흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

요약

흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.

초록

Tyr::CreER+, ^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 전이성 흑색종의 생체내 모델로 널리 사용됩니다. 일단 원발성 종양이 타목시펜 처리에 의해 유도되면, 유도 후 4-6 주 이내에 전이성 부담의 증가가 관찰됩니다. 이 논문은 UHFUS(Ultra-High-Frequency UltraSound) 이미징을 활용하여 부피의 증가를 측정하여 사타구니 림프절의 전이성 관여 증가를 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

UHFUS 시스템은 UHFUS 선형 프로브 (22-55 MHz, 축 분해능 40 μm)로 마취 된 마우스를 스캔하는 데 사용됩니다. 사타구니 림프절 (왼쪽과 오른쪽 모두)의 B 모드 이미지는 짧은 축보기로 수집되어 동물을 등쪽 난해부에 배치합니다. 초음파 기록은 전동 기계식 암에 44 μm 스텝 크기를 사용하여 수집됩니다. 그 후, 2차원(2D) B 모드 획득은 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼으로 가져오고, 획득한 횡단면 2D 이미지에서 사타구니 림프절을 반자동으로 식별하고 분할합니다. 마지막으로, 3차원(3D) 부피의 전체 재구성은 림프절 부피의 렌더링과 함께 자동으로 얻어지며, 이는 또한 절대 측정으로 표현된다.

이러한 비침습적 생체내 기술은 매우 잘 견디며, 2주에 걸쳐 동일한 실험 동물에 대한 다수의 이미징 세션의 스케줄링을 허용한다. 따라서 약리학 적 치료가 전이성 질환에 미치는 영향을 평가하는 것이 이상적입니다.

서문

흑색종은 종종 다른 피부 부위 (피하 전이)뿐만 아니라 림프절, 폐, 간, 뇌 및 뼈로 퍼지는 공격적인 형태의 피부암입니다¹. 지난 십 년 동안 신약이 임상 실습에 도입되었으며 전이성 흑색종 환자의 기대 수명을 향상시키는 데 기여했습니다. 그러나 반응의 가변적 인 시간과 정도, 심각한 부작용 및 후천적 인 저항의 반란을 포함하여 한계가 남아 있습니다¹. 따라서 초기 단계, 즉 국소 림프절에 도달 할 때 전이성 확산을 감지하는 것이 중요합니다.

국소 림프절 (센티넬 림프절)의 생검은 일반적으로 흑색종 세포의 존재를 확인하기 위해 수행됩니다. 그러나 초음파 영상은 임상 평가를 능가하고 불필요한 생검을 피하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 전이성 개입을 탐지하는 비 침습적 방법으로 자리 잡고 있습니다^2,3,4. 또한, 초음파 영상은 림프절 감시, 특히 고령 및/또는 합병증의 경우^5,6에 적합한 ....

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 이탈리아 보건부 (동물 프로토콜 # 754 / 2015-PR 및 # 684 / 2018-PR)의 승인을 받았습니다.

1. 흑색종 유도

참고: 여섯 주령의 Tyr::CreER+,BrafCA/^{+,Ptenlox/lox} 마우스 [B6.Cg-Braftm1Mmcm ^Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten)]가 본 연구에 사용되었다(자료표 참조).

1. ^{앞서 기술}한 바와 같이 등 뒤의 면도된 피부의 ∼1 ^cm2 상에 3 μL의 5 mM 4-HT를 적용하여 마우스를 4-하이드록시타목시펜(^4-HT)으로 3일 연속으로 치료한다.
   참고 : 이것은 Cre 효소를 활성화시키고 wt Braf에서 BrafV600E로 전환하고 Pten의 손실을 일으 킵니다. 이 두 안타는 흑색종 형성을 유도하기에 충분합니다.....

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결과

Tyr::CreER+, ^BrafCA/+, Ptenlox^/lox 마우스의 4-HT를 사용한 피부 페인팅 후, Cre 활성이 유도되며, 이로 인해 게놈 수준에서 wt Braf에서 BrafV600E 로 전환되고 Pten은 손실됩니다(그림 3A). 2-3 주 안에 마우스는 100 % 침투력으로 현장 원발성 종양을 일으 킵니다. 4-HT 치료 (t0)로부터 4 주 후, 원발성 종양은 50-100 ^mm3의 부피에 도달하고, 그들의 성장.......

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토론

이 연구에서 얻은 데이터는 전이성 흑색종의 Braf / Pten 마우스 모델의 사타구니 림프절의 전이성 관여를 모니터링하는 초음파 이미징의 능력을 증명합니다. 앞서 보여진 바와 같이¹⁶, 이 기술은 약물 치료의 효능을 평가하는데 특히 유용하다. 이는 _{t1 andt2} 에서 수집된 측정치와 _t0에서 수집된 측정값을 비교함으로써 시간에 따른 동일한 동물에서 ?.......

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxytamoxifen	Merck	H6278	drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice	The Jackson Laboratory	013590
Blu gel	Sooft Ialia		ophthalmic solution gel
BRAFV600E antibody	Spring Bioscience Corporation	E19290
IsoFlo (isoflorane)	Zoetis		liquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibody	Thermo Fisher Scientific	M2-7C10
Sigma gel	Parker		electrode gel
Transonic gel clear	Telic SAU		ultrasound gel
Veet	Reckitt Benckiser IT		depilatory cream
Compact Dual Anesthesia System	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550S	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS linear probe
Vevo 3100	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS system
Vevo Imaging Station	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo Lab	Fujifilm, Visualsonics Inc.		software platform for ultrasound image post-processing