JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Melanom, hızla diğer organlara yayılan çok agresif bir hastalıktır. Bu protokol, metastatik melanomun Braf / Pten fare modelindeki inguinal lenf düğümlerinin hacmini izlemek için 3D render ile birlikte ultra yüksek frekanslı ultrason görüntülemenin uygulanmasını açıklamaktadır.

Özet

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetiği değiştirilmiş fareler (Braf/Pten fareleri), metastatik melanomun in vivo modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Tamoksifen tedavisi ile primer tümör indüklendikten sonra, indüksiyondan sonraki 4-6 hafta içinde metastatik yükte bir artış gözlenir. Bu yazıda, inguinal lenf nodlarının metastatik tutulumundaki artışı, hacimlerindeki artışı ölçerek izlemek için Ultra-Yüksek Frekanslı UltraSound (UHFUS) görüntülemenin nasıl kullanılabileceği gösterilmektedir.

UHFUS sistemi, anestezi uygulanmış fareleri UHFUS lineer prob (22-55 MHz, eksenel çözünürlük 40 μm) ile taramak için kullanılır. Kasık lenf düğümlerinden (hem sol hem de sağ taraftan) B modu görüntüleri, hayvanları dorsal yassılığa yerleştirerek kısa eksenli bir görünümde elde edilir. Ultrason kayıtları, motorlu bir mekanik kol üzerinde 44 μm adım boyutu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, iki boyutlu (2D) B-mod alımları, ultrason görüntüsü sonrası işlem için yazılım platformuna aktarılır ve elde edilen kesitsel 2D görüntülerde inguinal lenf düğümleri yarı otomatik olarak tanımlanır ve bölümlere ayrılır. Son olarak, üç boyutlu (3D) hacmin toplam rekonstrüksiyonu, mutlak bir ölçüm olarak da ifade edilen lenf nodu hacminin oluşturulması ile birlikte otomatik olarak elde edilir.

Bu non-invaziv in vivo teknik çok iyi tolere edilir ve 2 hafta boyunca aynı deney hayvanı üzerinde çoklu görüntüleme seanslarının planlanmasına izin verir. Bu nedenle, farmakolojik tedavinin metastatik hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek idealdir.

Giriş

Melanom, sıklıkla diğer cilt bölgelerine (deri altı metastazları) ve ayrıca lenf düğümlerine, akciğerlere, karaciğere, beyne ve kemiklere yayılan agresif bir cilt kanseri şeklidir1. Son on yılda, yeni ilaçlar klinik uygulamaya girmiş ve metastatik melanom hastalarının yaşam beklentisinin iyileştirilmesine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, değişken yanıt süresi ve derecesi, ciddi yan etkiler ve edinilmiş direncin isyanı dahil olmak üzere sınırlamalar devam etmektedir1. Bu nedenle, metastatik yayılımı erken aşamalarında, yani lokal lenf düğümlerine ulaştığında tespit etmek çok önemlidir.

Lokal lenf düğümlerinin (sentinel lenf düğümleri) biyopsisi genellikle melanom hücrelerinin varlığını kontrol etmek için yapılır. Bununla birlikte, ultrason görüntüleme, klinik değerlendirmeden daha iyi performans gösterdiği ve gereksiz bir biyopsiden kaçınmaya yardımcı olabileceği için metastatik tutulumu tespit etmek için invaziv olmayan bir yöntem olarak kabul edilmektedir2,3,4. Ayrıca, ultrason görüntüleme, özellikle ileri yaş ve/veya komorbiditelerde5,6 lenf nodu sürveyansı için uygun görünmektedir. Ultrason analizi ile saptanan ve normal ve metastatik lenf nodları arasındaki farklılaşmaya izin veren özellikler, artan boyut (hacim), ovalden yuvarlaka şekil değişikliği, düzensiz marj, değişmiş ekojenik patern ve değişmiş (artmış) vaskülarizasyondan oluşur7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetiği değiştirilmiş fareler (Braf/Pten fareleri) yakın zamanda metastatik melanom için dokuya özgü ve indüklenebilir bir model olarak bilimsel topluluğa sunulmuştur8. Bu hayvan modelinde, primer tümörler çok hızlı bir şekilde gelişir: vahşi tip (wt) Braf'tan BrafV600E'ye geçişin ve Pten kaybının indüklenmesinden sonraki 2-3 hafta içinde görünür hale gelirlerken, 4 hafta içinde 50-100 mm3'lük bir hacme ulaşırlar. Takip eden 2 hafta içinde, primer tümörün büyümesine, diğer cilt bölgelerinde, lenf düğümlerinde ve akciğerlerde metastatik yükte ilerleyici bir artış eşlik eder.

Braf/Pten fareleri, melanomagenezde rol oynayan sinyal yolaklarının diseksiyonu9,10, menşe melanom hücrelerinin tanımlanması11,12,13 ve hem hedefe yönelik tedavi hem de immünoterapi açısından yeni terapötik seçeneklerin test edilmesi dahil olmak üzere birçok amaç için yaygın olarak kullanılmaktadır8,14,15,16 . Spesifik olarak, zayıflatılmış Listeria monocytogenes'in (Lmat) bir anti-melanom aşısı olarak çalıştığını göstermek için Braf / Pten farelerini kullandık. Terapötik ortamda sistemik olarak uygulandığında, Lmat, tümör bölgelerinde seçici olarak biriktiği için genel toksisite ile ilişkili değildir. Ayrıca, primer melanom kütlesinde belirgin bir azalmaya ve lenf nodlarında ve akciğerlerde metastatik yükte bir azalmaya neden olur. Moleküler düzeyde, Lmat, melanom hücrelerinin apoptotik olarak öldürülmesine neden olur, bu da en azından kısmen, hücre otonom olmayan aktivitelere (CD4 + ve CD8 + T lenfositlerinin yerinde işe alınması) bağlıdır16.

Melanom modellemesi için Braf/Pten fareleri kullanıldığında, primer tümörlerin ve deri altı metastazlarının büyümesi kumpas ölçümleri ile izlenebilir. Bununla birlikte, lenf düğümlerinin ve akciğerlerin tutulumu, araştırmacıların zaman içinde aynı hayvanı takip etmelerini sağlayan alternatif bir teknik, muhtemelen invaziv olmayan bir teknik kullanılarak araştırılmalıdır. Bu yazıda, inguinal lenf nodlarının boyut (hacim) artışının uzunlamasına izlenmesi için ultrason görüntülemenin (Şekil 1) kullanımı, elde edilen verilerin müteakip 3D hacimsel analizi ile birlikte açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (hayvan protokolleri #754/2015-PR ve #684/2018-PR).

1. Melanom indüksiyonu

NOT: Bu çalışmada altı haftalık Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox fareler [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] kullanılmıştır (bkz.

  1. Fareleri, daha önce tarif edildiği gibi, üst sırtın ~1 cm2'lik traşlanmış derisine 3 gün üst üste 3 gün boyunca 3 μL 5 mM 4-HT uygulayarak 4-hidroksitamoksifen (4-HT) ile tedavi edin.
    NOT: Bu, Cre enzimini aktive eder ve wt Braf'tan BrafV600E'ye geçişe ve Pten kaybına neden olur. Bu iki vuruş melanom oluşumunu indüklemek için yeterlidir.
  2. Primer tümörlerin cilt boyama bölgesinde 2-3 hafta içinde geliştiğini ve 4 haftada 50-100 mm3'lük bir hacme ulaştığını gözlemleyin. Ayrıca, bu zaman noktasında (t0) diğer cilt bölgelerine, lenf düğümlerine ve akciğerlere metastazlar gözlemleyin.
  3. Primer tümörün ve deri altı metastazlarının hacmini ölçmek için kumpaslar ve inguinal lenf düğümlerinin hacmini ölçmek için ultrason görüntüleme kullanın. Bu ölçümleri bir hafta sonra (t1, cilt boyamasından 5 hafta sonra) ve iki hafta sonra (t2, cilt boyamasından 6 hafta sonra) tekrarlayın.
  4. Son zamanında, gaz halindeki sevoranla aşırı dozda alarak fareleri ötenazileştirin.
  5. Primer tümör ve lenf düğümlerini görsel muayene ile analiz edin, daha sonra 16'da bildirildiği gibi histolojik çalışmalar için bunları tüketin.

2. Görüntüleme prosedürü

  1. Fareyi gaz anestezisi için bir indüksiyon odasına yerleştirin ve hayvan tamamen anestezi altına alınana kadar saf oksijende% 3 izofluran sağlayın. Pençe sıkışmasına cevap vermeyerek anestezi derinliğini doğrulayın.
  2. Hayvanı ısıtılmış bir tahtaya aktarın - UHFUS görüntüleme istasyonunun kurucu bir parçası - hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun. Vücut ısısını ölçmek için petrol jölesi ile yağlanmış bir rektal prob kullanın. Farenin vücut sıcaklığını fizyolojik aralıkta (36 ± 1°C) tutmak için kart sıcaklığını ayarlayın.
  3. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için farenin gözlerini veteriner merhemi ile nemlendirin. Bir farenin burun maskesinden narkotik gaz (saf oksijende% 1.5 izofluran) sağlayın. Doğru anestezi derinliğini korumak için izofluran yüzdesini ayarlayın.
  4. Ön ve arka pençeleri iletken macunla kaplayın ve tahtaya gömülü EKG plakası elektrotlarına bantlayın. Fizyolojik parametrelerin (kalp atış hızı, solunum sinyali ve çekirdek vücut ısısı) doğru şekilde alındığını ve görüntülendiğini kontrol edin.
  5. Bir tüy dökücü ajan uygulayarak her iki kasık bölgesinden saçları çıkarın ve akustik bir bağlantı ortamı ile kaplayın.
  6. UHFUS lineer probu (40 MHz merkez frekansı) UHFUS görüntüleme istasyonuna gömülü özel bir 3D motora sıkıştırarak probun otomatik ve kademeli olarak hareket etmesini sağlar.
  7. Kasık lenf nodunun (sol / sağ) kısa eksenli görüntülerini elde etmek için ultrason probunun konumunu uygun şekilde yönlendirin ve ayarlayın ve ilgilenilen bölgeyi odak bölgesine yerleştirin.
  8. Kasık lenf nodunun tüm hacmini, daha önce açıklandığı gibi, 2D B modu görüntülerinin bir dizisi olarak tarayın18. Otomatik solunum ve kalp kapılı sinüs döngüleri açısından 3D veriler üretmek için transdüserin mikrometre ölçeğinde adım boyutlarıyla doğrusal hareketi ile lenf nodunun çoklu seviyelerinde görüntüler elde edin.
  9. Görüntü kaydını aşağıdaki parametrelerle ayarlayın: 2 ila 5 mm arasında değişen tarama mesafesi (lenf nodu boyutuna bağlı olarak); adım boyutu 44 μm, 46-114 tarama adımı/lenf nodu dilimi sonucu ve hayvan başına 1-3 dakika edinme süresi. Daha fazla çevrimdışı analiz için elde edilen görüntüleri ham formatta (DICOM) dijital olarak saklayın.
  10. Görüntüleme seansının sonunda, gaz anestezisini durdurun ve hayvanın sternal yassılıkta ısıtma tahtasında iyileşmesine izin verin. Eğilimli pozisyonu korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvana iyi bakın.

3. Ultrason görüntülerinin işlenmesi sonrası

  1. Sol / sağ inguinal lenf nodunun DICOM 3D görüntülerinin veri kümesini, ultrason görüntüsü sonrası işleme için yazılım platformunda açın.
  2. Segmentasyon:
    1. 3B alma sırasında yakalanan her görüntüye karşılık gelen tüm karelerin hem geçerli karelerini hem de küçük resimlerini görselleştirmek için Çok Dilimli Yöntem'i seçin.
    2. Kontur görünümüne yüklemek için ilk karenin küçük resmini seçin. Konturlama görünümünde, lenf nodu sınırı boyunca noktalar bırakmak için fareye sol tıklayın. İstenilen nokta sayısı ayarlandıktan sonra (aralık 10-15), konturu tamamlamak için sağ tıklayın.
    3. İlk kontur tamamlandıktan sonra, kontur için bir sonraki görüntüyü seçmek üzere küçük resim görünümünü kullanın. Gerekirse, her 3B birim için gereken manuel izleme sayısını azaltmak için konturlar arasındaki birkaç görüntüyü (ortalama 3 kare) atlayın.
      NOT: Ultrason görüntüsü sonrası işleme için yazılım platformu, manuel izler arasında otomatik olarak konturlar oluşturacak ve böylece analiz süresini azaltacaktır.
    4. Tüm birim özetlenene kadar bu işlemi yineleyin. Tamamlandığında, Son'a tıklayın.
  3. 3D tel kafesin oluşturulması ve hacim ölçümü:
    1. 3B mod pencere çalışma alanındayken, yüzey görünümünü etkinleştirmek için görüntü görüntüleme alanının altındaki Ses düzeyi ölçümü simgesine tıklayın.
      NOT: Yüzey görünümü, kullanıcı tarafından oluşturulan birimi alınan görüntüyle eşleyen bir derleme görünümü oluşturur. Yüzey görünümü istenen herhangi bir konuma döndürülebilir.
    2. Küp görünümünün sol alt köşesinde listelenen hacim ölçümünü not alın.
      NOT: Segmentasyon ve 3B hacim oluşturma, genel görüntü işleme için özel olarak geliştirilmiş yazılım ve/veya serbestçe temin edilebilen/ticari yazılımlar kullanılarak da elde edilebilir. Manuel segmentasyondan başlayarak, yazılım lenf nodu konturlarının matematiksel ve / veya piksel düzeyinde bir tanımını sağlamalıdır. Bu konturlar, lenf düğümlerinin dış yüzeyini oluşturmak için bir 3D alanda birleştirilecektir. Görüntüleme prosedüründe açıklanan tüm adımlar ve ultrason görüntülerinin işlenmesi sonrası Şekil 2'de özetlenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tyr::CreER+,BrafCA/+,4-HT'li Ptenlox/lox farelerin cilt boyamasından sonra, genomik düzeyde wt Braf'tan BrafV600E'ye bir geçiş olması nedeniyle Cre aktivitesi indüklenirken, Pten kaybolur (Şekil 3A). 2-3 hafta içinde, fareler% 100 penetransa sahip yerinde primer tümörler geliştirir. 4-HT tedavisinden (t0) dört hafta sonra, primer tümörler 50-100 mm3'lük bir hacme ulaşır ve büyümeleri 2 hafta daha kaliperlerle ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada elde edilen veriler, ultrason görüntülemenin metastatik melanomun Braf/Pten fare modelinin inguinal lenf nodlarının metastatik tutulumunu izleme yeteneğini kanıtlamaktadır. Daha önce gösterildiği gibi16, bu teknik özellikle ilaç tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır. Bunun nedeni, t1 ve  t2'de toplanan ölçümleri t0'da toplananlarla karşılaştırarak, aynı hayvandaki lenf nodu hacmindeki değişimi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, hayvan prosedürleri konusundaki yardımları için S. Burchielli'ye (FTGM, Pisa) teşekkür eder. Bu çalışma ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica tarafından LP'ye kurumsal fon sağlanarak desteklenmiştir; MFAG #17095, AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro tarafından LP'ye verildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxytamoxifenMerckH6278drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) miceThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiaophthalmic solution gel
BRAFV600E antibodySpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetisliquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibodyThermo Fisher ScientificM2-7C10
Sigma gelParkerelectrode gel
Transonic gel clearTelic SAUultrasound gel
VeetReckitt Benckiser ITdepilatory cream
Compact Dual Anesthesia SystemFujifilm, Visualsonics Inc.Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS linear probe
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS system
Vevo Imaging StationFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.software platform for ultrasound image post-processing

Referanslar

  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 175Metastatik melanomBraf Pten fareleriinguinal lenf d mleriin vivo g r nt lemeultra y ksek frekansl ultrason3D render

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır