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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos un método para la generación y caracterización de cultivos de organoides de la mucosa oral derivados del epitelio de la lengua de ratones adultos.

Resumen

El revestimiento mucoso que cubre el interior de nuestra boca, la mucosa oral, es un tejido altamente compartimentado y se puede subdividir en la mucosa bucal, la encía, los labios, el paladar y la lengua. Su capa superior, el epitelio oral, es mantenida por las células madre adultas durante toda la vida. La proliferación y diferenciación de células madre epiteliales adultas se ha estudiado intensamente utilizando modelos de ratón in vivo , así como modelos in vitro basados en células alimentadoras bidimensionales (2D). Complementaria a estos métodos es la tecnología de organoides, en la que las células madre adultas se incrustan en un hidrogel rico en matriz extracelular (MEC) y se les proporciona un medio de cultivo que contiene un cóctel definido de factores de crecimiento. En estas condiciones, las células madre adultas proliferan y forman espontáneamente grupos de células tridimensionales (3D), los llamados organoides. Los cultivos de organoides se establecieron inicialmente a partir de células madre epiteliales del intestino delgado murino. Sin embargo, desde entonces el método se ha adaptado a otros tipos de células madre epiteliales. En este trabajo se describe un protocolo para la generación y caracterización de cultivos de organoides de mucosa oral murina. Las células epiteliales primarias se aíslan del tejido de la lengua murina, se incrustan en un hidrogel ECM y se cultivan en un medio que contiene: factor de crecimiento epidérmico (EGF), R-espondina y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10. Dentro de los 7 a 14 días posteriores a la siembra inicial, los organoides resultantes pueden pasar para una mayor expansión y criopreservación. Además, presentamos estrategias para la caracterización de cultivos de organoides establecidos a través de imágenes 3D de montaje completo y análisis de expresión génica. Este protocolo puede servir como una herramienta para investigar el comportamiento de las células madre epiteliales orales ex vivo de una manera reduccionista.

Introducción

La mucosa oral es el revestimiento mucoso que recubre el interior de nuestra boca. Funciona como la entrada del tracto alimentario y está involucrado en el inicio del proceso digestivo 1,2. Además, la mucosa oral actúa como barrera de nuestro cuerpo frente al entorno exterior, proporcionando protección contra las agresiones físicas, químicas y biológicas1. Según la función y la histología, la mucosa oral en los mamíferos se puede dividir en tres tipos: la mucosa masticatoria (que incluye el paladar duro y la encía), la mucosa de revestimiento (que funciona como la superficie del paladar blando, la superficie ventral de la lengua y la superficie bucal) y la mucosa especializada (que cubre la superficie dorsal de la lengua)2. Todos los tejidos de la mucosa oral constan de dos capas: el epitelio escamoso estratificado superficial y la lámina propia subyacente1. El queratinocito epitelial oral es el principal tipo de célula del epitelio, que también es la ubicación de las células inmunitarias intraepiteliales, como las células de Langerhans1. El compartimento estromal, la lámina propia, está formado por los diferentes tipos de células, como los fibroblastos, las células endoteliales, las células neuronales y las células inmunitarias1. Como en todos los epitelios estratificados, las células madre y progenitoras residen en la capa basal del epitelio oral1. Estas células especializadas tienen la capacidad de reemplazar el tejido perdido a través de las divisiones celulares y, por lo tanto, alimentan el recambio celular a lo largo de la vida adulta3. A diferencia de otros epitelios como el epitelio intestinal4 o la epidermis cutánea5, los epitelios orales siguen siendo poco conocidos. Sin embargo, estudios recientes descubrieron diferentes genes como Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 y Gli1 que marcan las células madre y progenitoras epiteliales orales en ratones 1,6,7,8. Dado que el epitelio oral es el origen de los carcinomas orales y un actor fundamental en la inflamación, las heridas y la regeneración de la mucosa1, una mejor comprensión de su biología celular básica es primordial para posibles nuevos enfoques terapéuticos y descubrimientos de fármacos.

Los modelos animales han sido ampliamente utilizados para estudios básicos sobre el epitelio de la mucosa oral1. Por ejemplo, los marcadores antes mencionados de células madre y progenitoras epiteliales orales se han definido en gran medida utilizando modelos de ratón de rastreo de linaje genético 1,6,7,8,9. Sin embargo, los enfoques ex vivo que utilizan células cultivadas de origen humano o murino también se han utilizado ampliamente10. Convencionalmente, este trabajo de cultivo celular se ha realizado utilizando líneas celulares derivadas del carcinoma oral de células escamosas (OSCC) o líneas celulares generadas a partir de células primarias inmortalizadas (espontánea o genéticamente)10. Estos métodos de cultivo celular en 2D tienen limitaciones con implicaciones críticas en la investigación de la homeostasis adulta: (1) la inmortalización celular se acompaña de un alto grado de inestabilidad genética, (2) capacidad limitada para diferenciarse, (3) necesidad de células alimentadoras y (4) un medio de crecimiento en gran parte indefinido que contiene suero11. En conjunto, estos métodos in vitro de referencia no permitían cultivos a largo plazo de células madre epiteliales sin limitar su capacidad para proliferar y diferenciarse, así como para transformar su genoma de tipo salvaje.

La tecnología de organoides se ha convertido en una herramienta para establecer cultivos de tejido epitelial casi nativo in vitro11. En su estudio de 2009, Sato et al. describieron el primer sistema de cultivo de organoides epiteliales12. Su método se basó en la incorporación de células madre individuales del intestino delgado marcadas por el gen diana Wnt/β-catenina Lgr513en un hidrogel rico en matriz extracelular (ECM) en 3D12. Al proporcionar un cóctel definido de factores de crecimiento importantes para la madre, las células madre epiteliales adultas sembradas pudieron proliferar hasta su capacidad en cultivo12. Eventualmente, se formaron grupos de células a partir de las células madre de ciclo activo que contenían todos los principales tipos de células epiteliales intestinales12, que se asemeja efectivamente al tejido de origen11. A diferencia de los cultivos 2D convencionales, la tecnología de organoides permitió el mantenimiento a largo plazo de las células madre epiteliales intestinales murinas en condiciones sin alimentador con un medio sin suero y completamente definido10,11. Además, el método no altera significativamente la composición genética o el fenotipo de las células madre cultivadas11. Además, el cultivo a largo plazo conservó la capacidad de la célula madre para proliferar y diferenciarse sin necesidad de inmortalización celular11. En poco más de una década, este primer sistema de cultivo de organoides epiteliales se modificó para cultivar células madre adultas a partir de muchos otros tejidos epiteliales, como el colon (intestino grueso)12,14,15endometrio16hígado17,18Pulmones19,20, glándulas mamarias21ovarios22páncreas23,24, epidermis cutánea25y estómago26. Si bien la mayoría de los protocolos utilizaron células madre epiteliales adultas derivadas de mamíferos como los humanos11,27ratón11Gatos28Perros29y cerdos30, incluso ha sido posible generar organoides epiteliales a partir de glándulas de veneno de serpiente31. La tecnología de organoides se ha convertido en un método de cultivo de células madre ampliamente utilizado con un alto grado de versatilidad11. Como los organoides epiteliales permanecen en gran medida genéticamente32,33y fenotípicamente estables, son excelentes modelos para la edición de genes34,35para estudiar la función de los genes36o tumorigénesis27,37,38,39,40. Además, los cultivos de organoides se pueden trasplantar a ratones37,41y se utilizan para estudiar las interacciones huésped-microbio42(incluidas las infecciones patógenas43,44,45). Además, los cocultivos basados en organoides con células del microambiente, como las células inmunitarias46,47,48y fibroblastos49,50 han sido descritos. En el contexto de la enfermedad, los organoides se han utilizado para generaciones de biobancos de tejidos vivos21,22,51así como la prueba de drogas27para la eficacia52,53y toxicidad54.

En este protocolo, describimos una metodología optimizada para el establecimiento y mantenimiento de cultivos de organoides de mucosa oral a partir de epitelio de lengua murina. Se basa en informes previos que describen el aislamiento del epitelio de la lengua mediante digestión enzimática55 y la derivación de organoides epiteliales de mucosa oral humana y de ratón52,53. El medio de crecimiento de los organoides de la mucosa oral murina contiene factores críticos que mantienen el estado de las células madre. La R-espondina activa la cascadade señalización Wnt/β-catenina 5, mientras que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10 son citocinas y ligandos de receptores tirosina quinasas que estimulan varias vías de señalización, como la vía MAPK/ERK y la vía PI3K/AKT/mTOR25. Describimos en detalle cómo los cultivos de organoides pueden caracterizarse mediante el análisis de expresión génica y proteica y compararse con el tejido de origen.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos se realizaron de acuerdo con la legislación de la Unión Europea y Alemania sobre experimentación animal.

NOTA: Prepare el lugar de trabajo, incluidos los instrumentos quirúrgicos estériles (pinzas finas, tijeras finas y bisturíes) y las placas de Petri llenas de PBSO frío. Descongele el BME durante la noche y manténgalo a 4 °C o en hielo hasta su uso. Precaliente las placas de cultivo celular en una incubadora durante la noche antes de comenzar el aislamiento celular. Todos los materiales se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1 Establecimiento de cultivo de organoides de la mucosa oral murina

  1. Disección de la lengua murina
    1. Sacrificar al ratón de acuerdo con los lineamientos institucionales y la legislación nacional e intergubernamental respectiva.
      NOTA: Para este protocolo, los ratones fueron sacrificados por exposición al CO2, ya que la dislocación cervical puede provocar inestabilidad de la cabeza, lo que resulta en dificultades con la sustracción de órganos.
    2. Coloque el ratón boca arriba y fíjelo sujetando las patas a una capa inferior adecuada.
    3. Desinfecte el ratón rociándolo con EtOH al 70% hasta que esté completamente mojado.
    4. Corta la piel con unas tijeras, primero verticalmente a lo largo de la tráquea desde el esternón hasta el labio, y luego horizontalmente desde la tráquea hacia la clavícula a ambos lados. Cada incisión mide alrededor de 2 cm de largo.
    5. Aparta el pelaje para descubrir la mandíbula.
    6. Corta a través de los músculos de la mandíbula hasta la parte posterior de la cavidad oral.
    7. Abra la cavidad bucal tanto como sea posible tirando de la mandíbula inferior y superior en direcciones opuestas con dos pinzas, lo que resulta en la dislocación de la mandíbula inferior.
    8. Use pinzas romas para agarrar la lengua y extraer la mayor cantidad posible de la lengua cortando verticalmente en la espalda.
    9. Coloque la lengua en PBS frío libre de Mg2+ y Ca2+ (PBSO).
    10. Corta la lengua horizontalmente para separar la mucosa dorsal y ventral de la lengua.
      NOTA: La mucosa dorsal de la lengua es la parte superior de la lengua, y la lengua ventral es la parte inferior de la lengua que está en contacto con el suelo oral. Ambas mucosas se pueden discriminar por su morfología, ya que la mucosa dorsal de la lengua está visiblemente rugosa, mientras que la mucosa ventral de la lengua tiene una superficie lisa. La lengua ventral cubre un área más pequeña que la lengua dorsal (~ 5 x 2 mm lengua ventral; ~ 8 x 3 mm lengua dorsal).
    11. Opcional: Fije una parte de la lengua en un medio fijador (por ejemplo, paraformaldehído al 4%) o en un medio de temperatura de corte óptima (OCT) para la criopreservación.
    12. Opcional: Congelación rápida de fragmentos para el aislamiento de ARN o proteínas a -80 °C.
  2. Digestión para la separación del epitelio y la lámina propia
    1. Prepare un cóctel enzimático fresco que contenga 1 mg/mL de colagenasa A y 2 mg/mL de dispasa II en PBSO y caliente la solución a 37 °C antes de usar.
    2. Inyecte al menos 500 μL del cóctel enzimático en el espacio subepitelial desde el extremo posterior de la lengua con una aguja de 26 G.
    3. Inserte la aguja profundamente en el tejido, perforando la lámina propia y el músculo subyacente, permaneciendo cuidadosamente paralelo al epitelio.
    4. Inyecte el cóctel mientras retrae lentamente la aguja.
      NOTA: Un aclaramiento en el color y una expansión visible del tejido de la lengua confirman una inyección suficiente de las enzimas de digestión. Además, la inducción de una fase transparente por debajo del epitelio indica una inyección adecuada.
    5. Repita la inyección hasta cinco veces.
    6. Transfiera el tejido a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga el mismo cóctel enzimático.
    7. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un agitador (a 300 rpm).
    8. Transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga PBSO.
    9. Agarre el músculo y la punta de la lengua con pinzas y retire con cuidado el músculo del epitelio. Si se encuentra resistencia, probablemente en el extremo de corte posterior, levante el epitelio con pinzas romas.
    10. Lave el epitelio separado con PBSO y proceda a la aplicación deseada. Para el establecimiento de organoides, continúe con el paso 1.3.1 y para las preparaciones de tejido de montaje completo, continúe con el paso 4.1.1.
  3. Establecimiento de organoides murinos de la mucosa oral a partir de tejido primario
    1. Corta el epitelio en trozos pequeños de unos 2 x 2 mm de tamaño.
    2. Digiera el tejido en 1 mL de tripsina al 0,125% añadida a PBSO a 37 °C.
      NOTA: La digestión no debe exceder los 30 min.
    3. Revise la digestión regularmente agitando cada 10 min.
    4. Cuando la mezcla se vuelve turbia (dependiendo de la cantidad de tejido) o cuando se observa una mezcla de grupos de células, extienda la interrupción mediante vórtice durante 5 s y pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces.
    5. Lavar una vez rellenando con 10 mL de medio Advanced DMEM/F12+++.
    6. Filtre directamente la suspensión celular con un filtro celular de 70 μm.
    7. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio DMEM/F12+++ avanzado para el recuento.
    9. Cuente las celdas utilizando una cámara de recuento de Neubauer o un método equivalente.
    10. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
    11. Vuelva a suspender el pellet en BME (mantenga el BME en hielo para evitar la solidificación). Calcule la cantidad de BME, en función del número de células (aproximadamente 10.000 células/40 μL de BME). Si el medio no se puede aspirar por completo, retire con cuidado el resto con una pipeta de 100 μL.
      NOTA: La concentración de BME no debe ser inferior al 70%, ya que esto puede conducir a una solidificación insuficiente.
    12. Coloque las células en la parte inferior de las placas de cultivo celular precalentadas (suspensión) en gotas de 10 μL con una pipeta P100.
    13. Coloque la placa de cultivo boca abajo en la incubadora durante 30 min-1 h para que el BME se solidifique.
    14. Prepare la cantidad requerida de medio organoide de la mucosa oral murina recién agregado el inhibidor de ROCK y Primocina (ver Tablas de Materiales y Tabla 1).
    15. Después de la solidificación, agregue el medio precalentado a las gotas de la celda pipeteando cuidadosamente contra la pared de los pocillos para evitar el desprendimiento de gotas.
    16. Incubar las placas en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
    17. Cambie el medio cada 2-3 días. El inhibidor de ROCK y Primocin permanecen en el medio de cultivo durante los dos primeros pasajes.

2 Pasaje, criopreservación y descongelación de organoides murinos de la mucosa oral

  1. Pasaje de cultivos de organoides de la mucosa oral murina
    1. Los organoides murinos de la mucosa oral pueden pasar por primera vez entre 10 y 12 días después de la siembra inicial.
    2. Para dividir, vuelva a suspender las gotas de BME en el medio con una pipeta P1000 y transfiérelas a un tubo cónico de 15 mL que contenga 2 mL de PBSO helado.
    3. Rellena el volumen con 5 ml de medio Advanced DMEM/F12+++ helado.
    4. Centrifugar organoides a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Aspirar el sobrenadante y digerir los organoides utilizando tripsina al 0,125% en PBSO.
    6. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de solución de tripsina al 0,125% e incube la suspensión a 37 °C hasta que los organoides se rompan en pedazos. Revisa la digestión cada 2 min.
    7. Vuelva a suspender la suspensión celular a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20-30 veces con una pipeta P1000 y repita la resuspensión brusca con una pipeta P200.
    8. Lave las células con 10 ml de medio Advanced DMEM/F12+++.
    9. Opcional: Filtre directamente la suspensión celular utilizando un filtro celular de 70 μm para generar una suspensión celular homogénea.
    10. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
    11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en BME y proceder con los organoides como se describe en los pasos 1.3.8-1.3.17.
  2. Criopreservación y descongelación de cultivos murinos de organoides de la mucosa oral
    1. Para la criopreservación, deje que los organoides murinos de la mucosa oral crezcan durante 3-5 días después del paso.
    2. Separe los organoides de las placas de cultivo como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.4.
    3. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los organoides en 1 mL de medio de congelación (medio Advanced DMEM/F12+++ que contenga 10% de FCS y 10% de DMSO) y transfiera la suspensión celular a crioviales de 2 mL.
    4. Coloque las celdas en los recipientes de congelación deseados a -80 °C durante un máximo de 24 h. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las celdas por debajo de -120 °C, por ejemplo, en un tanque de nitrógeno líquido.
    5. Descongele las células criopreservadas a 37 °C y transfiera rápidamente la suspensión celular a un tubo cónico que contenga 9 ml de medio Advanced DMEM/F12+++ precalentado.
    6. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g y 4 °C durante 5 min.
    7. Deseche el sobrenadante y proceda con los organoides como se describe en los pasos 1.3.8-1.3.17.

3 Análisis de expresión génica de tejido y organoides de la mucosa oral murina

  1. Extracción de ARN a partir de organoides murinos de la mucosa oral y tejido nativo
    1. Extraiga los organoides murinos de la mucosa oral como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.4.
    2. Deseche el sobrenadante y lave los organoides en PBSO frío.
    3. Centrifugar los organoides a 300 x g y 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    4. Para aislar el ARN del tejido nativo, utilice el epitelio separado (ver paso 1.2.10).
    5. Corta el pañuelo en trozos pequeños de 2 mm x 2 mm.
    6. Para el aislamiento de ARN, utilice un método o kit establecido: Vuelva a suspender los organoides o las piezas de tejido en, respectivamente, 350 o 700 μL de tampón de lisis.
    7. Lisado de organoides en vórtice durante al menos 10 s y lisado del tejido durante al menos 30 s.
    8. Colocar la solución a -80 °C durante al menos 2 h.
    9. Descongele el lisado celular en hielo y proceda con el aislamiento del ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Síntesis de ADNc por reacción de transcripción inversa
    1. Mida la concentración de ARN y calcule el volumen para una entrada total de ARN de 0,1-1 μg.
    2. Para la síntesis de ADNc, utilice un kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante. Para este experimento se utilizó la siguiente formulación: 4 μL de mezcla de reacción 5x, 1 μL de transcriptasa inversa, x μL de 0,1-1 μg de ARN total y x μL de agua libre de nucleasas hasta 20 μL del volumen final.
    3. Realice la transcripción inversa en un programa ciclador de tres pasos con el siguiente programa: 25 °C durante 5 min, 42 °C durante 30 min y 85 °C durante 5 min.
    4. Almacene el ADNc a -20 °C.
  3. Análisis de expresión génica por PCR cuantitativa en tiempo real
    1. Para la PCR cuantitativa en tiempo real, realice todas las reacciones en duplicados técnicos.
    2. Prepare una mezcla de 5 μL de qPCR Supermix, 1 μL de cebador inverso (400 nM), 1 μL de cebador directo (400 nM), 1 μL de ADNc (10-20 ng/pocillo) y 2 μL de agua libre de nucleasa.
    3. Para la amplificación, utilice los ajustes estándar de la siguiente manera: activación de la polimerasa y desnaturalización del ADN a 95 °C durante 30 s, desnaturalización a 95 °C durante 5-10 s, recocido/extensión y lectura de la placa a 60 °C durante 60 s durante 40 ciclos. Realice análisis de la curva de fusión a 65-95 °C con incrementos de 0,5 °C a 2-5 s/paso (o utilice la configuración predeterminada del instrumento).
    4. Analice los datos utilizando los métodos deseados, como los métodos ΔCt o ΔΔCt56, o utilizando un software de análisis proporcionado por el fabricante del termociclador siguiendo las instrucciones proporcionadas.

4 Análisis de la expresión proteica de tejido y organoides de la mucosa oral murina

NOTA: La tinción de montaje completo del epitelio de la lengua se realizó en una placa de 24 pocillos, transfiriendo el tejido con pinzas de pocillo a pocillo en cada paso.

  1. Fijación de tejido de mucosa oral murina y cultivos de organoides
    1. Para la tinción de tejido de montaje completo, proceda desde el paso 1.2.10 y continúe con el paso 4.1.5.
    2. Para la tinción de organoides, coseche organoides como se describe en el paso 2.1.2 y continúe con el paso 4.1.3.
    3. Rellene la suspensión de la celda con 10 ml de PBSO.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    5. Fijar el epitelio o los organoides en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente (21 °C).
    6. Lave las muestras una vez en PBSO. Centrifugar los organoides a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  2. Tinción de montaje completo de tejido de mucosa oral murina y cultivos de organoides
    1. Desenmascare los epítopos incubando las muestras en una solución de Triton X-100 al 0,2% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    2. Transfiera las muestras a la solución de bloqueo (suero de burro al 5% en PBSO) e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
    3. Diluir los anticuerpos en solución bloqueante e incubar las muestras en solución de anticuerpos durante la noche a 4 °C.
    4. Lave las células o el tejido tres veces (5 min cada una) con un tampón de lavado que contenga 0,1% de Tween-20 y 1% de PBSO en ddH2O.
    5. Diluir los anticuerpos secundarios 1:400 en PBSO.
    6. Incubar las muestras en una solución secundaria de anticuerpos durante 3 h a temperatura ambiente.
    7. Repita el paso de lavado 4.2.4. Para muestras de tejido, proceda con el paso 4.2.8. Para muestras de organoides, continúe con el paso 4.2.9.
    8. Coloque el epitelio en un portaobjetos con el lado basal (lado que estaba unido a la lámina propia) hacia arriba. Monte el epitelio en un montante acuoso con DAPI y un cubreobjetos. Continúe con el paso 4.2.11.
    9. En el caso de las muestras de organoides, vuelva a suspender los organoides teñidos en cualquier matriz de gel adecuada que se solidifique a temperatura ambiente.
    10. Pipetee rápidamente las gotas en una placa inferior de vidrio de 96 pocillos (5 μL/pocillo). Coloque la placa sobre hielo y deje que la matriz de gel se solidifique durante 15 min. Monte los organoides en un montante acuoso con DAPI añadiendo 100 μL por pocillo.
    11. Almacene las muestras teñidas a 4 °C, protegidas de la luz hasta el análisis de la imagen.

Resultados

Este protocolo describe la separación del epitelio de la lengua de la lámina propia y el músculo subyacentes mediante un cóctel enzimático (Figura 1). El epitelio separado se puede utilizar además para la generación de organoides, así como para la recolección de diferentes tipos de análisis de genes y proteínas. Del mismo modo, la capa digerida de lámina propia y músculo se puede utilizar para los procedimientos de elección.

Discusión

Digestión de tejidos
La digestión de la colagenasa ayuda a separar el epitelio de la lámina propia subyacente y el tejido muscular. Este paso permite una mejor comparación del tejido primario con los organoides de la mucosa oral generados posteriormente. Dado que la digestión excesiva con enzimas afecta a la capacidad de formación de organoides de las células madre epiteliales adultas, aconsejamos realizar la incubación de la colagenasa durante no más de 1 h ...

Divulgaciones

K.K. es nombrado el inventor de una patente pendiente que está relacionada con la tecnología de organoides.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Sabine Kranz por su ayuda. Nos gustaría agradecer a la Unidad Central de Microscopía Confocal y Clasificación Celular basada en Citometría de Flujo del IZKF Würzburg por apoyar este estudio. Este trabajo fue financiado por una subvención de la Ayuda Alemana contra el Cáncer (a través de IZKF/MSNZ Würzburg a K.K.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

Referencias

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