Considerazioni sulla raccolta, l'elaborazione e la conservazione per la ricerca sui biomarcatori urinari

Riepilogo

Questo protocollo mira a fornire considerazioni per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni di urina per gli studi sui biomarcatori di infezione del tratto urinario.

Abstract

Ci sono diverse proteine urinarie che si mostrano promettenti come nuovi marcatori di infezioni del tratto urinario. L'identificazione di un nuovo biomarcatore che ha una maggiore accuratezza predittiva rispetto agli attuali metodi diagnostici ha il potenziale per migliorare notevolmente la capacità di gestire i pazienti con infezioni del tratto urinario. Tuttavia, la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni possono potenzialmente influire sui risultati della ricerca sui biomarcatori. Comprendere gli effetti di ciascuna di queste fasi sugli studi sui biomarcatori è necessario per informare la ricerca futura e di alta qualità in questo settore, nonché per rivedere criticamente altri studi in questo settore. Qui, lo studio esamina la letteratura relativa agli effetti di ciascuna fase dell'elaborazione del campione di urina e riporta gli effetti di varie condizioni sulle proteine urinarie. Il protocollo si concentrerà sulle tecniche di raccolta, sul tempo e sulla temperatura di conservazione, sulle tecniche di lavorazione, sull'uso dei reagenti e sul congelamento a lungo termine sulla stabilità dei biomarcatori. Si concentrerà sulle proteine, ma discuterà brevemente altri materiali che possono essere utilizzati nella ricerca sui biomarcatori. In tal modo, questo protocollo fornirà una guida ai futuri ricercatori per assistere nella progettazione di studi sui biomarcatori urinari.

Introduzione

Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle infezioni batteriche più comuni sia nei bambini che negli adulti¹. Mentre la diagnosi di infezione delle vie urinarie in alcune popolazioni può essere semplice, può essere più complessa in altre, come quelle con vescica neuropatica². La capacità di diagnosticare con precisione le infezioni delle vie urinarie contribuirà a migliorare gli sforzi di gestione degli antibiotici diminuendo l'uso di antibiotici non necessari e potenzialmente aiuterà nella diagnosi precoce delle infezioni delle vie urinarie, diminuendo così il rischio di morbilità. Data la prevalenza delle infezioni delle vie urinarie, vi è un notevole interesse a migliorare la gestione di questa comune infezione.

C'è un numero crescente di nuovi biomarcatori all'interno della letteratura che mostrano risultati promettenti nella loro capacità di diagnosticare UTI 3,4,5,6,7. Tuttavia, ci sono diversi fattori associati all'elaborazione dei campioni di urina che hanno il potenziale per alterare i risultati. Questi fattori vanno dai metodi di raccolta, alla temperatura e alla durata della conservazione a breve e lungo termine, alle tecniche di lavorazione, all'uso dei reagenti e ai cicli di congelamento-scongelamento⁸. Comprendere in che modo i cambiamenti in ciascuno di questi possono influenzare le letture dei biomarcatori è necessario sia per interpretare criticamente la ricerca all'interno della letteratura, sia per progettare studi di alta qualità incentrati sui biomarcatori delle urine.

Qui, viene fornita una revisione narrativa della letteratura sugli effetti di ciascun fattore, comprese le tecniche di raccolta, la temperatura e la durata di conservazione a breve e lungo termine, l'uso di reagenti e l'effetto dei cicli di congelamento-scongelamento, sulle proteine che possono avere utilità come biomarcatori urinari e fornisce raccomandazioni per un'elaborazione ottimale sulla base di questa revisione della letteratura. Questo protocollo si concentrerà sui biomarcatori proteici misurati utilizzando western blot o ELISA.

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Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana dell'istituto. Assicurarsi che l'approvazione sia ottenuta dal comitato di revisione istituzionale (IRB) prima della raccolta e dell'utilizzo di campioni biologici per la ricerca.

1. Raccolta

1. Ottenere il campione di urina in una tazza per campioni sterile. Decidere il tipo di campione di urina, nonché i criteri specifici di inclusione ed esclusione, in base allo specifico disegno dello studio. Per gli studi sulle infezioni delle vie urinarie, utilizzare il metodo clean-catch o il cateterismo per evitare la contaminazione perineale.
2. Per ottenere un campione di urina pulito, istruire i partecipanti a pulire l'area periuretrale con un asciugamano, svuotare una piccola quantità nella toilette e quindi urinare nella tazza del campione.
3. Istruisci le donne a usare le dita per allargare le labbra e agli uomini a ritrarre il prepuzio (se applicabile) prima della minzione per evitare la contaminazione.
4. Registrare l'orario di raccolta.
5. Raccogliere i dati clinici pertinenti da ciascun partecipante, come richiesto dal disegno dello studio individuale e dalla domanda di ricerca.
6. Prendere in considerazione l'esecuzione di un'analisi delle urine o di un'astina di livello delle urine su ciascun campione prima dell'elaborazione e della conservazione se questi dati non sono disponibili in modo affidabile dalla cartella clinica elettronica.

2. Elaborazione e conservazione dei campioni

1. Elaborare immediatamente i campioni. Se ciò non è possibile, conservare il campione a 4 °C per un massimo di 24 ore.
2. Se i campioni non possono essere conservati a 4 °C o devono essere conservati a 4 °C per più di 24 ore, aggiungere ai campioni 0,2 M di acido borico o 10 mM di NaN₃ . Verificare che tali reagenti siano compatibili con le applicazioni a valle pianificate.
3. Registrare la durata del tempo di permanenza dei campioni a 4 °C.
4. Centrifugare i campioni a 1000-1500 x g per 10-20 minuti. La centrifugazione non deve essere necessariamente a 4 °C.
5. Raccogliere il surnatante e aliquotarlo in provette da microcentrifuga separate.
6. Etichettare le provette con più identificatori chiari (come la data e l'identificazione del campione (ID)). Prendere in considerazione l'utilizzo di codici a barre generati al computer appositamente progettati per la conservazione di campioni biologici a -80 °C. Se non disponibile, assicurarsi che la penna utilizzata per etichettare i campioni sia resistente all'acqua.
7. Etichettare ogni scatola del congelatore in modo che ogni posizione abbia un codice specifico. Per questo, numera ogni colonna con una lettera diversa e ogni riga con un numero. Ciò consentirà la creazione di mappe o altre guide per una facile localizzazione dei campioni.
8. Congelare immediatamente i campioni a -80 °C. Registra il tempo di congelamento.
9. Scongelare i campioni in un bagno d'acqua a 37 °C il giorno della misurazione per ridurre al minimo la conservazione non necessaria a temperatura ambiente o a 4 °C.
10. Registrare i tempi e il numero di cicli di congelamento-disgelo aggiuntivi per ogni aliquota.

3. Analisi

1. Quando si utilizzano ELISA disponibili in commercio, seguire le istruzioni del produttore.
2. Eseguire gli esempi in duplicato.
3. Identificare la concentrazione prevista della proteina di interesse per garantire che i livelli proteici nei campioni rientrino nell'intervallo del kit. Se il livello previsto di proteine supera lo standard superiore, diluire i campioni.
4. Dopo aver ottenuto i dati dal lettore di piastre (ELISA) o dal western blot, determinare la concentrazione di ciascun biomarcatore nel campione manualmente (non consigliato) o utilizzando qualsiasi software.
5. Analizza i risultati. L'analisi dei dati dipende dal disegno dello studio individuale.
6. Prendere in considerazione la possibilità di regolare i valori dei biomarcatori per tenere conto della concentrazione nelle urine.
   NOTA: Tradizionalmente, i ricercatori di biomarcatori hanno utilizzato la creatinina urinaria come metodo di normalizzazione, specialmente nei partecipanti con funzionalità renale normale, per tenere conto della concentrazione urinaria. Tuttavia, altri riferiscono che la normalizzazione non fa la differenza nei risultati⁴. Per superare questo ostacolo, alcuni ricercatori riportano risultati sia normalizzati che non normalizzati.
7. Raccomandare di riportare intervalli di tempo che vanno dalla raccolta al congelamento, nonché la durata del tempo a 4 °C prima dell'elaborazione nei manoscritti pubblicati per consentire l'interpretazione dei risultati nel contesto dell'elaborazione del campione (Figura 1)

4. Effetto di varie condizioni di conservazione sulla lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (NGAL).

1. Aumentare l'urina fresca con 2 ng/mL di NGAL ricombinante.
2. Aliquotare l'urina e sottoporla a diverse condizioni di lavorazione e conservazione.
   1. Centrifugare l'urina a 1000-1500 x g per 10-20 minuti. La centrifugazione non deve essere necessariamente a 4 °C. Conservare in condizioni diverse (20 °C, 4 °C, -20 °C) per 24 ore, 48 ore o 72 ore.
   2. Conservare l'aliquota del campione a -80 °C per il confronto.
3. Dopo aver mantenuto i campioni nelle diverse condizioni di cui al punto 4.2.1, misurare i livelli di NGAL nei campioni utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio che include i controlli secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

La centrifugazione ha avuto un piccolo impatto sui livelli di NGAL. I campioni centrifugati conservati a -80 °C avevano livelli inferiori di NGAL rispetto ai campioni non centrifugati (2,17 ng/mL ± 0,32 ng/mL, 2,77 ng/mL ± 0,21 ng/mL). I cicli di congelamento hanno avuto un impatto anche sui livelli di NGAL dopo il terzo ciclo di congelamento-disgelo. (Figura 2). Tra le condizioni studiate (centrifugazione, cicli di gelo-disgelo e temperatura di stoccaggi...

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Discussione

L'importanza di produrre risultati coerenti e riproducibili non si limita al successo dei singoli studi, ma consentirà anche un migliore confronto dei risultati all'interno della letteratura⁹. La variazione tra gli studi nelle fasi procedurali chiave può introdurre distorsioni irreversibili che possono influenzare i segnali dei biomarcatori e la loro interpretazione, che possono essere responsabili di discrepanze tra diversi studi¹⁰. Ciò...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies