Consideración de la recolección, el procesamiento y el almacenamiento para la investigación de biomarcadores urinarios

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar consideraciones para la recolección, el procesamiento y el almacenamiento de muestras de orina para estudios de biomarcadores de infección del tracto urinario.

Resumen

Hay varias proteínas urinarias que se muestran prometedoras como nuevos marcadores de infecciones del tracto urinario. La identificación de un nuevo biomarcador que tenga una mayor precisión predictiva en comparación con los métodos de diagnóstico actuales tiene el potencial de mejorar en gran medida la capacidad de manejo de los pacientes con infecciones del tracto urinario. Sin embargo, la recolección, el procesamiento y el almacenamiento de muestras pueden afectar potencialmente los resultados de la investigación de biomarcadores. Es necesario comprender los efectos de cada una de estas etapas en los estudios de biomarcadores para informar futuras investigaciones de alta calidad en esta área, así como para revisar críticamente otros estudios en esta área. Aquí, el estudio revisa la literatura sobre los efectos de cada etapa del procesamiento de muestras de orina e informa sobre los efectos de diversas afecciones en las proteínas urinarias. El protocolo se centrará en las técnicas de recolección, el tiempo y la temperatura de almacenamiento, las técnicas de procesamiento, el uso de reactivos y la congelación a largo plazo en la estabilidad de los biomarcadores. Se centrará en las proteínas, pero discutirá brevemente otros materiales que pueden utilizarse en la investigación de biomarcadores. De este modo, este protocolo proporcionará una guía a futuros investigadores para ayudar en el diseño de estudios de biomarcadores urinarios.

Introducción

Las infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones bacterianas más comunes tanto en niños como en adultos¹. Si bien el diagnóstico de ITU en algunas poblaciones puede ser sencillo, puede ser más complejo en otras, como las personas con vejigas neuropáticas². La capacidad de diagnosticar con precisión las infecciones urinarias ayudará a mejorar los esfuerzos de administración de antibióticos al disminuir el uso de antibióticos innecesarios y, potencialmente, ayudará en el diagnóstico temprano de las infecciones urinarias, disminuyendo así el riesgo de morbilidad. Dada la prevalencia de infecciones urinarias, existe un gran interés en mejorar el tratamiento de esta infección común.

Existe un número cada vez mayor de nuevos biomarcadores en la literatura que se muestran prometedores en su capacidad para diagnosticar ITU 3,4,5,6,7. Sin embargo, hay varios factores asociados con el procesamiento de muestras de orina que tienen el potencial de alterar los resultados. Estos factores van desde los métodos de recolección, la temperatura y la duración del almacenamiento a corto y largo plazo, las técnicas de procesamiento, el uso de reactivos y los ciclos de congelación y descongelación⁸. Comprender cómo los cambios en cada uno de estos pueden afectar las lecturas de biomarcadores es necesario tanto para interpretar críticamente la investigación dentro de la literatura, como para diseñar estudios de alta calidad centrados en los biomarcadores de orina.

Aquí, se proporciona una revisión narrativa de la literatura sobre los efectos de cada factor, incluidas las técnicas de recolección, la temperatura y la duración del almacenamiento a corto y largo plazo, el uso de reactivos y el efecto de los ciclos de congelación y descongelación, sobre las proteínas que pueden tener utilidad como biomarcadores de orina y proporciona recomendaciones para un procesamiento óptimo basadas en esta revisión de la literatura. Este protocolo se centrará en los biomarcadores de proteínas medidos mediante Western blots o ELISA.

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Protocolo

Este protocolo sigue los lineamientos del comité de ética en investigación en seres humanos de la institución. Asegurarse de que se obtenga la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB, por sus siglas en inglés) antes de la recolección y utilización de especímenes biológicos para la investigación.

1. Colección

1. Obtenga una muestra de orina en un recipiente estéril para muestras. Decidir el tipo de muestra de orina, así como los criterios específicos de inclusión y exclusión, en función del diseño específico del estudio. Para los estudios de infecciones urinarias, utilice el método de captura limpia o el cateterismo para evitar la contaminación perineal.
2. Para obtener una muestra de orina limpia, indique a los participantes que limpien el área periuretral con una toallita, vacíen una pequeña cantidad en el inodoro y luego orinen en el recipiente de muestras.
3. Indique a las mujeres que usen sus dedos para separar los labios y a los hombres que retraigan su prepucio (si corresponde) antes de orinar para evitar la contaminación.
4. Registre la hora de recogida.
5. Recopilar los datos clínicos relevantes de cada participante, según lo requiera el diseño del estudio individual y la pregunta de investigación.
6. Considere realizar un análisis de orina o una tira reactiva de orina en cada muestra antes del procesamiento y almacenamiento si estos datos no están disponibles de manera confiable en la historia clínica electrónica.

2. Procesamiento y almacenamiento de muestras

1. Procese las muestras inmediatamente. Si esto no es posible, almacene la muestra a 4 °C durante un máximo de 24 h.
2. Si las muestras no pueden almacenarse a 4 °C o es necesario almacenarlas a 4 °C durante más de 24 h, añada ácido bórico 0,2 M o NaN₃ 10 mM a las muestras. Compruebe que dichos reactivos son compatibles con las aplicaciones posteriores planificadas.
3. Registre la duración del tiempo que las muestras pasan a 4 °C.
4. Centrifugar las muestras a 1000-1500 x g durante 10-20 min. No es necesario que la centrifugación sea a 4 °C.
5. Recoja el sobrenadante y alícuota en tubos de microcentrífuga separados.
6. Etiquete los tubos con múltiples identificadores transparentes (como la fecha y la identificación de la muestra (ID)). Considere la posibilidad de utilizar códigos de barras generados por ordenador diseñados específicamente para el almacenamiento de muestras biológicas a -80 °C. Si no está disponible, asegúrese de que el bolígrafo utilizado para etiquetar las muestras sea resistente al agua.
7. Etiquete cada caja del congelador de manera que cada ubicación tenga un código específico. Para ello, numere cada columna con una letra diferente y cada fila con un número. Esto permitirá la creación de mapas u otras guías para facilitar la localización de las muestras.
8. Congele las muestras inmediatamente a -80 °C. Registre el tiempo de congelación.
9. Descongele las muestras en un baño de agua a 37 °C el día de la medición para minimizar el almacenamiento innecesario a temperatura ambiente o a 4 °C.
10. Registre los tiempos y el número de ciclos de congelación-descongelación adicionales para cada alícuota.

3. Análisis

1. Cuando utilice ELISA disponibles en el mercado, siga las instrucciones del fabricante.
2. Ejecute las muestras por duplicado.
3. Identifique la concentración esperada de la proteína de interés para asegurarse de que los niveles de proteína en las muestras se encuentren dentro del rango del kit. Si el nivel esperado de proteína excede el estándar superior, diluya las muestras.
4. Después de obtener los datos del lector de placas (ELISA) o del Western blot, determine la concentración de cada biomarcador en la muestra manualmente (no se recomienda) o utilizando cualquier software.
5. Analiza los resultados. El análisis de los datos depende del diseño individual del estudio.
6. Considere ajustar los valores de los biomarcadores para tener en cuenta la concentración de orina.
   NOTA: Tradicionalmente, los investigadores de biomarcadores han utilizado la creatinina en orina como método de normalización, especialmente en participantes con función renal normal, para explicar la concentración de orina. Sin embargo, otros informan que la normalización no hace una diferencia en los resultados⁴. Para superar este obstáculo, algunos investigadores informan resultados normalizados y no normalizados.
7. Recomendar que se informen los intervalos de tiempo desde la recolección hasta la congelación, así como la duración del tiempo a 4 °C antes del procesamiento en los manuscritos publicados para permitir la interpretación de los resultados en el contexto del procesamiento de muestras (Figura 1)

4. Efecto de diversas condiciones de almacenamiento sobre la lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (NGAL).

1. Aumente la orina fresca con 2 ng/mL de NGAL recombinante.
2. Alícuota la orina y someterla a diferentes condiciones de procesamiento y almacenamiento.
   1. Centrifugar la orina a 1000-1500 x g durante 10-20 min. No es necesario que la centrifugación sea a 4 °C. Almacenar en diferentes condiciones (20 °C, 4 °C, -20 °C) durante 24 h, 48 h o 72 h.
   2. Almacene la alícuota de la muestra a -80 °C para su comparación.
3. Después de mantener las muestras en las diferentes condiciones mencionadas en el paso 4.2.1, mida los niveles de NGAL en las muestras utilizando un kit de ELISA disponible en el mercado que incluya los controles según las instrucciones del fabricante.

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Resultados

La centrifugación tuvo un pequeño impacto en los niveles de NGAL. Las muestras centrifugadas almacenadas a -80 °C tenían niveles más bajos de NGAL que las muestras no centrifugadas (2,17 ng/mL ± 0,32 ng/mL, 2,77 ng/mL ± 0,21 ng/mL). Los ciclos de congelación también tuvieron un impacto en los niveles de NGAL después del tercer ciclo de congelación-descongelación. (Figura 2). De las condiciones estudiadas (centrifugación, ciclos de congelación-d...

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Discusión

La importancia de producir resultados consistentes y reproducibles no se limita al éxito de los estudios individuales, sino que también permitirá una mejor comparación de los resultados dentro de la literatura⁹. La variación entre estudios en etapas clave del procedimiento puede introducir sesgos irreversibles que pueden afectar las señales de los biomarcadores y su interpretación, lo que puede ser responsable de discrepancias entre varios estudios

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Freezer boxes	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifuge tubes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Used to create representative results
Pipette and tips	Dependent on pipette size and volume of fluid.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	To be considered for samples that cannot be rapidly processed and frozen
Urine collection cups	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterile cups not required unless needed for other studies