소변 바이오마커 연구를 위한 수집, 처리 및 보관 고려 사항

요약

이 프로토콜은 요로 감염 바이오마커 연구를 위한 소변 샘플 수집, 처리 및 보관에 대한 고려 사항을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

요로 감염의 새로운 지표로 유망한 몇 가지 비뇨기 단백질이 있습니다. 현재의 진단 방법에 비해 예측 정확도가 더 높은 새로운 바이오마커를 식별하면 요로 감염 환자를 관리하는 능력을 크게 향상시킬 수 있는 잠재력이 있습니다. 그러나 시료 채취, 처리 및 보관은 모두 바이오마커 연구 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 각 단계가 바이오마커 연구에 미치는 영향을 이해하는 것은 이 분야에 대한 미래의 고품질 연구에 정보를 제공하고 이 분야의 다른 연구를 비판적으로 검토하는 데 필요합니다. 여기에서 이 연구는 소변 샘플 처리의 각 단계의 효과에 관한 문헌을 검토하고 다양한 조건이 요로 단백질에 미치는 영향을 보고합니다. 이 프로토콜은 수집 기술, 보관 시간 및 온도, 처리 기술, 시약 사용, 바이오마커 안정성에 대한 장기 동결에 중점을 둘 것입니다. 단백질에 초점을 맞추지만 바이오마커 연구에 활용될 수 있는 다른 재료에 대해 간략하게 설명합니다. 이를 통해 이 프로토콜은 향후 연구자들에게 비뇨기 바이오마커 연구의 설계를 지원하는 가이드를 제공할 것입니다.

서문

요로 감염(UTI)은 어린이와 성인 모두에게 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다¹. 일부 집단에서는 요로감염 진단이 복잡하지 않을 수 있지만, 신경병성 방광이 있는 집단과 같은 다른 집단에서는 더 복잡할 수 있습니다². 요로감염을 정확하게 진단할 수 있는 능력은 불필요한 항생제 사용을 줄임으로써 항생제 관리 노력을 개선하는 데 도움이 될 것이며, 잠재적으로 요로감염의 조기 진단을 지원하여 이환율의 위험을 줄이는 데 도움이 될 것입니다. 요로감염의 유병률을 감안할 때, 이 흔한 감염의 관리를 개선하는 데 상당한 관심이 있습니다.

문헌에는 UTI ^3,4,5,6,7을 진단할 수 있는 능력에 유망한 새로운 바이오마커가 증가하고 있습니다. 그러나 소변 샘플 처리와 관련된 몇 가지 요인이 결과를 바꿀 수 있습니다. 이러한 요인은 수집 방법, 단기 및 장기 보관 온도 및 기간, 가공 기술, 시약 사용, 동결-해동 주기⁸ 등에 이르기까지 다양합니다. 이들 각각의 변화가 바이오마커 판독에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것은 문헌 내의 연구를 비판적으로 해석하고 소변 바이오마커에 초점을 맞춘 고품질 연구를 설계하는 데 필요합니다.

여기에서는 채취 기술, 단기 및 장기 보관 온도 및 기간, 시약 사용, 동결-해동 주기의 효과를 포함한 각 요인이 소변 바이오마커로 유용하게 사용될 수 있는 단백질에 미치는 영향에 대한 문헌에 대한 서술적 검토를 제공하고 이 문헌 검토를 기반으로 최적의 처리를 위한 권장 사항을 제공합니다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 사용하여 측정된 단백질 바이오마커에 초점을 맞춥니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 연구를 위한 생물학적 표본을 수집하고 활용하기 전에 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았는지 확인하십시오.

1. 수집

1. 멸균 검체 컵에서 소변 샘플을 얻습니다. 소변 샘플의 유형과 특정 연구 설계에 따라 특정 포함 및 제외 기준을 결정합니다. 요로감염 검사의 경우, 회음부 오염을 방지하기 위해 클린 캐치 방법 또는 카테터 삽입을 사용하십시오.
2. 깨끗하게 잡힌 소변 샘플을 얻으려면 참가자들에게 수건으로 요도 주위 부위를 닦고 변기에 소량을 배뇨한 다음 검체 컵에 소변을 보도록 지시합니다.
3. 여성은 손가락을 사용하여 음순을 벌리도록 지시하고 남성은 오염을 방지하기 위해 배뇨 전에 포피(해당되는 경우)를 접도록 지시합니다.
4. 수집 시간을 기록합니다.
5. 개별 연구 설계 및 연구 질문에 따라 각 참가자로부터 관련 임상 데이터를 수집합니다.
6. 전자 건강 기록에서 이 데이터를 신뢰할 수 없는 경우 처리 및 보관하기 전에 각 샘플에 대해 소변 검사 또는 소변 딥스틱을 수행하는 것이 좋습니다.

2. 샘플 처리 및 보관

1. 샘플을 즉시 처리하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 샘플을 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하십시오.
2. 샘플을 4 ° C에서 보관할 수 없거나 24 시간보다 4 ° C에서 더 오래 보관해야하는 경우 샘플에 0.2 M 붕산 또는 10 mM NaN₃ 를 첨가하십시오. 이러한 시약이 계획된 다운스트림 응용 분야와 호환되는지 확인하십시오.
3. 샘플이 4°C에서 보낸 시간을 기록합니다.
4. 1000-1500 x g 에서 10-20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리는 4°C에서 할 필요가 없습니다.
5. 상층액을 모아 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.
6. 튜브에 여러 개의 명확한 식별자(예: 날짜 및 샘플 식별(ID))로 레이블을 지정합니다. -80°C에서 생물학적 시료를 보관하도록 특별히 설계된 컴퓨터 생성 바코드를 사용하는 것이 좋습니다. 사용할 수 없는 경우 샘플에 레이블을 지정하는 데 사용되는 펜이 방수가 되는지 확인하십시오.
7. 각 위치에 특정 코드가 있도록 각 냉동실 상자에 레이블을 지정합니다. 이를 위해 각 열에 다른 문자로 번호를 매기고 각 행에 숫자를 붙입니다. 이렇게 하면 샘플 위치를 쉽게 찾을 수 있도록 지도 또는 기타 가이드를 만들 수 있습니다.
8. 샘플을 즉시 -80 °C에서 동결하십시오. 동결 시간을 기록하십시오.
9. 측정 당일 37°C 수조에서 샘플을 해동하여 실온 또는 4°C에서 불필요한 보관을 최소화합니다.
10. 각 부분 표본에 대한 추가 동결-해동 주기의 시간과 횟수를 기록합니다.

3. 분석

1. 시중에서 판매되는 ELISA를 사용하는 경우 제조업체의 지침을 따르십시오.
2. 샘플을 복제하여 실행합니다.
3. 관심 단백질의 예상 농도를 식별하여 샘플의 단백질 수준이 키트 범위 내에 있는지 확인합니다. 예상되는 단백질 수준이 상한 기준을 초과하면 샘플을 희석합니다.
4. 플레이트 리더(ELISA) 또는 웨스턴 블롯에서 데이터를 얻은 후 수동으로(권장되지 않음) 또는 소프트웨어를 사용하여 샘플에서 각 바이오마커의 농도를 측정합니다.
5. 결과를 분석합니다. 데이터 분석은 개별 연구 설계에 따라 다릅니다.
6. 소변 농도를 설명하기 위해 바이오마커 값을 조정하는 것이 좋습니다.
   참고: 전통적으로 바이오마커 연구자들은 특히 정상적인 신장 기능을 가진 참가자의 경우 소변 농도를 설명하기 위해 소변 크레아티닌을 정상화 방법으로 사용해 왔습니다. 그러나 다른 사람들은 정규화가 결과에 차이를 만들지 않는다고 보고합니다⁴. 이 장애물을 극복하기 위해 일부 연구자들은 정규화된 결과와 정규화되지 않은 결과를 모두 보고합니다.
7. 시료 처리의 맥락에서 결과를 해석할 수 있도록 출판된 원고를 처리하기 전에 4°C에서의 시간뿐만 아니라 채취부터 동결까지의 시간 범위를 보고하는 것이 좋습니다(그림 1).

4. 호중구 젤라티나아제 관련 리포칼린(NGAL)에 대한 다양한 저장 조건의 효과.

1. 신선한 소변에 2ng/mL의 재조합 NGAL을 주입합니다.
2. 소변을 분취하고 다른 처리 및 보관 조건을 적용합니다.
   1. 1000-1500 x g 의 소변을 10-20분 동안 원심분리합니다. 원심분리는 4°C에서 할 필요가 없습니다. 다양한 조건(20°C, 4°C, -20°C)에서 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 보관하십시오.
   2. 비교를 위해 샘플의 부분 표본을 -80°C에 보관하십시오.
3. 4.2.1단계에서 언급한 대로 다양한 조건에서 샘플을 유지한 후 제조업체의 지침에 따라 대조군이 포함된 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 샘플의 NGAL 수준을 측정합니다.

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결과

원심분리는 NGAL 수치에 약간의 영향을 미쳤습니다. -80°C에서 보관된 원심분리 시료는 원심분리하지 않은 시료보다 NGAL 수치가 낮았습니다(2.17ng/mL ± 0.32ng/mL, 2.77ng/mL ± 0.21ng/mL). 동결 주기는 또한 세 번째 동결-해동 주기 이후의 NGAL 수준에도 영향을 미쳤습니다. (그림 2). 연구된 조건(원심분리, 동결-해동 주기 및 보관 온도) 중에서 보관 온도가 NGAL 수...

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토론

일관되고 재현 가능한 결과를 도출하는 것의 중요성은 개별 연구의 성공에만 국한되지 않고 문헌 내 결과를 더 잘 비교할 수 있게 해준다⁹. 주요 절차적 단계에서 연구 간의 차이는 바이오마커 신호와 그 해석에 영향을 미칠 수 있는 비가역적 편향을 유발할 수 있으며, 이는 여러 연구에서 불일치의 원인이 될 수 있다¹⁰. 이는 바이오마?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies