Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Zusammenfassung

Melanom ist eine sehr aggressive Krankheit, die sich schnell auf andere Organe ausbreitet. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung in Verbindung mit 3D-Rendering zur Überwachung des Volumens der Leistenlymphknoten im Braf/Pten-Mausmodell des metastasierenden Melanoms.

Zusammenfassung

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) werden häufig als In-vivo-Modell für metastasierendes Melanom verwendet. Sobald ein Primärtumor durch die Behandlung mit Tamoxifen induziert wurde, wird innerhalb von 4-6 Wochen nach der Induktion ein Anstieg der metastatischen Belastung beobachtet. Dieses Papier zeigt, wie die Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) -Bildgebung genutzt werden kann, um die Zunahme der metastatischen Beteiligung der Leistenlymphknoten zu überwachen, indem die Zunahme ihres Volumens gemessen wird.

Das UHFUS-System dient zum Scannen von betäubten Mäusen mit einer UHFUS-Linearsonde (22-55 MHz, axiale Auflösung 40 μm). B-Mode-Bilder von den Leistenlymphknoten (sowohl linke als auch rechte Seite) werden in einer Kurzachsenansicht aufgenommen, in der die Tiere im dorsalen Liegebereich positioniert werden. Ultraschallaufzeichnungen werden mit einer Schrittgröße von 44 μm an einem motorisierten mechanischen Arm erfasst. Anschließend werden zweidimensionale (2D) B-Mode-Aufnahmen in die Softwareplattform für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern importiert und Leistenlymphknoten in den erfassten Querschnitts-2D-Bildern halbautomatisch identifiziert und segmentiert. Schließlich wird automatisch eine vollständige Rekonstruktion des dreidimensionalen (3D) Volumens zusammen mit der Darstellung des Lymphknotenvolumens erhalten, die auch als absolute Messung ausgedrückt wird.

Diese nicht-invasive In-vivo-Technik ist sehr gut verträglich und ermöglicht die Planung mehrerer Bildgebungssitzungen am selben Versuchstier über 2 Wochen. Es ist daher ideal, um die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlung auf metastasierende Erkrankungen zu bewerten.

Einleitung

Melanom ist eine aggressive Form von Hautkrebs, die sich oft auf andere Hautstellen (subkutane Metastasen) sowie auf Lymphknoten, Lunge, Leber, Gehirn und Knochen ^ausbreitet1. In den letzten zehn Jahren wurden neue Medikamente in die klinische Praxis eingeführt und haben dazu beigetragen, die Lebenserwartung von Patienten mit metastasierendem Melanom zu verbessern. Es bleiben jedoch Einschränkungen bestehen, einschließlich der variablen Reaktionszeit und des Grades des Ansprechens, schwerer Nebenwirkungen und des Aufruhrs erworbener ^Resistenzen1. Daher ist es wichtig, die metastatische Ausbreitung in ihren frühen Stadien zu erkennen, d.h. wenn sie zu den lokalen Lymphknoten gelangt.

Eine Biopsie der lokalen Lymphknoten (Sentinellymphknoten) wird normalerweise durchgeführt, um das Vorhandensein von Melanomzellen zu überprüfen. Die Ultraschallbildgebung setzt sich jedoch als nicht-invasive Methode zur Erkennung metastasierender Beteiligung durch, da sie die klinische Bewertung übertrifft und dazu beitragen kann, eine unnötige Biopsie zu ^{vermeiden2,3,4}. Darüber hinaus scheint die Ultraschallbildgebung für die Lymphknotenüberwachung geeignet zu sein, insbesondere bei fortgeschrittenem Alter und/oder Komorbiditäten5,6. Zu den Merkmalen, die durch Ultraschallanalyse erkannt werden und die Unterscheidung zwischen normalen und metastasierenden Lymphknoten ermöglichen, gehören eine erhöhte Größe (Volumen), eine Formänderung von oval zu rund, ein unregelmäßiger Rand, ein verändertes echogenes Muster und eine veränderte (erhöhte⁾ Vaskularisation7.

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) wurden kürzlich der wissenschaftlichen Gemeinschaft als gewebespezifisches und induzierbares Modell für metastasierendes Melanom zur Verfügung ^gestellt8. In diesem Tiermodell entwickeln sich Primärtumoren sehr schnell: Sie werden innerhalb von 2-3 Wochen nach der Induktion des Wechsels von Wildtyp (wt) Braf zu BrafV600E und des Verlustes von Pten sichtbar, während sie innerhalb von 4 Wochen ein Volumen von ^{50-100 mm3 erreichen.} In den folgenden 2 Wochen wird das Wachstum des Primärtumors von einer fortschreitenden Zunahme der metastatischen Belastung an anderen Hautstellen, Lymphknoten und Lungen begleitet.

Braf/Pten-Mäuse wurden in großem Umfang für verschiedene Zwecke verwendet, einschließlich der Sezierung von Signalwegen, die an der Melanomagese beteiligt ^sind9,10, der Identifizierung von Melanomzellen der Herkunft11,12,13 und der Erprobung neuer therapeutischer Optionen sowohl in Bezug auf die zielgerichtete Therapie als auch auf die Immuntherapie8,14,15,16 . Insbesondere verwendeten wir Braf / Pten-Mäuse, um zu zeigen, dass abgeschwächte Listeria monocytogenes (Lmat) als Anti-Melanom-Impfstoff wirken. Bei systemischer Verabreichung im therapeutischen Umfeld ist Lmat nicht mit der Gesamttoxizität assoziiert, da es sich selektiv an Tumorstellen ansammelt. Darüber hinaus verursacht es eine bemerkenswerte Abnahme der primären Melanommasse und eine Verringerung der metastatischen Belastung in den Lymphknoten und Lungen. Auf molekularer Ebene verursacht Lmat eine apoptotische Abtötung von Melanomzellen, die zumindest teilweise auf nicht-zellautonome Aktivitäten zurückzuführen ist (Rekrutierung von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten vor Ort⁾¹⁶.

Wenn Braf/Pten-Mäuse für die Melanommodellierung verwendet werden, kann das Wachstum von Primärtumoren und subkutanen Metastasen durch Messschiebermessungen überwacht werden. Die Beteiligung von Lymphknoten und Lungen muss jedoch mit einer alternativen Technik untersucht werden, möglicherweise einer nicht-invasiven, die es Forschern ermöglicht, dasselbe Tier im Laufe der Zeit zu verfolgen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung der Ultraschallbildgebung (Abbildung 1), gekoppelt mit einer anschließenden volumetrischen 3D-Analyse der erhaltenen Daten, für die longitudinale Überwachung der Zunahme der Größe (des Volumens) von Leistenlymphknoten.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Tierprotokolle #754/2015-PR und #684/2018-PR).

1. Melanom-Induktion

HINWEIS: Sechs Wochen alte Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/}lox Mäuse [B6.Cg-Braftm1Mmcm ^Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] wurden in dieser Studie verwendet (siehe Materialtabelle).

1. Behandeln Sie die Mäuse mit 4-Hydroxytamoxifen (4-HT), indem Sie 3 μL von 5 mM 4-HT auf ~ 1 ^cm2 rasierte Haut des oberen Rückens, wie zuvor beschrieben11,16,17^, für 3 Tage hintereinander auftragen.
   HINWEIS: Dies aktiviert das Cre-Enzym und verursacht einen Wechsel von wt Braf zu BrafV600E und den Verlust von Pten. Diese beiden Treffer reichen aus, um die Bildung von Melanomen zu induzieren.
2. Beobachten Sie, dass sich Primärtumoren an der Stelle der Hautmalerei in 2-3 Wochen entwickeln und in 4 Wochen ein Volumen von 50-100 ^mm3 erreichen. Beobachten Sie auch Metastasen zu anderen Hautstellen, Lymphknoten und Lungen zu diesem Zeitpunkt (_t0).
3. Verwenden Sie Messschieber, um das Volumen des Primärtumors und der subkutanen Metastasen zu messen, und Ultraschallbildgebung, um das Volumen der Leistenlymphknoten zu messen. Wiederholen Sie diese Messungen nach einer Woche (_t1, 5 Wochen nach der Hautmalerei) und nach zwei Wochen (_t2, 6 Wochen nach der Hautmalerei).
4. Euthanasieren Sie die Mäuse zum letzten Zeitpunkt durch Überdosierung mit gasförmigem Sevoran.
5. Analysieren Sie den Primärtumor und die Lymphknoten durch visuelle Inspektion und entfernen Sie sie dann für histologische Studien, wie in ^{16 berichtet.}

2. Bildgebendes Verfahren

1. Legen Sie die Maus zur Gasanästhesie in eine Induktionskammer und geben Sie 3% Isofluran in reinem Sauerstoff zu, bis das Tier vollständig betäubt ist. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch mangelnde Reaktion auf Pfotenklemme.
2. Bringen Sie das Tier auf eine beheizte Platte - einen konstitutiven Bestandteil der UHFUS-Bildgebungsstation - und halten Sie das Tier in Rückenlage. Verwenden Sie eine rektale Sonde, die mit Vaseline geschmiert ist, um die Körpertemperatur zu messen. Stellen Sie die Boardtemperatur ein, um die Körpertemperatur der Maus im physiologischen Bereich (36 ± 1 ° C) zu halten.
3. Befeuchten Sie die Augen der Maus mit Tierarztsalbe, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. Versorgen Sie Narkotikum (1,5% Isofluran in reinem Sauerstoff) durch die Nasenmaske einer Maus. Passen Sie den Prozentsatz des Isoflurans an, um die richtige Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.
4. Beschichten Sie die Vorder- und Hinterpfoten mit leitfähiger Paste und kleben Sie sie auf die in die Platine eingebetteten EKG-Plattenelektroden. Überprüfen Sie, ob die physiologischen Parameter (Herzfrequenz, Atemsignal und Körperkerntemperatur) korrekt erfasst und angezeigt werden.
5. Entfernen Sie Haare aus beiden Leistenbereichen, indem Sie ein Enthaarungsmittel auftragen und mit einem akustischen Kopplungsmedium beschichten.
6. Klemmen Sie die UHFUS-Linearsonde (40 MHz Mittenfrequenz) in einen speziellen 3D-Motor, der in die UHFUS-Bildgebungsstation eingebettet ist, und ermöglichen Sie so eine automatisierte und schrittweise Bewegung der Sonde.
7. Richten Sie die Position der Ultraschallsonde richtig aus und stellen Sie sie ein, um kurzachsige Bilder des Leistenlymphknotens (links / rechts) zu erhalten, und platzieren Sie die Region von Interesse in der Fokuszone.
8. Scannen Sie das gesamte Volumen des Leistenlymphknotens als eine Sequenz von 2D-B-Mode-Bildern, wie zuvor ^{beschrieben18.} Erfassen Sie Bilder auf mehreren Ebenen des Lymphknotens durch lineare Bewegung des Wandlers mit Schrittgrößen auf einer Mikrometerskala, um 3D-Daten in Bezug auf automatisch atmungs- und kardiale Cine-Schleifen zu generieren.
9. Stellen Sie die Bildaufzeichnung mit den folgenden Parametern ein: Scanabstand zwischen 2 und 5 mm (abhängig von der Lymphknotengröße); Schrittgröße 44 μm, mit einem Ergebnis von 46-114 Scanschritten/Lymphknotenschnitten und einer Aufnahmezeit von 1-3 min pro Tier. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder digital im Rohformat (DICOM) für weitere Offline-Analysen.
10. Beenden Sie am Ende der Bildgebungssitzung die Gasanästhesie und lassen Sie das Tier sich auf der Heizplatte im sternalen Liegebereich erholen. Kümmere dich um das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Bauchlage zu halten.

3. Nachbearbeitung von Ultraschallbildern

1. Öffnen Sie den Datensatz von DICOM 3D-Bildern des linken/rechten Leistenlymphknotens in der Softwareplattform für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern.
2. Segmentierung:
   1. Wählen Sie Multi-Slice-Methode , um sowohl die aktuellen Frames als auch die Miniaturansichten aller Frames zu visualisieren, die jedem Bild entsprechen, das während der 3D-Aufnahme aufgenommen wurde.
   2. Wählen Sie die Miniaturansicht des ersten Frames aus, um sie in die Konturansicht zu laden. Klicken Sie in der Konturansicht mit der linken Maustaste auf die Maus, um Punkte entlang des Randes des Lymphknotens abzulegen. Sobald die gewünschte Anzahl von Punkten festgelegt wurde (Bereich 10-15), klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Kontur zu vervollständigen.
   3. Nachdem die erste Kontur abgeschlossen ist, verwenden Sie die Miniaturansicht, um das nächste Bild für die Konturierung auszuwählen. Überspringen Sie bei Bedarf mehrere Bilder (durchschnittlich 3 Bilder) zwischen den Konturen, um die Anzahl der manuellen Spuren zu reduzieren, die für jedes 3D-Volumen benötigt werden.
      HINWEIS: Die Softwareplattform für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern erzeugt automatisch Konturen zwischen manuellen Leiterbahnen, wodurch die Analysezeit verkürzt wird.
   4. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Volume umrissen wurde. Sobald Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertig stellen.
3. Generierung des 3D-Wireframes und Volumenmessung:
   1. Klicken Sie im Arbeitsbereich des 3D-Modusfensters auf das Symbol für die Volumenmessung unter dem Bildanzeigebereich , um die Oberflächenansicht zu aktivieren.
      Hinweis: Die Oberflächenansicht erstellt eine Kompilierungsansicht, die das vom Benutzer generierte Volume dem aufgenommenen Bild zuordnet. Die Flächenansicht kann in jede gewünschte Position gedreht werden.
   2. Beachten Sie die Volumenmessung, die in der unteren linken Ecke der Würfelansicht aufgeführt ist.
      HINWEIS: Segmentierung und 3D-Volumengenerierung können auch mit kundenspezifisch entwickelter Software und/oder frei verfügbarer/kommerzieller Software für die allgemeine Bildverarbeitung erreicht werden. Ausgehend von der manuellen Segmentierung sollte die Software eine mathematische und/oder pixelgenaue Beschreibung der Lymphknotenkonturen liefern. Diese Konturen würden in einem 3D-Raum kombiniert, um die äußere Oberfläche der Lymphknoten zu rendern. Alle im bildgebenden Verfahren und der Nachbearbeitung von Ultraschallbildern beschriebenen Schritte sind in Abbildung 2 zusammengefasst.

Ergebnisse

Nach der Hautmalerei von Tyr::CreER+,BrafCA/⁺,^{Ptenlox/lox-Mäusen} mit 4-HT wird eine Cre-Aktivität induziert, wodurch es auf genomischer Ebene einen Wechsel von wt Braf zu BrafV600E gibt, während Pten verloren geht (Abbildung 3A). In 2-3 Wochen entwickeln Mäuse vor Ort Primärtumoren mit 100% Penetranz. Nach vier Wochen nach der 4-HT-Behandlung (t0) erreichen Primärtumoren ein Volumen von 50-100 ^mm3, und ihr Wachstum kann mit ...

Diskussion

Die in dieser Studie erhaltenen Daten belegen die Fähigkeit der Ultraschallbildgebung, die metastatische Beteiligung der Leistenlymphknoten des Braf/Pten-Mausmodells des metastasierenden Melanoms zu überwachen. Wie bereits ^gezeigt16, ist diese Technik besonders nützlich, um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlung zu beurteilen. Dies liegt daran, dass es die Überwachung der Veränderung des Lymphknotenvolumens bei demselben Tier im Laufe der Zeit ermöglicht, indem die bei _t1 ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxytamoxifen	Merck	H6278	drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice	The Jackson Laboratory	013590
Blu gel	Sooft Ialia		ophthalmic solution gel
BRAFV600E antibody	Spring Bioscience Corporation	E19290
IsoFlo (isoflorane)	Zoetis		liquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibody	Thermo Fisher Scientific	M2-7C10
Sigma gel	Parker		electrode gel
Transonic gel clear	Telic SAU		ultrasound gel
Veet	Reckitt Benckiser IT		depilatory cream
Compact Dual Anesthesia System	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550S	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS linear probe
Vevo 3100	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS system
Vevo Imaging Station	Fujifilm, Visualsonics Inc.		UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo Lab	Fujifilm, Visualsonics Inc.		software platform for ultrasound image post-processing