JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سرطان الجلد هو مرض عدواني للغاية ينتشر بسرعة إلى الأعضاء الأخرى. يصف هذا البروتوكول تطبيق التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد ، إلى جانب تقديم 3D ، لمراقبة حجم الغدد الليمفاوية الإربية في نموذج الفأر Braf / Pten للسرطان الميلانيني النقيلي.

Abstract

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox الفئران المهندسة وراثيا (الفئران Braf/Pten) تستخدم على نطاق واسع كنموذج في الجسم الحي للسرطان الميلانيني النقيلي. بمجرد تحفيز الورم الأولي عن طريق علاج تاموكسيفين ، لوحظت زيادة في العبء النقيلي في غضون 4-6 أسابيع بعد الحث. توضح هذه الورقة كيف يمكن استغلال التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد (UHFUS) لمراقبة الزيادة في المشاركة النقيلية للعقد الليمفاوية الإربية عن طريق قياس الزيادة في حجمها.

يستخدم نظام UHFUS لمسح الفئران المخدرة باستخدام مسبار خطي UHFUS (22-55 ميجاهرتز ، دقة محورية 40 ميكرومتر). يتم الحصول على صور الوضع B من الغدد الليمفاوية الإربية (الجانبين الأيسر والأيمن) في عرض قصير المحور ، مما يضع الحيوانات في حالة استلقاء ظهري. يتم الحصول على سجلات الموجات فوق الصوتية باستخدام حجم خطوة 44 ميكرومتر على ذراع ميكانيكية آلية. بعد ذلك ، يتم استيراد عمليات الاستحواذ ثنائية الأبعاد (2D) B-mode إلى منصة البرامج الخاصة بالمعالجة اللاحقة لصور الموجات فوق الصوتية ، ويتم تحديد الغدد الليمفاوية الإربية وتقسيمها بشكل شبه تلقائي في الصور ثنائية الأبعاد المقطعية المستعرضة المكتسبة. أخيرا ، يتم الحصول على إعادة بناء كاملة لحجم ثلاثي الأبعاد (3D) تلقائيا إلى جانب تقديم حجم العقدة الليمفاوية ، والذي يتم التعبير عنه أيضا كقياس مطلق.

هذه التقنية غير الغازية في الجسم الحي جيدة التحمل للغاية وتسمح بجدولة جلسات تصوير متعددة على نفس التجارب على مدار 2 أسابيع. لذلك ، من المثالي تقييم تأثير العلاج الدوائي على المرض النقيلي.

Introduction

سرطان الجلد هو شكل عدواني من سرطان الجلد الذي ينتشر غالبا إلى مواقع جلدية أخرى (النقائل تحت الجلد)، وكذلك إلى الغدد الليمفاوية والرئتين والكبد والدماغ والعظام1. في العقد الماضي ، تم إدخال أدوية جديدة في الممارسة السريرية وساهمت في تحسين متوسط العمر المتوقع لمرضى سرطان الجلد النقيلي. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود، بما في ذلك الوقت المتغير ودرجة الاستجابة، والآثار الجانبية الشديدة، وتمرد المقاومة المكتسبة1. لذلك ، من الأهمية بمكان اكتشاف الانتشار النقيلي في مراحله المبكرة ، أي عندما يصل إلى الغدد الليمفاوية المحلية.

عادة ما يتم إجراء خزعة من الغدد الليمفاوية المحلية (الغدد الليمفاوية الخافرة) للتحقق من وجود خلايا سرطان الجلد. ومع ذلك ، فإن التصوير بالموجات فوق الصوتية يترسخ كطريقة غير جراحية للكشف عن تورط النقيلي ، لأنه يتفوق على التقييم السريري ويمكن أن يساعد في تجنب خزعة غير ضرورية2،3،4. علاوة على ذلك ، يبدو التصوير بالموجات فوق الصوتية مناسبا لمراقبة العقدة الليمفاوية ، خاصة في حالة التقدم في العمر و / أو الأمراض المصاحبة5,6. تشمل الميزات التي يتم اكتشافها عن طريق التحليل بالموجات فوق الصوتية والتي تسمح بالتفريق بين الغدد الليمفاوية الطبيعية والنقيلية زيادة الحجم (الحجم) ، وتغيير الشكل من البيضاوي إلى الدائري ، والهامش غير المنتظم ، وتغيير نمط الصدى ، وتغيير (زيادة) الأوعية الدموية 7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox الفئران المهندسة وراثيا (فئران Braf/Pten) تم توفيرها مؤخرا للمجتمع العلمي كنموذج خاص بالأنسجة ومستحث للسرطان الميلانيني النقيلي8. في هذا النموذج الحيواني ، تتطور الأورام الأولية بسرعة كبيرة: تصبح مرئية في غضون 2-3 أسابيع بعد تحريض التحول من النوع البري (wt) Braf إلى BrafV600E وفقدان Pten ، بينما تصل إلى حجم 50-100 مم 3 في غضون 4 أسابيع. في الأسابيع التالية 2 ، يرافق نمو الورم الأساسي زيادة تدريجية في العبء النقيلي في مواقع الجلد الأخرى والغدد الليمفاوية والرئتين.

تم استخدام فئران Braf / Pten على نطاق واسع لأغراض متعددة بما في ذلك تشريح مسارات الإشارات المشاركة في تكوين سرطان الجلد9,10 ، وتحديد خلايا سرطان الجلد من المنشأ11,12,13 ، واختبار خيارات علاجية جديدة من حيث كل من العلاج المستهدف والعلاج المناعي8,14,15,16 . على وجه التحديد ، استخدمنا الفئران Braf / Pten لإثبات أن الليستيريا الأحادية الموهنة (Lmat) تعمل كلقاح مضاد لسرطان الجلد. عندما تدار بشكل منهجي في الإعداد العلاجي ، لا يرتبط Lmat بالسمية الكلية لأنه يتراكم بشكل انتقائي في مواقع الورم. علاوة على ذلك ، فإنه يسبب انخفاضا ملحوظا في كتلة سرطان الجلد الأولي وانخفاضا في العبء النقيلي في الغدد الليمفاوية والرئتين. على المستوى الجزيئي ، يسبب Lmat قتلا استماتيا لخلايا سرطان الجلد ، والذي يرجع ، جزئيا على الأقل ، إلى الأنشطة غير المستقلة للخلايا (التوظيف في الموقع للخلايا الليمفاوية CD4 + و CD8 + T)16.

عندما يتم استخدام الفئران Braf / Pten لنمذجة سرطان الجلد ، يمكن مراقبة نمو الأورام الأولية والنقائل تحت الجلد عن طريق قياسات الفرجار. ومع ذلك ، يجب التحقيق في تورط الغدد الليمفاوية والرئتين باستخدام تقنية بديلة ، ربما تقنية غير غازية تسمح للباحثين بمتابعة نفس الحيوان بمرور الوقت. تصف هذه الورقة استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية (الشكل 1) ، إلى جانب التحليل الحجمي 3D اللاحق للبيانات التي تم الحصول عليها ، للمراقبة الطولية للزيادة في حجم (حجم) الغدد الليمفاوية الأربية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل وزارة الصحة الإيطالية (بروتوكولات الحيوانات # 754/2015-PR و # 684/2018-PR).

1. تحريض سرطان الجلد

ملاحظة: تم استخدام الفئران Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] في هذه الدراسة (انظر جدول المواد).

  1. عالج الفئران ب 4-hydroxytamoxifen (4-HT) عن طريق تطبيق 3 ميكرولتر من 5 mM 4-HT على ~ 1 سم 2 من الجلد الحليق في الجزء العلوي من الظهر ، كما هو موضح سابقا11،16،17 ، لمدة 3 أيام متتالية.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تنشيط إنزيم Cre ويسبب التبديل من wt Braf إلى BrafV600E وفقدان Pten. هاتان الضربتان كافيتان للحث على تكوين سرطان الجلد.
  2. لاحظ أن الأورام الأولية تتطور في موقع طلاء الجلد في غضون 2-3 أسابيع وتصل إلى حجم 50-100 مم 3 في 4 أسابيع. أيضا ، لاحظ النقائل إلى مواقع الجلد الأخرى والغدد الليمفاوية والرئتين في هذه النقطة الزمنية (t0).
  3. استخدم الفرجار لقياس حجم الورم الأساسي والنقائل تحت الجلد، والتصوير بالموجات فوق الصوتية لقياس حجم الغدد الليمفاوية الأربية. كرر هذه القياسات بعد أسبوع واحد (t1 ، 5 أسابيع بعد طلاء الجلد) وبعد أسبوعين (t2 ، 6 أسابيع بعد طلاء الجلد).
  4. في آخر نقطة زمنية ، القتل الرحيم للفئران عن طريق جرعة زائدة مع سيفوران الغازية.
  5. تحليل الورم الأولي والغدد الليمفاوية عن طريق الفحص البصري ، ثم استئصالها للدراسات النسيجية ، كما ورد في 16.

2. إجراء التصوير

  1. ضع الفأر في غرفة تحريض لتخدير الغاز وقم بتزويد 3٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين النقي حتى يتم تخدير الحيوان بالكامل. تحقق من عمق التخدير عن طريق عدم الاستجابة لقرصة مخلب.
  2. انقل الحيوان إلى لوحة ساخنة - وهي جزء أساسي من محطة التصوير UHFUS - مع إبقاء الحيوان في وضع ضعيف. استخدم مسبارا مستقيميا مشحم بالفازلين لقياس درجة حرارة الجسم. اضبط درجة حرارة اللوحة للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس في النطاق الفسيولوجي (36 ± 1 درجة مئوية).
  3. بلل عيون الفأر بمرهم بيطري لمنع الجفاف أثناء التخدير. توفير الغاز المخدر (1.5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين النقي) من خلال قناع أنف الماوس. اضبط النسبة المئوية للأيزوفلوران للحفاظ على العمق الصحيح للتخدير.
  4. قم بتغطية الكفوف الأمامية والخلفية بعجينة موصلة وقم بلصقها على أقطاب لوحة ECG المضمنة في اللوحة. تحقق من أن المعلمات الفسيولوجية (معدل ضربات القلب وإشارة التنفس ودرجة حرارة الجسم الأساسية) يتم الحصول عليها وعرضها بشكل صحيح.
  5. قم بإزالة الشعر من كلتا المنطقتين الإربيتين عن طريق تطبيق عامل مزيل للشعر وتغطيته بوسط اقتران صوتي.
  6. قم بتثبيت المسبار الخطي UHFUS (تردد مركز 40 ميجاهرتز) في محرك 3D متخصص مضمن في محطة التصوير UHFUS ، مما يسمح بالحركة الآلية والتدريجية للمسبار.
  7. قم بتوجيه وضبط موضع مسبار الموجات فوق الصوتية بشكل صحيح للحصول على صور قصيرة المحور للعقدة الليمفاوية الإربية (اليسار / اليمين) ، ووضع المنطقة ذات الأهمية في المنطقة البؤرية.
  8. امسح الحجم الكامل للعقدة الليمفاوية الإربية كسلسلة من صور الوضع B 2D ، كما هو موضح سابقا18. الحصول على صور على مستويات متعددة من العقدة الليمفاوية عن طريق الحركة الخطية لمحول الطاقة مع أحجام الخطوة على مقياس ميكرومتر، لتوليد بيانات 3D من حيث التنفس تلقائيا وحلقات سينمائية بوابات القلب.
  9. اضبط تسجيل الصورة باستخدام المعلمات التالية: مسافة المسح الضوئي التي تتراوح بين 2 و 5 مم (اعتمادا على حجم العقدة الليمفاوية) ؛ حجم الخطوة 44 ميكرومتر ، مع نتيجة 46-114 خطوات المسح / شرائح العقدة الليمفاوية ووقت اكتساب 1-3 دقيقة لكل. قم بتخزين الصور التي تم الحصول عليها رقميا بتنسيق خام (DICOM) لمزيد من التحليلات في وضع عدم الاتصال.
  10. في نهاية جلسة التصوير ، توقف عن تخدير الغاز واسمح للحيوان بالتعافي على لوحة التسخين في حالة العبء القصي. اعتن بالحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الوضع المعرض.

3. ما بعد معالجة الصور بالموجات فوق الصوتية

  1. افتح مجموعة بيانات صور DICOM 3D للعقدة الليمفاوية الإربية اليسرى / اليمنى في منصة البرنامج لمرحلة ما بعد المعالجة اللاحقة لصور الموجات فوق الصوتية.
  2. تجزئه:
    1. حدد طريقة متعددة الشرائح لتصور كل من الإطارات الحالية والصور المصغرة لجميع الإطارات المقابلة لكل صورة تم التقاطها أثناء اكتساب 3D.
    2. حدد الصورة المصغرة للإطار الأول لتحميله في طريقة عرض الكنتوري. في طريقة عرض الكنتوري ، انقر بزر الماوس الأيسر لإسقاط النقاط على طول حدود العقدة الليمفاوية. بمجرد تعيين العدد المطلوب من النقاط (النطاق 10-15) ، انقر بزر الماوس الأيمن لإكمال المحيط.
    3. بعد اكتمال الكفاف الأول، استخدم طريقة عرض الصورة المصغرة لتحديد الصورة التالية للكفاف. إذا لزم الأمر، تخطي عدة صور (متوسط 3 إطارات) بين الخطوط لتقليل عدد التأثيرات اليدوية اللازمة لكل وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: ستقوم المنصة البرمجية للمعالجة اللاحقة للصور بالموجات فوق الصوتية تلقائيا بإنشاء ملامح بين التتبع اليدوي ، مما يقلل من وقت التحليل.
    4. كرر هذه العملية حتى يتم تحديد وحدة التخزين بأكملها. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق إنهاء.
  3. توليد الإطار السلكي 3D وقياس الحجم:
    1. أثناء وجودك في مساحة عمل نافذة وضع 3D ، انقر فوق رمز قياس مستوى الصوت أسفل منطقة عرض الصورة لتنشيط عرض السطح.
      ملاحظة: تقوم طريقة العرض السطحية بإنشاء طريقة عرض تجميع تقوم بتعيين وحدة التخزين التي ينشئها المستخدم إلى الصورة التي تم الحصول عليها. يمكن تدوير عرض السطح في أي موضع مطلوب.
    2. لاحظ قياس الحجم المدرج في الزاوية السفلية اليسرى من طريقة عرض المكعب.
      ملاحظة: يمكن أيضا الحصول على التجزئة وتوليد حجم 3D باستخدام برنامج مطور خصيصا و / أو برنامج تجاري متاح مجانا لمعالجة الصور العامة. بدءا من التجزئة اليدوية ، يجب أن يوفر البرنامج وصفا رياضيا و / أو على مستوى البكسل لملامح العقدة الليمفاوية. سيتم الجمع بين هذه الخطوط في مساحة 3D لجعل السطح الخارجي للعقد الليمفاوية. يتم تلخيص جميع الخطوات الموضحة في إجراء التصوير وما بعد المعالجة لصور الموجات فوق الصوتية في الشكل 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد طلاء الجلد من Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox الفئران مع 4-HT, يتم تحفيز نشاط Cre, بسبب وجود تحول على المستوى الجينومي من wt Braf إلى BrafV600E, في حين يتم فقدان Pten (الشكل 3A). في غضون 2-3 أسابيع ، تطور الفئران أورام أولية في الموقع مع اختراق 100٪. بعد أربعة أسابيع من علاج 4-HT (t0) ، ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تشهد البيانات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة على قدرة التصوير بالموجات فوق الصوتية على مراقبة المشاركة النقيلية للعقد الليمفاوية الإربية لنموذج الفأر Braf / Pten للسرطان الميلانيني النقيلي. كما هو موضح سابقا16 ، هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لتقييم فعالية العلاج بالعقاقير. هذا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا س. بورشيلي (FTGM، بيزا) على مساعدتها في الإجراءات المتعلقة بالحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica التمويل المؤسسي ل LP ؛ MFAG # 17095 منحت من قبل AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro إلى LP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxytamoxifenMerckH6278drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) miceThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiaophthalmic solution gel
BRAFV600E antibodySpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetisliquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibodyThermo Fisher ScientificM2-7C10
Sigma gelParkerelectrode gel
Transonic gel clearTelic SAUultrasound gel
VeetReckitt Benckiser ITdepilatory cream
Compact Dual Anesthesia SystemFujifilm, Visualsonics Inc.Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS linear probe
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS system
Vevo Imaging StationFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.software platform for ultrasound image post-processing

References

  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 Braf Pten 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved