JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة لتوليد وتوصيف الثقافات العضوية المخاطية الفموية المشتقة من ظهارة اللسان للفئران البالغة.

Abstract

البطانة المخاطية التي تغطي داخل الفم ، الغشاء المخاطي للفم ، هي نسيج مجزأ للغاية ويمكن تقسيمها إلى الغشاء المخاطي للدق واللثة والشفاه والحنك واللسان. يتم الحفاظ على الطبقة العليا ، ظهارة الفم ، بواسطة الخلايا الجذعية البالغة طوال الحياة. تمت دراسة تكاثر الخلايا الجذعية الظهارية البالغة وتمايزها بشكل مكثف باستخدام نماذج الفئران في الجسم الحي بالإضافة إلى نماذج الخلايا المغذية ثنائية الأبعاد (2D) القائمة في المختبر . تكملة لهذه الطرق التكنولوجيا العضوية ، حيث يتم تضمين الخلايا الجذعية البالغة في هيدروجيل غني بمصفوفة خارج الخلية (ECM) وتزويدها بوسط استزراع يحتوي على مزيج محدد من عوامل النمو. في ظل هذه الظروف ، تتكاثر الخلايا الجذعية البالغة وتشكل تلقائيا مجموعات خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) ، ما يسمى بالعضيات. تم إنشاء الثقافات العضوية في البداية من الخلايا الجذعية الظهارية المعوية الدقيقة للفئران. ومع ذلك ، فقد تم تكييف الطريقة منذ ذلك الحين مع أنواع الخلايا الجذعية الظهارية الأخرى. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد وتوصيف الثقافات العضوية المخاطية الفموية للفئران. يتم عزل الخلايا الظهارية الأولية من أنسجة لسان الفئران ، ومدمجة في هيدروجيل ECM ، ويتم زراعتها في وسط يحتوي على: عامل نمو البشرة (EGF) ، و R-spondin ، وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 10. في غضون 7 إلى 14 يوما من البذر الأولي ، يمكن تمرير العضيات الناتجة لمزيد من التوسع والحفظ بالتبريد. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم استراتيجيات لتوصيف الثقافات العضوية الراسخة عبر التصوير ثلاثي الأبعاد الكامل وتحليل التعبير الجيني. قد يكون هذا البروتوكول بمثابة أداة للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية الظهارية الفموية خارج الجسم الحي بطريقة اختزالية.

Introduction

الغشاء المخاطي للفم هو البطانة المخاطية التي تغطي داخل الفم. يعمل كمدخل للجهاز الهضمي ويشارك في بدء عملية الهضم1،2. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل الغشاء المخاطي للفم كحاجز لجسمنا للبيئة الخارجية مما يوفر الحماية من الإهانات الفيزيائية والكيميائيةوالبيولوجية 1. بناء على الوظيفة والأنسجة ، يمكن تقسيم الغشاء المخاطي للفم في الثدييات إلى ثلاثة أنواع: الغشاء المخاطي للمضغ (بما في ذلك الحنك الصلب واللثة) ، والغشاء المخاطي للبطانة (يعمل كسطح الحنك الرخو ، والسطح البطني للسان وسطح الخد) ، والغشاء المخاطي المتخصص (الذي يغطي السطح الظهري للسان)2. تتكون جميع أنسجة الغشاء المخاطي للفم من طبقتين: الظهارة الحرشفية الطبقية السطحية والصفيحة المخصوصة الأساسية1. الخلايا الكيراتينية الظهارية الفموية هي نوع الخلية الرئيسي للظهارة ، وهي أيضا موقع الخلايا المناعية داخل الظهارة مثل خلايا لانجرهانز1. تتكون الحيز اللحمي ، الصفيحة المخصوصة ، من أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا المناعية1. كما هو الحال في جميع الظهارة الطبقية ، توجد الخلايا الجذعية والسلفية في الطبقة القاعدية للظهارة الفموية1. تتمتع هذه الخلايا المتخصصة بالقدرة على استبدال الأنسجة المفقودة من خلال انقسامات الخلايا ، وبالتالي تغذية دوران الخلايا طوال حياةالبالغين 3. على عكس الظهارة الأخرى مثل ظهارة الأمعاء4 أو بشرة الجلد5 ، تظل ظهارة الفم غير مفهومة جيدا. ومع ذلك ، كشفت الدراسات الحديثة عن جينات مختلفة مثل Krt14 و Lrig1 و Sox2 و Bmi1 و Gli1 التي تميز الخلايا الجذعية الظهارية الفموية والخلايا السلفية في الفئران1،6،7،8. نظرا لأن ظهارة الفم هي أصل سرطان الفم ولاعب حاسم في التهاب الغشاء المخاطي والجرح والتجدد1 ، فإن الفهم الأفضل لبيولوجيا الخلية الأساسية أمر بالغ الأهمية للأساليب العلاجية الجديدة المحتملة واكتشافات الأدوية.

تم استخدام النماذج الحيوانية على نطاق واسع للدراسات الأساسية على ظهارة الغشاء المخاطي الفموية1. على سبيل المثال ، تم تحديد العلامات المذكورة أعلاه للخلايا الجذعية الظهارية والسلفية الفموية إلى حد كبير باستخدام نماذج الفئران التي تتبع النسبالجيني 1،6،7،8،9. ومع ذلك ، فقد تم أيضا استخدام مناهج خارج الجسم الحي باستخدام الخلايا المستنبتة من أصل بشري أو فأر على نطاق واسع10. تقليديا ، تم إجراء مثل هذا العمل في زراعة الخلايا باستخدام خطوط الخلايا المشتقة من سرطان الخلايا الحرشفية الفموي (OSCCs) أو خطوط الخلايا المتولدة من الخلايا الأولية الخالدة (تلقائيا أو وراثيا) 10. هذه الطرق لزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد لها قيود ذات آثار حاسمة على التحقيق في الرسامة المتجانسة للبالغين: (1) تخليد الخلية مصحوبا بدرجة كبيرة من عدم الاستقرار الجيني ، (2) قدرة محدودة على التمايز ، (3) متطلبات الخلايا المغذية ، و (4) وسط نمو غير محدد إلى حد كبير يحتوي على المصل11. بشكل جماعي ، لم تسمح هذه الطرق القياسية الذهبية في المختبر بثقافات طويلة الأمد للخلايا الجذعية الظهارية دون الحد من قدرتها على التكاثر والتمايز بالإضافة إلى تحويل جينومها من النوع البري.

ظهرت التكنولوجيا العضوية كأداة لإنشاء ثقافات الأنسجة الظهارية القريبة من الأنسجة الظهارية الأصلية in vitro11. في دراستهم لعام 2009 ، Sato et al. وصف أول نظام للزراعة العضوية الظهارية12. استندت طريقتهم إلى تضمين الخلايا الجذعية المعوية الدقيقة الفردية التي تتميز بالجين المستهدف Wnt / β-catenin Lgr513في هيدروجيل غني بمصفوفة ثلاثية الأبعاد خارج الخلية (ECM)12. من خلال توفير مزيج محدد من عوامل النمو المهمة للجذع ، تمكنت الخلايا الجذعية الظهارية البالغة المصنفة من التكاثر إلى قدرتها في الثقافة12. في النهاية ، تشكلت مجموعات الخلايا من الخلايا الجذعية التي تدور بنشاط والتي تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية المعوية الرئيسية12، تشبه بشكل فعال أنسجة المنشأ11. على عكس الثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية ، سمحت التكنولوجيا العضوية بالحفاظ على المدى الطويل للخلايا الجذعية الظهارية المعوية للفئران في ظل ظروف خالية من المغذيات مع وسيط خال من المصل ومحددا بالكامل10,11. بالإضافة إلى ذلك ، لا تغير الطريقة بشكل كبير التركيب الجيني أو النمط الظاهري للخلايا الجذعية المستنبتة11. علاوة على ذلك ، احتفظت الثقافة طويلة الأمد بقدرة الخلايا الجذعية على التكاثر والتمايز دون الحاجة إلى تخليد الخلايا11. في غضون ما يزيد قليلا عن عقد من الزمان ، تم تعديل نظام الثقافة العضوية الظهارية المبكر هذا لنمو الخلايا الجذعية البالغة من العديد من الأنسجة الظهارية الأخرى مثل القولون (الأمعاء الغليظة)12,14,15بطانه الرحم16كبد17,18الرئتين19,20الغدد الثديية21المبايض22بنكرياس23,24بشرة الجلد25، والمعدة26. بينما استخدمت معظم البروتوكولات الخلايا الجذعية الظهارية البالغة المشتقة من الثدييات مثل البشر11,27فئران11قطط2829، والخنازير30، حتى أنه كان من الممكن توليد عضيات ظهارية من غدد سم الثعبان31. أصبحت التكنولوجيا العضوية طريقة لزراعة الخلايا الجذعية مستخدمة على نطاق واسع بدرجة عالية من التنوع11. حيث تظل العضيات الظهارية وراثيا إلى حد كبير32,33ومستقرة ظاهريا فهي نماذج ممتازة لتحرير الجينات34,35لدراسة وظيفة الجينات36أو تكوين الأورام27,37,38,39,40. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زرع الثقافات العضوية في الفئران37,41وتستخدم لدراسة التفاعلات بين المضيف والميكروب42(بما في ذلك الالتهابات المسببة للأمراض43,44,45). علاوة على ذلك ، فإن الثقافات المشتركة القائمة على العضوية مع خلايا البيئة المكروية مثل الخلايا المناعية46,47,48والخلايا الليفية49,50 تم وصفها. في سياق المرض ، تم استخدام العضيات لأجيال من البنوك الحيوية للأنسجة الحية21,22,51وكذلك اختبار الأدوية27للفعالية52,53والسمية54.

في هذا البروتوكول ، نصف منهجية محسنة لإنشاء وصيانة المزارع العضوية المخاطية الفموية من ظهارة لسان الفئران. ويستند إلى تقارير سابقة تصف عزل ظهارة اللسان باستخدام الهضم الأنزيمي55 واشتقاق العضيات الظهارية من الفئران والغشاء المخاطي للفمالبشري 52،53. يحتوي وسط نمو العضيات المخاطية للفم الفئران على عوامل حاسمة تحافظ على حالة الخلايا الجذعية. ينشط R-spondin سلسلة إشارات Wnt / β-catenin5 ، في حين أن عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 10 عبارة عن سيتوكينات وروابط لمستقبلات التيروزين كينازات التي تحفز العديد من مسارات الإشارات مثل مسار MAPK / ERK ومسار PI3K / AKT / mTOR25. نصف أيضا بالتفصيل كيف يمكن تمييز الثقافات العضوية من خلال تحليل التعبير الجيني والبروتيني ومقارنتها بأنسجة المنشأ.

Protocol

تم تنفيذ جميع الطرق الموصوفة هنا وفقا للاتحاد الأوروبي وتشريعات ألمانيا بشأن التجارب على.

ملاحظة: جهز مكان العمل ، بما في ذلك الأدوات الجراحية المعقمة (ملقط دقيق ، مقص ناعم ، ومشارط) وأطباق بتري مليئة ب PBSO البارد. قم بإذابة BME طوال الليل واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية أو على الثلج حتى الاستخدام. قم بتسخين ألواح زراعة الخلايا مسبقا في حاضنة طوال الليل قبل بدء عزل الخلية. يتم توفير جميع المواد في جدول المواد.

1 إنشاء ثقافة العضوية المخاطية الفموية للفئران

  1. تشريح لسان الفئران
    1. القتل الرحيم للفأر وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والتشريعات الوطنية والحكومية الدولية ذات الصلة.
      ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون2 ، حيث قد يؤدي خلع عنق الرحم إلى عدم استقرار الرأس ، مما يؤدي إلى صعوبات في حصاد الأعضاء.
    2. ضع الماوس على ظهره وقم بتثبيته عن طريق تثبيت الكفوف على أساس مناسب.
    3. قم بتطهير الفأر عن طريق رشه بنسبة 70٪ EtOH حتى يصبح رطبا تماما.
    4. قطع الجلد بالمقص ، أولا عموديا على طول القصبة الهوائية من القص إلى الشفة ، ثم أفقيا من القصبة الهوائية باتجاه الترقوة على كلا الجانبين. يبلغ طول كل شق حوالي 2 سم.
    5. اسحب الفراء جانبا لكشف الفك.
    6. قطع عضلات الفك حتى الجزء الخلفي من تجويف الفم.
    7. افتح تجويف الفم قدر الإمكان عن طريق سحب الفك السفلي والعلوي في اتجاهين متعاكسين باستخدام ملقطين ، مما يؤدي إلى خلع الفك السفلي.
    8. استخدم ملقطا غير حاد للإمساك باللسان وإزالة أكبر قدر ممكن من اللسان عن طريق القطع عموديا في الظهر.
    9. ضع اللسان في PBS بارد خال من Mg2+ و Ca2+ (PBSO).
    10. قطع اللسان أفقيا لفصل الغشاء المخاطي للسان الظهري والبطني.
      ملاحظة: الغشاء المخاطي لللسان الظهري هو الجانب العلوي من اللسان ، واللسان البطني هو الجانب السفلي من اللسان الذي يتلامس مع أرضية الفم. يمكن التمييز بين كلا الغشاء المخاطي من خلال مورفولوجيتهما ، حيث أن الغشاء المخاطي للسان الظهري خشن بشكل واضح ، في حين أن الغشاء المخاطي للسان البطني له سطح أملس. يغطي اللسان البطني مساحة أصغر من اللسان الظهري (~ 5 × 2 مم اللسان البطني ؛ ~ 8 × 3 مم اللسان الظهري).
    11. اختياري: قم بتثبيت جزء واحد من اللسان إما في وسط مثبت (على سبيل المثال 4٪ بارافورمالدهايد) أو درجة حرارة القطع المثلى (OCT) للحفظ بالتبريد.
    12. اختياري: شظايا التجميد المفاجئة لعزل الحمض النووي الريبي أو البروتين عند -80 درجة مئوية.
  2. الهضم لفصل الظهارة والصفيحة الخاصة
    1. قم بإعداد كوكتيل إنزيمي طازج يحتوي على 1 مجم / مل من الكولاجيناز A و 2 مجم / مل Dispase II في PBSO ومحلول التسخين إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. حقن ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الكوكتيل الأنزيمي في المساحة تحت الظهارية من الطرف الخلفي المقطوع للسان باستخدام إبرة 26 جم.
    3. أدخل الإبرة بعمق في الأنسجة التي تثقب الصفيحة المخصوصة والعضلات الأساسية بعناية موازية للظهارة.
    4. حقن الكوكتيل مع سحب الإبرة ببطء.
      ملاحظة: يؤكد تفتيح اللون والتمدد المرئي لأنسجة اللسان الحقن الكافي لإنزيمات الهضم. أيضا ، يشير تحريض مرحلة شفافة تحت الظهارة إلى الحقن المناسب.
    5. كرر الحقن حتى خمس مرات.
    6. انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على نفس الكوكتيل الأنزيمي.
    7. احتضان العينة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية على شاكر (عند 300 دورة في الدقيقة).
    8. انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على PBSO.
    9. أمسك العضلات وطرف اللسان بالملاقط واسحب العضلات بعناية بعيدا عن الظهارة. إذا تمت مواجهة مقاومة ، ربما في نهاية القطع الخلفية ، ارفع الظهارة بملاقط حادة.
    10. اغسل الظهارة المنفصلة باستخدام PBSO وانتقل إلى التطبيق المطلوب. لإنشاء العضيات ، انتقل إلى الخطوة 1.3.1 وبالنسبة لمستحضرات التركيب بالكامل للأنسجة ، انتقل إلى الخطوة 4.1.1.
  3. إنشاء عضيات الغشاء المخاطي للفم في الفئران من الأنسجة الأولية
    1. قطع الظهارة إلى قطع صغيرة بحجم 2 × 2 مم.
    2. هضم الأنسجة في 1 مل من 0.125٪ تربسين مضاف إلى PBSO عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الهضم 30 دقيقة.
    3. افحص عملية الهضم بانتظام عن طريق رجها كل 10 دقائق.
    4. عندما يصبح الخليط غائما (اعتمادا على كمية الأنسجة) أو عندما يلاحظ خليط من كتل الخلايا ، قم بتمديد الاضطراب عن طريق الدوامة لمدة 5 ثوان وسحب العينات لأعلى ولأسفل 10-20 مرة.
    5. اغسلها مرة واحدة عن طريق إضافة 10 مل من متوسط DMEM / F12 +++ المتقدم.
    6. قم بتصفية تعليق الخلية مباشرة باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
    7. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط DMEM / F12 +++ المتقدم للعد.
    9. عد الخلايا باستخدام غرفة عد Neubauer أو طريقة مكافئة.
    10. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية.
    11. أعد تعليق الحبيبات في BME (احتفظ ب BME على الجليد لمنع التصلب). احسب كمية BME ، اعتمادا على رقم الخلية (حوالي 10,000 خلية / 40 ميكرولتر من BME). إذا تعذر شفط الوسط بالكامل، فقم بإزالة الباقي بعناية باستخدام ماصة سعة 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: يجب ألا يقل تركيز BME عن 70٪ ، لأن هذا قد يؤدي إلى عدم كفاية التصلب
    12. ضع الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا (المعلقة) المسخنة مسبقا في قطرات سعة 10 ميكرولتر باستخدام ماصة P100.
    13. ضع لوحة الثقافة رأسا على عقب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة للسماح ل BME بالتصلب.
    14. قم بإعداد الكمية المطلوبة من الوسط العضوي العضوي للفم في الفئران ، مع إضافة مثبط ROCK و Primocin (انظر جداول المواد والجدول 1).
    15. بعد التصلب ، أضف الوسط الدافئ مسبقا إلى قطرات الخلية عن طريق سحب العينات بعناية على جدار الآبار لتجنب انفصال القطيرات.
    16. احتضان الألواح في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    17. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام. يبقى مثبط ROCK و Primocin في وسط الثقافة في المقطعين الأولين.

2 مرور العضيات المخاطية الفموية للفئران وحفظها بالتبريد وإذابة ذوبان

  1. مرور الثقافات العضوية المخاطية الفموية للفئران
    1. يمكن تمرير العضيات المخاطية الفموية للفئران لأول مرة بين 10 و 12 يوما بعد الطلاء الأولي.
    2. للتقسيم ، أعد تعليق قطرات BME في الوسط باستخدام ماصة P1000 وانقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من PBSO المثلج.
    3. قم بتعبئة مستوى الصوت ب 5 مل من الوسط المثلج المتقدم DMEM / F12 +++.
    4. عضويات الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. شفط المادة الطافية وهضم العضيات باستخدام 0.125٪ تربسين في PBSO.
    6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول التربسين 0.125٪ واحتضان التعليق عند 37 درجة مئوية حتى تنكسر العضيات إلى قطع. افحص الهضم كل 2 دقيقة.
    7. أعد تعليق تعليق الخلية تماما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 20-30 مرة باستخدام ماصة P1000 وكرر إعادة التعليق القاسية باستخدام ماصة P200.
    8. اغسل الخلايا ب 10 مل من وسط DMEM / F12 +++ المتقدم.
    9. اختياري: قم بتصفية تعليق الخلية مباشرة باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتوليد معلق خلوي متجانس.
    10. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    11. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في BME واستمر في العضيات كما هو موضح في الخطوات 1.3.8-1.3.17.
  2. حفظ وذوبان المزارع العضوية المخاطية الفموية للفئران
    1. للحفظ بالتبريد ، دع العضيات المخاطية للفم في الفئران تنمو لمدة 3-5 أيام بعد المرور.
    2. افصل العضيات عن ألواح الاستزراع كما هو موضح في الخطوات 2.1.2-2.1.4.
    3. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق العضيات في 1 مل من وسط التجميد (وسط DMEM / F12 +++ المتقدم الذي يحتوي على 10٪ FCS و 10٪ DMSO) ونقل تعليق الخلية إلى 2 مل من التجميد الكريم.
    4. ضع الخلايا في حاويات التجميد المرغوبة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بالخلايا أقل من -120 درجة مئوية ، على سبيل المثال ، في خزان النيتروجين السائل.
    5. قم بإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد عند 37 درجة مئوية وانقل معلق الخلية بسرعة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 9 مل من وسط DMEM / F12 +++ المتقدم المسخن مسبقا.
    6. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    7. تخلص من المادة الطافية واستمر في استخدام العضيات كما هو موضح في الخطوات 1.3.8-1.3.17.

3 تحليل التعبير الجيني للأنسجة المخاطية للفم والعضيات في الفئران

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من العضيات المخاطية الفموية للفئران والأنسجة الأصلية
    1. حصاد العضيات المخاطية الفموية للفئران كما هو موضح في الخطوات 2.1.2-2.1.4.
    2. تخلص من المادة الطافية واغسل العضيات في PBSO البارد.
    3. قم بالطرد المركزي للعضيات عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    4. لعزل الحمض النووي الريبي عن الأنسجة الأصلية ، استخدم الظهارة المنفصلة (انظر الخطوة 1.2.10).
    5. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة من 2 مم × 2 مم.
    6. لعزل الحمض النووي الريبي ، استخدم طريقة أو مجموعة محددة: أعد تعليق العضيات أو قطع الأنسجة في مخزن مؤقت للتحلل 350 أو 700 ميكرولتر على التوالي.
    7. دوامة بقسوة للعضيات لتحليل لمدة 10 ثوان على الأقل وتحلل الأنسجة لمدة 30 ثانية على الأقل.
    8. ضع المحلول عند -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
    9. قم بإذابة تحلل الخلية على الجليد واستمر في عزل الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تخليق (كدنا) عن طريق تفاعل النسخ العكسي
    1. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي واحسب حجم إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي البالغة 0.1-1 ميكروغرام.
    2. لتخليق (كدنا) ، استخدم مجموعة توليف (كدنا) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. في هذه التجربة ، تم استخدام الصيغة التالية: 4 ميكرولتر من مزيج تفاعل 5x ، 1 ميكرولتر من النسخ العكسي ، x ميكرولتر من 0.1-1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي و x ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز حتى 20 ميكرولتر من الحجم النهائي.
    3. قم بإجراء النسخ العكسي في برنامج تدوير من ثلاث خطوات باستخدام البرنامج التالي: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. قم بتخزين (كدنا) عند -20 درجة مئوية.
  3. تحليل التعبير الجيني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي
    1. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، قم بإجراء جميع التفاعلات في التكرارات الفنية.
    2. قم بإعداد مزيج من 5 ميكرولتر من qPCR Supermix ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (400 نانومتر) ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (400 نانومتر) ، و 1 ميكرولتر من (كدنا) (10-20 نانوغرام / بئر) و 2 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    3. للتضخيم ، استخدم الإعدادات القياسية على النحو التالي: تنشيط البوليميراز وتمسخ الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان ، والتلدين / التمديد وقراءة اللوحة عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية لمدة 40 دورة. قم بإجراء تحليل منحنى الذوبان عند 65-95 درجة مئوية بزيادات قدرها 0.5 درجة مئوية عند 2-5 ثوان / خطوة (أو استخدم الإعدادات الافتراضية للأداة).
    4. قم بتحليل البيانات باستخدام الطرق المرغوبة مثل طرق ΔCt أو ΔΔCt56 أو باستخدام برنامج تحليل توفره الشركة المصنعة للجهاز التدوير الحراري باتباع التعليمات المحددة.

4 تحليل تعبير البروتين للأنسجة المخاطية للفم والعضيات في الفئران

ملاحظة: تم إجراء تلطيخ كامل لظهارة اللسان في صفيحة مكونة من 24 بئرا ، ونقل الأنسجة بالملقط من البئر إلى البئر في كل خطوة.

  1. تثبيت الأنسجة المخاطية للفم في الفئران والثقافات العضوية
    1. بالنسبة لتلوين الأنسجة بالكامل ، انتقل من الخطوة 1.2.10 وتابع الخطوة 4.1.5.
    2. بالنسبة للتلطيخ العضوي ، قم بحصاد العضيات كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 واستمر في الخطوة 4.1.3.
    3. قم بتعبئة تعليق الخلية ب 10 مل من PBSO.
    4. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    5. قم بتثبيت الظهارة أو العضيات في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية).
    6. اغسل العينات مرة واحدة في PBSO. قم بالطرد المركزي للعضيات عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  2. تلطيخ كامل الأنسجة المخاطية للفم في الفئران والثقافات العضوية
    1. اكشف القناع عن الحلقات عن طريق احتضان العينات في محلول Triton X-100 بنسبة 0.2٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. نقل العينات إلى محلول الحجب (5٪ مصل حمار في PBSO) واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تمييع الأجسام المضادة في محلول الانسداد واحتضان العينات في محلول الجسم المضاد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. اغسل الخلايا أو الأنسجة ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) بمحلول غسيل يحتوي على 0.1٪ Tween-20 و 1٪ PBSO في ddH2O.
    5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 400 في PBSO.
    6. احتضان العينات في محلول الجسم المضاد الثانوي لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    7. كرر خطوة الغسيل 4.2.4. بالنسبة لعينات الأنسجة ، تابع الخطوة 4.2.8. بالنسبة للعينات العضوية، تابع الخطوة 4.2.9.
    8. ضع الظهارة على شريحة بحيث يكون الجانب القاعدي (الجانب المتصل بالصفيحة المخصوصة) متجها لأعلى. قم بتركيب الظهارة في حامل مائي باستخدام DAPI وزلة غطاء. تابع الخطوة 4.2.11.
    9. بالنسبة للعينات العضوية ، قم بإعادة تعليق العضيات الملطخة في أي مصفوفة هلامية مناسبة تتصلب في درجة حرارة الغرفة.
    10. قم بإخراج قطرات الماصة بسرعة في صفيحة سفلية زجاجية سعة 96 بئرا (5 ميكرولتر/بئر). ضع الطبق على الثلج واترك مصفوفة الجل تتصلب لمدة 15 دقيقة. قم بتركيب العضيات في حامل مائي باستخدام DAPI عن طريق إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر.
    11. قم بتخزين العينات الملطخة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل الصورة.

النتائج

يصف هذا البروتوكول فصل ظهارة اللسان عن الصفيحة المخصوصة والعضلات الأساسية باستخدام كوكتيل إنزيمي (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام الظهارة المنفصلة لتوليد العضوية وكذلك حصادها لأنواع مختلفة من تحليلات الجينات والبروتينات. وبالمثل ، يمكن استخدام الطبقة المه?...

Discussion

هضم الأنسجة
يساعد هضم الكولاجيناز في فصل الظهارة عن الصفيحة المخصوصة الأساسية والأنسجة العضلية. تسمح هذه الخطوة بمقارنة أفضل للأنسجة الأولية مع العضيات المخاطية الفموية التي تم إنشاؤها لاحقا. نظرا لأن فرط الهضم بالإنزيمات يؤثر على قدرة تكوين الأعضاء العضوي?...

Disclosures

تم تسمية KK كمخترع في براءة اختراع معلقة تتعلق بالتكنولوجيا العضوية.

Acknowledgements

يود المؤلفان أن يشكروا سابين كرانز على المساعدة. نود أن نشكر الوحدة الأساسية للفحص المجهري متحد البؤر وفرز الخلايا القائم على قياس التدفق الخلوي في IZKF Würzburg لدعم هذه الدراسة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من المعونة الألمانية للسرطان (عبر IZKF / MSNZ Würzburg إلى K.K.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

References

  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568 (2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912 (2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375 (2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493 (2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588 (2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved