Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Resumen

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Resumen

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) son ampliamente utilizados como modelo in vivo de melanoma metastásico. Una vez que un tumor primario ha sido inducido por el tratamiento con tamoxifeno, se observa un aumento en la carga metastásica dentro de las 4-6 semanas posteriores a la inducción. Este artículo muestra cómo las imágenes de Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) pueden ser explotadas para monitorear el aumento en la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento en su volumen.

El sistema UHFUS se utiliza para escanear ratones anestesiados con una sonda lineal UHFUS (22-55 MHz, resolución axial 40 μm). Las imágenes en modo B de los ganglios linfáticos inguinales (tanto del lado izquierdo como del derecho) se adquieren en una vista de eje corto, posicionando a los animales en reclinación dorsal. Los registros de ultrasonido se adquieren utilizando un tamaño de paso de 44 μm en un brazo mecánico motorizado. Posteriormente, las adquisiciones bidimensionales (2D) en modo B se importan a la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, y los ganglios linfáticos inguinales se identifican y segmentan de forma semiautomática en las imágenes 2D transversales adquiridas. Finalmente, se obtiene automáticamente una reconstrucción total del volumen tridimensional (3D) junto con la representación del volumen de los ganglios linfáticos, que también se expresa como una medición absoluta.

Esta técnica in vivo no invasiva es muy bien tolerada y permite la programación de múltiples sesiones de imagen en el mismo animal experimental durante 2 semanas. Por lo tanto, es ideal evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.

Introducción

El melanoma es una forma agresiva de cáncer de piel que a menudo se disemina a otros sitios de la piel (metástasis subcutáneas), así como a los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado, el cerebro y los ^huesos1. En la última década, se han introducido nuevos fármacos en la práctica clínica y han contribuido a mejorar la esperanza de vida de los pacientes con melanoma metastásico. Sin embargo, persisten limitaciones, incluyendo el tiempo variable y el grado de respuesta, los efectos secundarios graves y la insurgencia de la resistencia ^adquirida1. Por lo tanto, es crucial detectar la propagación metastásica en sus primeras etapas, es decir, cuando llega a los ganglios linfáticos locales.

Por lo general, se realiza una biopsia de los ganglios linfáticos locales (ganglios linfáticos centinela) para verificar la presencia de células de melanoma. Sin embargo, la ecografía se está afianzando como un método no invasivo para detectar la afectación metastásica, ya que supera la evaluación clínica y puede ayudar a evitar una biopsia ^{innecesaria2,3,4}. Además, la ecografía parece apropiada para la vigilancia de los ganglios linfáticos, especialmente en el caso de edad avanzada y/o comorbilidades5,6. Las características que se detectan mediante ecografía y permiten la diferenciación entre ganglios linfáticos normales y metastásicos comprenden aumento de tamaño (volumen), cambio de forma de ovalado a redondo, margen irregular, patrón ecogénico alterado y vascularización alterada (aumentada)⁷.

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) se han puesto recientemente a disposición de la comunidad científica como un modelo tisular específico e inducible para el melanoma metastásico8. En este modelo animal, los tumores primarios se desarrollan muy rápidamente: se hacen visibles dentro de las 2-3 semanas posteriores a la inducción del cambio de Braf de tipo salvaje (wt) a BrafV600E y de la pérdida de Pten, mientras que alcanzan un volumen de 50-100 ^mm3 en 4 semanas. En las siguientes 2 semanas, el crecimiento del tumor primario se acompaña de un aumento progresivo de la carga metastásica en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones.

Los ratones Braf/Pten han sido ampliamente utilizados para múltiples propósitos, incluyendo la disección de vías de señalización implicadas en la melanomagénesis9,10, la identificación de células ^{de melanoma de origen11,12,13} y la prueba de nuevas opciones terapéuticas tanto en términos de terapia dirigida como de inmunoterapia8,14,15,16 . Específicamente, utilizamos ratones Braf / Pten para demostrar que Listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como una vacuna contra el melanoma. Cuando se administra sistémicamente en el entorno terapéutico, Lmat no se asocia con toxicidad general, ya que se acumula selectivamente en los sitios tumorales. Además, causa una disminución notable en la masa de melanoma primario y una reducción en la carga metastásica en los ganglios linfáticos y los pulmones. A nivel molecular, Lmat provoca la muerte apoptótica de las células de melanoma, que se debe, al menos en parte, a actividades no autónomas celulares (reclutamiento in situ de linfocitos T CD4+ y CD8+)¹⁶.

Cuando se utilizan ratones Braf/Pten para el modelado de melanoma, el crecimiento de tumores primarios y metástasis subcutáneas se puede monitorear mediante mediciones de calibradores. Sin embargo, la afectación de los ganglios linfáticos y los pulmones debe investigarse utilizando una técnica alternativa, posiblemente una no invasiva que permita a los investigadores seguir al mismo animal a lo largo del tiempo. En este trabajo se describe el uso de la ecografía (Figura 1), junto con un posterior análisis volumétrico 3D de los datos obtenidos, para la monitorización longitudinal del aumento de tamaño (volumen) de los ganglios linfáticos inguinales.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Ministerio de Salud italiano (protocolos animales #754/2015-PR y #684/2018-PR).

1. Inducción del melanoma

NOTA: En este estudio se utilizaron ratones Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} [B6.Cg-Braftm1Mmcm ^Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (ver la Tabla de Materiales).

1. Tratar a los ratones con 4-hidroxitamoxifeno (4-HT) aplicando 3 μL de 5 mM 4-HT sobre ~1 ^cm2 de piel afeitada de la parte superior de la espalda, como se describió anteriormente11,16,17, durante 3 días seguidos.
   NOTA: Esto activará la enzima Cre y causará un cambio de wt Braf a BrafV600E y la pérdida de Pten. Estos dos golpes son suficientes para inducir la formación de melanoma.
2. Observe que los tumores primarios se desarrollan en el sitio de la pintura de la piel en 2-3 semanas y alcanzan un volumen de 50-100 ^mm3 en 4 semanas. Además, observe metástasis en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones en este punto de tiempo (_t0).
3. Use pinzas para medir el volumen del tumor primario y de las metástasis subcutáneas, y ecografías para medir el volumen de los ganglios linfáticos inguinales. Repita estas mediciones después de una semana (_t1, 5 semanas después de la pintura de la piel) y después de dos semanas (_t2, 6 semanas después de la pintura de la piel).
4. En el último punto de tiempo, eutanasia a los ratones por sobredosis con sevorano gaseoso.
5. Analizar el tumor primario y los ganglios linfáticos mediante inspección visual, luego extirparlos para estudios histológicos, como se informó ^en16.

2. Procedimiento de obtención de imágenes

1. Coloque el ratón en una cámara de inducción para anestesia con gas y suministre un 3% de isoflurano en oxígeno puro hasta que el animal esté completamente anestesiado. Verifique la profundidad de la anestesia por falta de respuesta al pellizco de la pata.
2. Transfiera el animal a una tabla calentada, una parte constitutiva de la estación de imágenes UHFUS, que lo mantiene en posición supina. Use una sonda rectal lubricada con vaselina para medir la temperatura corporal. Ajuste la temperatura de la placa para mantener la temperatura corporal del ratón en el rango fisiológico (36 ± 1 ° C).
3. Humedezca los ojos del ratón con ungüento veterinario para prevenir la sequedad durante la anestesia. Suministrar gas narcótico (1,5% de isoflurano en oxígeno puro) a través de la máscara nasal de un ratón. Ajuste el porcentaje de isoflurano para mantener la profundidad correcta de la anestesia.
4. Cubra las patas delanteras y traseras con pasta conductora y péguelas con cinta adhesiva a los electrodos de la placa de ECG incrustados en la placa. Compruebe que los parámetros fisiológicos (frecuencia cardíaca, señal de respiración y temperatura corporal central) se adquieran y muestren correctamente.
5. Eliminar el vello de ambas zonas inguinales aplicando un agente depilatorio y recubrirlas con un medio de acoplamiento acústico.
6. Sujete la sonda lineal UHFUS (frecuencia central de 40 MHz) en un motor 3D especializado integrado en la estación de imágenes UHFUS, lo que permite el movimiento automatizado y paso a paso de la sonda.
7. Orientar y ajustar adecuadamente la posición de la sonda de ultrasonido para obtener imágenes de eje corto del ganglio linfático inguinal (izquierda/derecha), y colocar la región de interés en la zona focal.
8. Escanear todo el volumen del ganglio linfático inguinal como una secuencia de imágenes 2D en modo B, como se describió ^{anteriormente18}. Adquiera imágenes en múltiples niveles del ganglio linfático mediante el movimiento lineal del transductor con tamaños de paso a escala micrométrica, para generar datos 3D en términos de bucles de cine activados automáticamente por respiración y corazón.
9. Configure la grabación de la imagen con los siguientes parámetros: distancia de escaneo que oscila entre 2 y 5 mm (dependiendo del tamaño de los ganglios linfáticos); tamaño del escalón 44 μm, con un resultado de 46-114 pasos de exploración/cortes de ganglios linfáticos y un tiempo de adquisición de 1-3 min por animal. Almacene digitalmente las imágenes adquiridas en formato RAW (DICOM) para realizar más análisis fuera de línea.
10. Al final de la sesión de imágenes, suspenda la anestesia con gas y permita que el animal se recupere en la placa de calentamiento en recostación esternal. Cuidar al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la posición prona.

3. Post-procesamiento de imágenes de ultrasonido

1. Abra el conjunto de datos de imágenes DICOM 3D del ganglio linfático inguinal izquierdo / derecho en la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido.
2. Segmentación:
   1. Seleccione Método multicorte para visualizar tanto los fotogramas actuales como las miniaturas de todos los fotogramas correspondientes a cada imagen capturada durante la adquisición 3D.
   2. Seleccione la miniatura del primer fotograma para cargarla en la vista de contorno. En la vista de contorno, haga clic con el botón izquierdo del mouse para colocar puntos a lo largo del borde del ganglio linfático. Una vez que se haya establecido el número deseado de puntos (rango 10-15), haga clic con el botón derecho para completar el contorno.
   3. Una vez completado el primer contorno, utilice la vista en miniatura para seleccionar la siguiente imagen para el contorno. Si es necesario, omita varias imágenes (promedio de 3 fotogramas) entre contornos para reducir el número de rastros manuales necesarios para cada volumen 3D.
      NOTA: La plataforma de software para el postprocesamiento de imágenes de ultrasonido generará automáticamente contornos entre trazas manuales, reduciendo así el tiempo de análisis.
   4. Repita este proceso hasta que se haya esbozado todo el volumen. Una vez completado, haga clic en Finalizar.
3. Generación del wireframe 3D y medición de volumen:
   1. Mientras esté en el espacio de trabajo de la ventana de modo 3D , haga clic en el icono De medición de volumen debajo del área de visualización de la imagen para activar la vista de superficie.
      Nota : la vista de superficie crea una vista de compilación que asigna el volumen generado por el usuario a la imagen adquirida. La vista de superficie se puede girar en cualquier posición deseada.
   2. Tome nota de la medición de volumen que aparece en la esquina inferior izquierda de la vista del cubo.
      NOTA: La segmentación y la generación de volumen 3D también se pueden obtener utilizando software desarrollado a medida y / o software comercial / disponible gratuitamente para el procesamiento general de imágenes. A partir de la segmentación manual, el software debe proporcionar una descripción matemática y / o a nivel de píxel de los contornos de los ganglios linfáticos. Estos contornos se combinarían en un espacio 3D para representar la superficie externa de los ganglios linfáticos. Todos los pasos descritos en el procedimiento de obtención de imágenes y el post-procesamiento de imágenes de ultrasonido se resumen en la Figura 2.

Resultados

Después de la pintura de la piel de los ratones Tyr::CreER+,^BrafCA/+,^Ptenlox/lox con 4-HT, se induce la actividad de Cre, debido a que hay un cambio a nivel genómico de wt Braf a BrafV600E, mientras que Pten se pierde (Figura 3A). En 2-3 semanas, los ratones desarrollan tumores primarios en el sitio con una penetrancia del 100%. Después de cuatro semanas desde el tratamiento con 4-HT (_t0), los tumores primarios alcanzan un volumen de 50-1...

Discusión

Los datos obtenidos en este estudio atestiguan la capacidad de las imágenes ecográficas para monitorizar la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales del modelo de ratón Braf/Pten de melanoma metastásico. Como se ha demostrado ^{anteriormente16}, esta técnica es especialmente útil para evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico. Esto se debe a que permite el seguimiento del cambio en el volumen de los ganglios linfáticos en un mismo animal a lo largo del tiempo, c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxytamoxifen	Merck	H6278	drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice	The Jackson Laboratory	013590
Blu gel	Sooft Ialia		ophthalmic solution gel
BRAFV600E antibody	Spring Bioscience Corporation	E19290
IsoFlo (isoflorane)	Zoetis		liquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibody	Thermo Fisher Scientific	M2-7C10
Sigma gel	Parker		electrode gel
Transonic gel clear	Telic SAU		ultrasound gel
Veet	Reckitt Benckiser IT		depilatory cream
Compact Dual Anesthesia System	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550S	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS linear probe
Vevo 3100	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS system
Vevo Imaging Station	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo Lab	Fujifilm, Visualsonics Inc.		software platform for ultrasound image post-processing