JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, idrar yolu enfeksiyonu biyobelirteç çalışmaları için idrar örneği toplama, işleme ve saklama ile ilgili hususları sağlamayı amaçlamaktadır.

Özet

İdrar yolu enfeksiyonlarının yeni belirteçleri olarak umut vaat eden birkaç idrar proteini vardır. Mevcut tanı yöntemlerine kıyasla daha fazla öngörücü doğruluğa sahip yeni bir biyobelirteçin tanımlanması, idrar yolu enfeksiyonu olan hastaları yönetme yeteneğini büyük ölçüde geliştirme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, numune toplama, işleme ve depolama, biyobelirteç araştırmasının sonuçlarını potansiyel olarak etkileyebilir. Bu aşamaların her birinin biyobelirteç çalışmaları üzerindeki etkilerini anlamak, bu alandaki gelecekteki yüksek kaliteli araştırmaları bilgilendirmek ve bu alandaki diğer çalışmaları eleştirel olarak gözden geçirmek için gereklidir. Burada, çalışma, idrar örneği işlemenin her aşamasının etkilerine ilişkin literatürü gözden geçirmekte ve çeşitli durumların idrar proteinleri üzerindeki etkilerini bildirmektedir. Protokol, toplama tekniklerine, depolama süresi ve sıcaklığına, işleme tekniklerine, reaktiflerin kullanımına ve biyobelirteç stabilitesi üzerinde uzun süreli dondurmaya odaklanacaktır. Proteinlere odaklanacak, ancak biyobelirteç araştırmalarında kullanılabilecek diğer materyalleri kısaca tartışacaktır. Bunu yaparken, bu protokol gelecekteki araştırmacılara üriner biyobelirteç çalışmalarının tasarımına yardımcı olacak bir rehber sağlayacaktır.

Giriş

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) hem çocuklarda hem de yetişkinlerde en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlardan biridir1. Bazı popülasyonlarda İYE tanısı karmaşık olmayabilirken, nöropatik mesanesi olanlar gibi diğerlerinde daha karmaşık olabilir2. İYE'leri doğru bir şekilde teşhis etme yeteneği, gereksiz antibiyotik kullanımını azaltarak antibiyotik yönetim çabalarının iyileştirilmesine yardımcı olacak ve potansiyel olarak İYE'nin erken teşhisine yardımcı olacak ve böylece morbidite riskini azaltacaktır. İYE'lerin prevalansı göz önüne alındığında, bu yaygın enfeksiyonun yönetiminin iyileştirilmesine önemli bir ilgi vardır.

Literatürde İYE 3,4,5,6,7'yi teşhis etme yeteneklerinde umut vaat eden artan sayıda yeni biyobelirteç bulunmaktadır. Bununla birlikte, idrar örneklerinin işlenmesiyle ilişkili sonuçları değiştirme potansiyeline sahip birkaç faktör vardır. Bu faktörler, toplama yöntemleri, kısa ve uzun süreli depolamanın sıcaklığı ve süresi, işleme teknikleri, reaktif kullanımı ve donma-çözülme döngüleriarasında değişir 8. Bunların her birindeki değişikliklerin biyobelirteç okumalarını nasıl etkileyebileceğini anlamak, hem literatürdeki araştırmaları eleştirel olarak yorumlamak hem de idrar biyobelirteçlerine odaklanan yüksek kaliteli çalışmalar tasarlamak için gereklidir.

Burada, toplama teknikleri, kısa ve uzun süreli depolama sıcaklığı ve süresi, reaktif kullanımı ve donma-çözülme döngülerinin etkisi dahil olmak üzere her bir faktörün idrar biyobelirteçleri olarak faydalı olabilecek proteinler üzerindeki etkileri hakkında literatürün anlatısal bir incelemesi sağlanmış ve literatürün bu incelemesine dayalı olarak optimal işleme için öneriler sunulmuştur. Bu protokol, western blots veya ELISA'lar kullanılarak ölçülen protein biyobelirteçlerine odaklanacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, kurumun insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder. Araştırma için biyolojik örneklerin toplanması ve kullanılmasından önce kurumsal inceleme kurulundan (IRB) onay alındığından emin olun.

1. Koleksiyon

  1. Steril bir numune kabında idrar örneği alın. Spesifik çalışma tasarımına dayalı olarak idrar örneğinin türüne ve ayrıca spesifik dahil etme ve dışlama kriterlerine karar verin. İYE çalışmaları için, perineal kontaminasyonu önlemek için temiz yakalama yöntemini veya kateterizasyonu kullanın.
  2. Temiz bir idrar örneği elde etmek için, katılımcılara periüretral alanı bir havluyla silmelerini, tuvalete küçük bir miktar boşaltmalarını ve ardından numune kabına idrar yapmalarını söyleyin.
  3. Kontaminasyonu önlemek için idrara çıkmadan önce kadınlara labiaları açmak için parmaklarını kullanmalarını ve erkeklere sünnet derilerini (varsa) geri çekmelerini söyleyin.
  4. Toplama zamanını kaydedin.
  5. Bireysel çalışma tasarımı ve araştırma sorusunun gerektirdiği şekilde her katılımcıdan ilgili klinik verileri toplayın.
  6. Bu veriler elektronik sağlık kaydında güvenilir bir şekilde mevcut değilse, işleme ve depolamadan önce her numune üzerinde bir idrar tahlili veya idrar ölçüm çubuğu yapmayı düşünün.

2. Numune işleme ve saklama

  1. Numuneleri hemen işleyin. Bu mümkün değilse, numuneyi 4 °C'de 24 saate kadar saklayın.
  2. Numuneler 4 °C'de saklanamıyorsa veya 4 °C'de 24 saatten daha uzun süre saklanması gerekiyorsa, numunelere 0,2 M borik asit veya 10 mMNaN3 ekleyin. Bu tür reaktiflerin planlanan aşağı akış uygulamalarıyla uyumlu olduğundan emin olmak için kontrol edin.
  3. Numunelerin 4 °C'de geçirdiği süreyi kaydedin.
  4. Numuneleri 1000-1500 x g'da 10-20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemenin 4 °C'de olması gerekmez.
  5. Süpernatanı toplayın ve ayrı mikrosantrifüj tüplerine alın.
  6. Tüpleri çoklu, net tanımlayıcılarla (tarih ve numune tanımlaması (ID) gibi) etiketleyin. Biyolojik numunelerin -80 °C'de saklanması için özel olarak tasarlanmış bilgisayar tarafından oluşturulan barkodları kullanmayı düşünün. Mevcut değilse, numuneleri etiketlemek için kullanılan kalemin suya dayanıklı olduğundan emin olun.
  7. Her dondurucu kutusunu, her konumun belirli bir kodu olacak şekilde etiketleyin. Bunun için her sütunu farklı bir harfle ve her satırı bir sayı ile numaralandırın. Bu, kolay örnek konumu için haritaların veya diğer kılavuzların oluşturulmasına izin verecektir.
  8. Numuneleri hemen -80 °C'de dondurun. Donma zamanını kaydedin.
  9. Oda sıcaklığında veya 4 °C'de gereksiz depolamayı en aza indirmek için numuneleri ölçüm gününde 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
  10. Her alikot için ek donma-çözülme döngülerinin sürelerini ve sayısını kaydedin.

3. Analiz

  1. Piyasada bulunan ELISA'ları kullanırken, üreticinin talimatlarına uyun.
  2. Örnekleri çift olarak çalıştırın.
  3. Numunelerdeki protein seviyelerinin kit aralığında olduğundan emin olmak için ilgilenilen proteinin beklenen konsantrasyonunu belirleyin. Beklenen protein seviyesi üst standardı aşarsa, numuneleri seyreltin.
  4. Plaka okuyucudan (ELISA) veya western blot'tan veri elde edildikten sonra, numunedeki her bir biyobelirteçin konsantrasyonunu manuel olarak (önerilmez) veya herhangi bir yazılım kullanarak belirleyin.
  5. Sonuçları analiz edin. Veri analizi, bireysel çalışma tasarımına bağlıdır.
  6. İdrar konsantrasyonunu hesaba katmak için biyobelirteç değerlerini ayarlamayı düşünün.
    NOT: Geleneksel olarak, biyobelirteç araştırmacıları, idrar konsantrasyonunu hesaba katmak için, özellikle normal böbrek fonksiyonuna sahip katılımcılarda, idrar kreatininini bir normalizasyon yöntemi olarak kullanmışlardır. Ancak diğerleri normalleşmenin sonuçlarda bir fark yaratmadığını bildirmektedir4. Bu engelin üstesinden gelmek için, bazı araştırmacılar hem normalleştirilmiş hem de normalleştirilmemiş sonuçlar bildirmektedir.
  7. Numune işleme bağlamında sonuçların yorumlanmasına izin vermek için, toplanmadan dondurmaya kadar geçen sürenin yanı sıra yayınlanmış el yazmalarında işlenmeden önceki 4 °C'deki sürenin raporlanmasını önerin (Şekil 1)

4. Çeşitli saklama koşullarının nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalin (NGAL) üzerindeki etkisi.

  1. 2 ng / mL rekombinant NGAL ile taze idrarı artırın.
  2. İdrarı alın ve farklı işleme ve saklama koşullarına tabi tutun.
    1. İdrarı 10-20 dakika boyunca 1000-1500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemenin 4 °C'de olması gerekmez. Farklı koşullarda (20 °C, 4 °C, -20 °C) 24 saat, 48 saat veya 72 saat saklayın.
    2. Karşılaştırma için numunenin alikotunu -80 °C'de saklayın.
  3. Numuneleri adım 4.2.1'de belirtildiği gibi farklı koşullarda muhafaza ettikten sonra, üreticinin talimatlarına göre kontrolleri içeren, piyasada bulunan bir ELISA kitini kullanarak numunelerdeki NGAL seviyelerini ölçün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Santrifüjlemenin NGAL seviyeleri üzerinde küçük bir etkisi oldu. -80 °C'de saklanan santrifüjlenmiş numuneler, santrifüjlenmemiş numunelere göre daha düşük NGAL seviyelerine sahipti (2.17 ng/mL ± 0.32 ng/mL, 2.77 ng/mL ± 0.21 ng/mL). Donma döngüleri, üçüncü donma-çözülme döngüsünden sonra NGAL seviyeleri üzerinde de bir etkiye sahipti. (Şekil 2). İncelenen koşullardan (santrifüjleme, donma-çözülme döngüleri ve depolama s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üretmenin önemi sadece bireysel çalışmaların başarısı ile sınırlı olmayıp, sonuçların literatür içinde daha iyi karşılaştırılmasını da sağlayacaktır9. Temel prosedür adımlarındaki çalışmalar arasındaki farklılıklar, biyobelirteç sinyallerini ve bunların yorumlanmasını etkileyebilecek geri dönüşü olmayan yanlılıklara neden olabilir ve bu da çeşitli çalışmalar arasındaki tutars?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma için herhangi bir dış finansman sağlanmadı. Bu çalışmada verilerin elde edilmesi için kurumsal fonlar kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Boric acidSigma-AldrichB6768To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxesFisher Scientific03-395-464
Microcentrifuge tubesThomas scientific1149X93
NGAL ELISA KitR&D SystemsDLCN20Used to create representative results
Pipette and tipsDependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azideSigma-AldrichS2002To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cupsThermo Scientific3122B03ORGSterile cups not required unless needed for other studies

Referanslar

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: Incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, 1 SUPPL. 1 5-13 (2002).
  2. Forster, C. S., Pohl, H. Diagnosis of urinary tract infection in the neuropathic bladder: Changing the paradigm to include the microbiome. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), (2019).
  3. Gadalla, A. A. H., et al. Identification of clinical and urine biomarkers for uncomplicated urinary tract infection using machine learning algorithms. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Shaikh, N., et al. Biomarkers that differentiate false positive urinalyses from true urinary tract infection. Pediatric Nephrology. 35 (2), 321-329 (2020).
  5. Renata, Y., Jassar, H., Katz, R., Hochberg, A., Nir, R. -R., Klein-Kremer, A. Urinary concentration of cytokines in children with acute pyelonephritis. European journal of Pediatrics. 172 (6), 769-774 (2013).
  6. Forster, C. S., Haffey, W. D., Bennett, M., Greis, K. D., Devarajan, P. Identification of urinary CD44 and Prosaposin as specific biomarkers of urinary tract infections in children with neurogenic bladders. Biomarker Insights. 14, (2019).
  7. Bitsori, M., et al. Urine IL-8 concentrations in infectious and non-infectious urinary tract conditions. Pediatric Nephrology. 26 (11), Berlin, Germany. 2003-2007 (2011).
  8. Schuh, M. P., et al. Long-term Stability of urinary biomarkers of acute kidney injury in children. American Journal of Kidney Diseases. 67 (1), 56-61 (2016).
  9. Hepburn, S., et al. An analysis of the impact of pre-analytical factors on the urine proteome: Sample processing time, temperature, and proteolysis. Proteomics - Clinical Applications. 9 (5-6), 507-521 (2015).
  10. Han, W. K., Wagener, G., Zhu, Y., Wang, S., Lee, H. T. Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 4 (5), 873-882 (2009).
  11. Schaub, S., et al. Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Kidney International. 65 (1), 323-332 (2004).
  12. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  13. Grenier, F. C., et al. Evaluation of the ARCHITECT urine NGAL assay: Assay performance, specimen handling requirements and biological variability. Clinical Biochemistry. 43 (6), 615-620 (2010).
  14. Liu, K. D., et al. Storage time and urine biomarker levels in the ASSESS-AKI study. PLoS ONE. 11 (10), 1-9 (2016).
  15. Parikh, C. R., et al. Urine stability studies for novel biomarkers of acute kidney injury. American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 567-572 (2014).
  16. Van De Vrie, M., Deegens, J. K., Van Der Vlag, J., Hilbrands, L. B. Effect of long-term storage of urine samples on measurement of kidney injury molecule 1 (KIM-1) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 573-576 (2014).
  17. Hubel, A., Aksan, A., Skubitz, A. P. N., Wendt, C., Zhong, X. State of the art in preservation of fluid biospecimens. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 237-244 (2011).
  18. Havanapan, P. O., Thongboonkerd, V. Are protease inhibitors required for gel-based proteomics of kidney and urine. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3109-3117 (2009).
  19. Thongboonkerd, V., Saetun, P. Bacterial overgrowth affects urinary proteome analysis: Recommendation for centrifugation, temperature, duration, and the use of preservatives during sample collection. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4173-4181 (2007).
  20. Saetun, P., Semangoen, T., Thongboonkerd, V. Characterizations of urinary sediments precipitated after freezing and their effects on urinary protein and chemical analyses. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 296 (6), 1346-1354 (2009).
  21. Project, H. K. Standard Protocol for Urine Collection and Storage. , (2021).
  22. Nickolas, T. L., et al. Diagnostic and prognostic stratification in the emergency department using urinary biomarkers of nephron damage: a multicenter prospective cohort study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 246-255 (2012).
  23. Forster, C. S., Loechtenfeldt, A. M., Shah, S. S., Goldstein, S. Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin in girls with recurrent urinary tract infections. Pediatric Nephrology. , 1-8 (2020).
  24. Forster, C. S., et al. Predictive ability of NGAL in identifying urinary tract infection in children with neurogenic bladders. Pediatric Nephrology. 33 (8), Berlin, Germany. 1365-1374 (2018).
  25. Forster, C., et al. Urinary NGAL deficiency in children with recurrent urinary tract infections. Journal of Pediatric Urology. 32, 1077-1080 (2017).
  26. Gupta, S., Preece, J., Haynes, A., Becknell, B., Ching, C. Differentiating asymptomatic bacteriuria from urinary tract infection in the pediatric neurogenic bladder population: NGAL as a promising biomarker. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), 214-221 (2019).
  27. Shaikh, N., et al. Host and bacterial markers that differ in children with cystitis and pyelonephritis. Journal of Pediatrics. 209, 146-153 (2019).
  28. Harpole, M., Davis, J., Espina, V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Review of Proteomics. 13 (6), 609-626 (2016).
  29. Jung, C. E., et al. Benchmarking urine storage and collection conditions for evaluating the female urinary microbiome. Scientific Reports. 9 (1), 13409(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

riner Biyobelirte lerriner Sistem Enfeksiyonlarrnek ToplamaBiyobelirte Ara t rmalarleme TeknikleriSaklama Ko ullarTan Y ntemleriHasta Y netimiProtein StabilitesiAra t rma ProtokolLiterat r TaramasBiyobelirte Tan mlama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır