JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Меланома – очень агрессивное заболевание, которое быстро распространяется на другие органы. Этот протокол описывает применение ультравысокочастотной ультразвуковой визуализации в сочетании с 3D-рендерингом для мониторинга объема паховых лимфатических узлов в мышиной модели метастатической меланомы Брафа / Птена.

Аннотация

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox генетически модифицированные мыши (мыши Braf/Pten) широко используются в качестве модели in vivo метастатической меланомы. После того, как первичная опухоль была индуцирована лечением тамоксифеном, увеличение метастатической нагрузки наблюдается в течение 4-6 недель после индукции. В этой статье показано, как ультравысокочастотная ультразвуковая (UHFUS) визуализация может быть использована для мониторинга увеличения метастатического поражения паховых лимфатических узлов путем измерения увеличения их объема.

Система UHFUS используется для сканирования обезболенных мышей с помощью линейного зонда UHFUS (22-55 МГц, осевое разрешение 40 мкм). Изображения B-режима из паховых лимфатических узлов (как с левой, так и с правой стороны) получаются в виде с короткой осью, позиционируя животных в дорсальной лежачем положении. Ультразвуковые записи приобретаются с использованием шага размером 44 мкм на моторизованной механической руке. После этого двухмерные (2D) B-режимы импортируются в программную платформу для постобработки ультразвуковых изображений, а паховые лимфатические узлы идентифицируются и сегментируются полуавтоматически в полученных поперечных 2D-изображениях. Наконец, автоматически получается полная реконструкция трехмерного (3D) объема вместе с визуализацией объема лимфатического узла, что также выражается в виде абсолютного измерения.

Этот неинвазивный метод in vivo очень хорошо переносится и позволяет планировать несколько сеансов визуализации на одном и том же экспериментальном животном в течение 2 недель. Поэтому идеально оценивать влияние фармакологического лечения на метастатическое заболевание.

Введение

Меланома является агрессивной формой рака кожи, которая часто распространяется на другие участки кожи (подкожные метастазы), а также на лимфатические узлы, легкие, печень, мозг и кости1. В последнее десятилетие в клиническую практику были введены новые препараты, которые способствовали улучшению продолжительности жизни пациентов с метастатической меланомой. Тем не менее, ограничения остаются, включая переменное время и степень реакции, серьезные побочные эффекты и рост приобретенной резистентности1. Поэтому крайне важно обнаружить метастатическое распространение на ранних стадиях, т. е. когда оно попадает в местные лимфатические узлы.

Биопсия местных лимфатических узлов (сторожевых лимфатических узлов) обычно проводится для проверки наличия клеток меланомы. Тем не менее, ультразвуковая визуализация закрепляется как неинвазивный метод обнаружения метастатического поражения, поскольку она превосходит клиническую оценку и может помочь избежать ненужной биопсии2,3,4. Кроме того, ультразвуковая визуализация представляется подходящей для наблюдения за лимфатическими узлами, особенно в случае пожилого возраста и / или сопутствующих заболеваний5,6. Признаки, которые выявляются ультразвуковым анализом и позволяют дифференцировать нормальные и метастатические лимфатические узлы, включают увеличение размера (объема), изменение формы от овала до круглого, неправильное краевое, измененный эхогенный рисунок и измененную (повышенную) васкуляризацию7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox генетически модифицированные мыши (мыши Braf/Pten) недавно стали доступны научному сообществу в качестве тканеспецифической и индуцируемой модели метастатической меланомы8. В этой животной модели первичные опухоли развиваются очень быстро: они становятся видимыми в течение 2-3 недель после индукции перехода с брафа дикого типа (wt) на BrafV600E и потери Pten, при этом они достигают объема 50-100 мм3 в течение 4 недель. В последующие 2 недели рост первичной опухоли сопровождается прогрессирующим увеличением метастатической нагрузки на другие участки кожи, лимфатические узлы, легкие.

Мыши Braf/Pten широко использовались для различных целей, включая рассечение сигнальных путей, участвующих в меланомагенезе9,10, идентификацию клеток меланомы происхождения11,12,13 и тестирование новых терапевтических вариантов с точки зрения как таргетной терапии, так и иммунотерапии8,14,15,16 . В частности, мы использовали мышей Braf / Pten, чтобы продемонстрировать, что ослабленный Listeria monocytogenes (Lmat) работает как вакцина против меланомы. При систематическом введении в терапевтических условиях Lmat не связан с общей токсичностью, поскольку он избирательно накапливается в опухолевых участках. Кроме того, это вызывает заметное снижение массы первичной меланомы и снижение метастатической нагрузки в лимфатических узлах и легких. На молекулярном уровне Lmat вызывает апоптотическое уничтожение клеток меланомы, что обусловлено, по крайней мере частично, неэлементно-автономной деятельностью (рекрутирование на месте CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов)16.

Когда мыши Braf / Pten используются для моделирования меланомы, рост первичных опухолей и подкожных метастазов может контролироваться с помощью измерений суппорта. Тем не менее, вовлечение лимфатических узлов и легких должно быть исследовано с использованием альтернативной техники, возможно, неинвазивной, которая позволяет исследователям следить за одним и тем же животным с течением времени. В данной работе описано использование ультразвуковой визуализации (рисунок 1) в сочетании с последующим 3D объемным анализом полученных данных, для продольного мониторинга увеличения размеров (объема) паховых лимфатических узлов.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Министерством здравоохранения Италии (протоколы для животных #754/2015-PR и #684/2018-PR).

1. Индукция меланомы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались шестинедельные мыши Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (см. Таблицу материалов).

  1. Обрабатывайте мышей 4-гидрокситамоксифеном (4-HT), нанося 3 мкл 5 мМ 4-HT на ~1 см2 бритой кожи верхней части спины, как описано ранее11,16,17, в течение 3 дней подряд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это активирует фермент Cre и вызовет переключение с wt Braf на BrafV600E и потерю Pten. Этих двух попаданий достаточно, чтобы вызвать образование меланомы.
  2. Наблюдают, что первичные опухоли развиваются в месте окрашивания кожи через 2-3 недели и достигают объема 50-100 мм3 через 4 недели. Кроме того, наблюдайте метастазы в другие участки кожи, лимфатические узлы и легкие в этот момент времени (t0).
  3. Используйте суппорты для измерения объема первичной опухоли и подкожных метастазов, а ультразвуковую визуализацию для измерения объема паховых лимфатических узлов. Повторяют эти измерения через одну неделю (t1, 5 недель после покраски кожи) и через две недели (t2, 6 недель после окрашивания кожи).
  4. В последний момент времени усыпляют мышей путем передозировки газообразным севораном.
  5. Анализируют первичную опухоль и лимфатические узлы путем визуального осмотра, затем иссекают их для гистологических исследований, о чем сообщается в 16.

2. Процедура визуализации

  1. Поместите мышь в индукционную камеру для газовой анестезии и подайте 3% изофлурана в чистый кислород до тех пор, пока животное не будет полностью обезболено. Проверьте глубину анестезии по отсутствию реакции на ущемление лапы.
  2. Переведите животное на подогреваемую доску - составную часть станции визуализации UHFUS - удерживая животное в лежачем положении. Используйте ректальный зонд, смазанный вазелином, для измерения температуры тела. Отрегулируйте температуру доски, чтобы поддерживать температуру тела мыши в физиологическом диапазоне (36 ± 1°C).
  3. Смочите глаза мыши ветеринарной мазью, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Подайте наркотический газ (1,5% изофлурана в чистом кислороде) через маску носа мыши. Отрегулируйте процентное содержание изофлурана для поддержания правильной глубины анестезии.
  4. Покройте передние и задние лапы проводящей пастой и приклейте их к электродам пластины ЭКГ, встроенным в доску. Убедитесь, что физиологические параметры (частота сердечных сокращений, сигнал дыхания и температура тела ядра) правильно получены и отображены.
  5. Удалите волосы с обеих паховых областей, нанеся средство для депиляции и покрывайте их акустической связующей средой.
  6. Зажмите линейный зонд UHFUS (центральная частота 40 МГц) в специализированный 3D-двигатель, встроенный в станцию визуализации UHFUS, что позволит автоматизировать и ступенчато перемещать зонд.
  7. Правильно сориентируйте и отрегулируйте положение ультразвукового зонда для получения короткоосевых изображений пахового лимфатического узла (слева / справа) и поместите интересующую область в фокальную зону.
  8. Сканируйте весь объем пахового лимфатического узла в виде последовательности 2D B-режимных изображений, как описано ранее18. Получение изображений на нескольких уровнях лимфатического узла путем линейного движения датчика с размерами шагов в микрометровом масштабе для получения 3D-данных с точки зрения автоматических циркулей дыхания и сердца.
  9. Установите запись изображения со следующими параметрами: расстояние сканирования в диапазоне от 2 до 5 мм (в зависимости от размера лимфатических узлов); размер шага 44 мкм, с результатом 46-114 шагов сканирования / срезов лимфатических узлов и временем сбора 1-3 мин на животное. Цифровое хранение полученных изображений в необработанном формате (DICOM) для дальнейшего автономного анализа.
  10. В конце сеанса визуализации прекратите газовую анестезию и позвольте животному восстановиться на нагревательной доске в грудинном лежачем положении. Заботьтесь о животном до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание, чтобы сохранить положение лежа.

3. Постобработка ультразвуковых изображений

  1. Откройте набор данных DICOM 3D изображений левого/правого пахового лимфатического узла в программной платформе для постобработки ультразвукового изображения.
  2. Сегментация:
    1. Выберите «Многосрезовый метод», чтобы визуализировать как текущие кадры, так и миниатюры всех кадров, соответствующих каждому изображению, снятому во время 3D-съемки.
    2. Выберите эскиз первого кадра, чтобы загрузить его в контурное представление. В контурном виде щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сбросить точки вдоль границы лимфатического узла. После установки нужного количества точек (диапазон 10-15) щелкните правой кнопкой мыши, чтобы завершить контур.
    3. После завершения первого контура используйте представление эскизов, чтобы выбрать следующее изображение для контурирования. При необходимости пропустите несколько изображений (в среднем 3 кадра) между контурами, чтобы уменьшить количество ручных трассировок, необходимых для каждого 3D-тома.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программная платформа для постобработки ультразвукового изображения будет автоматически генерировать контуры между ручными следами, тем самым сокращая время анализа.
    4. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет выделен весь том. После завершения нажмите кнопку Готово.
  3. Генерация 3D каркаса и измерения объема:
    1. Находясь в рабочем пространстве окна 3D-режима , щелкните значок измерения громкости под областью отображения изображения, чтобы активировать вид поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представление поверхности создает представление компиляции, которое сопоставляет созданный пользователем том с полученным изображением. Вид поверхности можно повернуть в любое желаемое положение.
    2. Обратите внимание на измерение объема, указанное в левом нижнем углу представления куба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация и генерация 3D-объемов также могут быть получены с использованием специально разработанного программного обеспечения и/или свободно доступного/коммерческого программного обеспечения для общей обработки изображений. Начиная с ручной сегментации, программное обеспечение должно предоставлять математическое и/или пиксельное описание контуров лимфатических узлов. Эти контуры будут объединены в 3D-пространстве для визуализации внешней поверхности лимфатических узлов. Все этапы, описанные в процедуре визуализации и последующей обработки ультразвуковых изображений, обобщены на рисунке 2.

Результаты

После окраски кожи Мышей Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox с 4-HT индуцируется активность Cre, из-за чего происходит переключение на геномном уровне с wt Braf на BrafV600E, при этом Pten теряется (рисунок 3A). Через 2-3 недели у мышей развиваются первичные опухоли на месте со 100% пен?...

Обсуждение

Данные, полученные в этом исследовании, свидетельствуют о способности ультразвуковой визуализации контролировать метастатическое вовлечение паховых лимфатических узлов мышиной модели метастатической меланомы Брафа/Птена. Как показано ранее16, данная методика особенно ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить С. Буркьелли (FTGM, Пиза) за ее помощь в процедурах для животных. Эта работа была поддержана ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica институциональное финансирование LP; MFAG #17095 присужден AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro LP.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxytamoxifenMerckH6278drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) miceThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiaophthalmic solution gel
BRAFV600E antibodySpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetisliquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibodyThermo Fisher ScientificM2-7C10
Sigma gelParkerelectrode gel
Transonic gel clearTelic SAUultrasound gel
VeetReckitt Benckiser ITdepilatory cream
Compact Dual Anesthesia SystemFujifilm, Visualsonics Inc.Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS linear probe
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS system
Vevo Imaging StationFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.software platform for ultrasound image post-processing

Ссылки

  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175Braf Ptenin vivo3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены