכבת יותר אצל אחרות, כמו אלה עם שלפוחית נוירופתית². היכולת לאבחן במדויק דלקות בדרכי השתן תסייע בשיפור מאמצי הפיקוח על האנטיביוטיקה על ידי הפחתת השימוש באנטיביוטיקה מיותרת ועשויה לסייע באבחון מוקדם יותר של דלקות בדרכי השתן, ובכך להפחית את הסיכון לתחלואה. בהתחשב בשכיחות של דלקות בדרכי השתן, יש עניין משמעותי בשיפור הטיפול בזיהום שכיח זה.

יש מספר הולך וגדל של סמנים ביולוגיים חדשים בספרות המראים הבטחה ביכולתם לאבחן דלקת בדרכי השתן 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנם מספר גורמים הקשורים לעיבוד דגימות שתן שיש להם פוטנציאל לשנות את התוצאות. גורמים אלה נעים בין שיטות איסוף, טמפרטורה ומשך אחסון לטווח קצר וארוך, טכניקות עיבוד, שימוש בריאגנטים ומחזורי הקפאה-הפשרה⁸. הבנת האופן שבו שינויים בכל אחד מאלה יכולים להשפיע על קריאות סמנים ביולוגיים נחוצה הן כדי לפרש באופן ביקורתי את המחקר בספרות והן כדי לתכנן מחקרים באיכות גבוהה המתמקדים בסמנים ביולוגיים של שתן.

כאן, ניתנת סקירה נרטיבית של הספרות על ההשפעות של כל גורם, כולל טכניקות איסוף, טמפרטורת ומשך אחסון לטווח קצר וארוך, שימוש בריאגנטים והשפעת מחזורי הקפאה-הפשרה, על חלבונים שעשויים להיות שימושיים כסמנים ביולוגיים בשתן ומספקים המלצות לעיבוד אופטימלי על סמך סקירה זו של הספרות. פרוטוקול זה יתמקד בסמנים ביולוגיים של חלבונים הנמדדים באמצעות כתמים מערביים או ELISA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד. ודא שהאישור מתקבל מוועדת הביקורת המוסדית (IRB) לפני איסוף וניצול דגימות ביולוגיות למחקר.

1. איסוף

1. השג דגימת שתן בכוס דגימה סטרילית. החליטו על סוג דגימת השתן, כמו גם קריטריונים ספציפיים להכללה ואי הכללה, על סמך תכנון המחקר הספציפי. עבור מחקרי UTI, השתמש בשיטת התפיסה הנקייה או בצנתור כדי למנוע זיהום פרינאלי.
2. כדי לקבל דגימת שתן נקייה, הנחו את המשתתפים לנגב את האזור הפרי-שופכה עם מגבון, לרוקן כמות קטנה לתוך האסלה ולאחר מכן להשתין לתוך כוס הדגימה.
3. הנחו נשים להשתמש באצבעותיהן כדי לפזר את השפתיים ולגברים למשוך את העורלה (אם רלוונטי) לפני מתן שתן כדי למנוע זיהום.
4. רשום את זמן האיסוף.
5. אסוף את הנתונים הקליניים הרלוונטיים מכל משתתף, כנדרש בתכנון המחקר האישי ובשאלת המחקר.
6. שקול לבצע בדיקת שתן או מקל שתן על כל דגימה לפני העיבוד והאחסון אם נתונים אלה אינם זמינים באופן מהימן מהרשומה הרפואית האלקטרונית.

2. עיבוד ואחסון דוגמאות

1. עבד את הדגימות מיד. אם זה לא אפשרי, אחסן את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.
2. אם לא ניתן לאחסן דגימות ב-4 מעלות צלזיוס או שיש צורך לאחסן אותן ב-4 מעלות צלזיוס יותר מ-24 שעות, הוסף 0.2 M חומצה בורית או 10 מ"מ NaN₃ לדגימות. בדוק כדי לוודא שריאגנטים כאלה תואמים ליישומים מתוכננים במורד הזרם.
3. רשום את משך הזמן שהדגימות שהו ב-4 מעלות צלזיוס.
4. צנטריפוגה את הדגימות ב-1000-1500 x גרם למשך 10-20 דקות. צנטריפוגה לא צריכה להיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. אספו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים.
6. סמן את הצינורות עם מספר מזהים ברורים (כגון התאריך וזיהוי הדגימה (ID)). שקול להשתמש בברקודים שנוצרו על ידי מחשב שתוכננו במיוחד לאחסון דגימות ביולוגיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אם אינו זמין, ודא שהעט המשמש לתיוג דגימות עמיד במים.
7. סמן כל קופסת מקפיא כך שלכל מיקום יש קוד ספציפי. לשם כך, מספר כל עמודה באות אחרת וכל שורה במספר. זה יאפשר יצירת מפות או מדריכים אחרים למיקום קל לדוגמא.
8. מקפיאים את הדגימות מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. רשום את זמן ההקפאה.
9. הפשירו את הדגימות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ביום המדידה כדי למזער אחסון מיותר בטמפרטורת החדר או ב-4 מעלות צלזיוס.
10. רשום את הזמנים ומספר מחזורי ההקפאה-הפשרה הנוספים עבור כל ציטוט.

3. ניתוח

1. בעת שימוש במכשירי ELISA הזמינים מסחרית, עקוב אחר הוראות היצרן.
2. הפעל את הדוגמאות בשכפול.
3. זהה את הריכוז הצפוי של החלבון המעניין כדי להבטיח שרמות החלבון בדגימות נופלות בטווח הערכה. אם רמת החלבון הצפויה עולה על הסטנדרט העליון, יש לדלל את הדגימות.
4. לאחר קבלת נתונים מקורא הלוחות (ELISA) או הכתם המערבי, קבע את הריכוז של כל סמן ביולוגי בדגימה באופן ידני (לא מומלץ) או באמצעות תוכנה כלשהי.
5. נתח את התוצאות. ניתוח הנתונים תלוי בתכנון המחקר האישי.
6. שקול להתאים את ערכי הסמנים הביולוגיים כדי לקחת בחשבון את ריכוז השתן.
   הערה: באופן מסורתי, חוקרי סמנים ביולוגיים השתמשו בקריאטינין בשתן כשיטה לנורמליזציה, במיוחד אצל משתתפים עם תפקוד כליות תקין, כדי להסביר את ריכוז השתן. עם זאת, אחרים מדווחים כי הנורמליזציה אינה משפיעה על התוצאות⁴. כדי להתגבר על מכשול זה, חלק מהחוקרים מדווחים על תוצאות מנורמלות ולא מנורמלות.
7. ממליץ על טווחי דיווח מאיסוף ועד הקפאה, כמו גם משך הזמן ב-4 מעלות צלזיוס לפני העיבוד בכתבי יד שפורסמו כדי לאפשר פירוש של תוצאות בהקשר של עיבוד דגימה (איור 1)

4. השפעת תנאי אחסון שונים על ליפוקלין הקשור לנויטרופילים ג'לטינאז (NGAL).

1. ספייק שתן טרי עם 2 ננוגרם/מ"ל של NGAL רקומביננטי.
2. יש להצמיד את השתן ולהכפיף אותו לתנאי עיבוד ואחסון שונים.
   1. צנטריפוגה בשתן בטמפרטורה של 1000-1500 x גרם למשך 10-20 דקות. צנטריפוגה לא צריכה להיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לאחסן בתנאים שונים (20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס, -20 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות, 48 שעות או 72 שעות.
   2. אחסן את כמות המדגם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להשוואה.
3. לאחר שמירה על הדגימות בתנאים השונים כאמור בשלב 4.2.1, יש למדוד את רמות ה-NGAL בדגימות באמצעות ערכת ELISA זמינה מסחרית הכוללת את הבקרות בהתאם להוראות היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לצנטריפוגה הייתה השפעה קטנה על רמות ה-NGAL. בדגימות צנטריפוגות המאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס היו רמות נמוכות יותר של NGAL מאשר בדגימות שאינן צנטריפוגות (2.17 ננוגרם/מ"ל ±-0.32 ננוגרם/מ"ל, 2.77 ננוגרם/מ"ל ±-0.21 ננוגרם/מ"ל). למחזורי ההקפאה הייתה השפעה גם על רמות ה-NGAL לאחר מחזור ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

החשיבות של הפקת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור אינה מוגבלת להצלחת מחקרים בודדים אלא גם תאפשר השוואה טובה יותר של תוצאות בתוך הספרות⁹. שונות בין מחקרים בשלבים פרוצדורליים מרכזיים יכולה להציג הטיה בלתי הפיכה שעלולה להשפיע על אותות הסמנים הביולוגיים ועל פרשנות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies