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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Generierung und Charakterisierung von Organoidkulturen der Mundschleimhaut vor, die aus dem Zungenepithel adulter Mäuse gewonnen wurden.

Zusammenfassung

Die Schleimhaut, die das Innere unseres Mundes bedeckt, die Mundschleimhaut, ist ein stark unterteiltes Gewebe und kann in die Wangenschleimhaut, das Zahnfleisch, die Lippen, den Gaumen und die Zunge unterteilt werden. Seine oberste Schicht, das orale Epithel, wird ein Leben lang von adulten Stammzellen aufrechterhalten. Die Proliferation und Differenzierung adulter epithelialer Stammzellen wurde intensiv unter Verwendung von in vivo Mausmodellen sowie zweidimensionalen (2D) Feederzell-basierten in vitro Modellen untersucht. Komplementär zu diesen Methoden gibt es die Organoid-Technologie, bei der adulte Stammzellen in ein extrazelluläres Matrix (ECM)-reiches Hydrogel eingebettet und mit einem Kulturmedium versehen werden, das einen definierten Cocktail von Wachstumsfaktoren enthält. Unter diesen Bedingungen vermehren sich adulte Stammzellen und bilden spontan dreidimensionale (3D) Zellcluster, die sogenannten Organoide. Organoidkulturen wurden zunächst aus murinen Dünndarm-Epithel-Stammzellen etabliert. Inzwischen wurde die Methode jedoch für andere epitheliale Stammzelltypen adaptiert. Im Folgenden wird ein Protokoll zur Generierung und Charakterisierung von murinen Organoidkulturen der Mundschleimhaut beschrieben. Primäre Epithelzellen werden aus murinem Zungengewebe isoliert, in ein EZM-Hydrogel eingebettet und in einem Medium kultiviert, das Folgendes enthält: epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), R-Spondin und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 10. Innerhalb von 7 bis 14 Tagen nach der ersten Aussaat können die resultierenden Organoide zur weiteren Expansion und Kryokonservierung transportiert werden. Darüber hinaus stellen wir Strategien zur Charakterisierung etablierter Organoidkulturen mittels 3D-Whole-Mount-Imaging und Genexpressionsanalyse vor. Dieses Protokoll kann als Werkzeug dienen, um das Verhalten von oralen epithelialen Stammzellen ex vivo auf reduktionistische Weise zu untersuchen.

Einleitung

Die Mundschleimhaut ist die Schleimhaut, die das Innere unseres Mundes bedeckt. Es fungiert als Eingang zum Verdauungstrakt und ist an der Einleitung des Verdauungsprozesses beteiligt 1,2. Darüber hinaus fungiert die Mundschleimhaut als Barriere unseres Körpers gegen die äußere Umgebung und bietet Schutz vor physikalischen, chemischen und biologischen Einflüssen1. Basierend auf der Funktion und Histologie kann die Mundschleimhaut bei Säugetieren in drei Typen unterteilt werden: die Kauschleimhaut (einschließlich des harten Gaumens und der Gingiva), die Schleimhaut (die als Oberfläche des weichen Gaumens, die ventrale Oberfläche der Zunge und die bukkale Oberfläche fungiert) und die spezialisierte Schleimhaut (die die dorsale Oberfläche der Zunge bedeckt)2. Alle Mundschleimhautgewebe bestehen aus zwei Schichten: dem oberflächlich geschichteten Plattenepithel und der darunterliegenden Lamina propria1. Der orale epitheliale Keratinozyten ist der Hauptzelltyp des Epithels, in dem sich auch intraepitheliale Immunzellen wie Langerhans-Zellen befinden1. Das Stromakompartiment, die Lamina propria, besteht aus den verschiedenen Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen, neuronalen Zellen und Immunzellen1. Wie bei allen geschichteten Epithelien befinden sich Stamm- und Vorläuferzellen in der Basalschicht des oralen Epithels1. Diese spezialisierten Zellen haben die Fähigkeit, verlorenes Gewebe durch Zellteilungen zu ersetzen und somit den Zellumsatz während des gesamten Erwachsenenlebens zu fördern3. Im Gegensatz zu anderen Epithelien wie dem Darmepithel4 oder der Hautepidermis5 sind die oralen Epithelien nach wie vor wenig verstanden. Neuere Studien entdeckten jedoch verschiedene Gene wie Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 und Gli1, die orale epitheliale Stamm- und Vorläuferzellen in Mäusen markieren 1,6,7,8. Da das orale Epithel der Ursprung oraler Karzinome ist und eine entscheidende Rolle bei Entzündungen, Wunden und Regeneration der Schleimhaut spielt1, ist ein besseres Verständnis seiner grundlegenden Zellbiologie von größter Bedeutung für potenzielle neue Therapieansätze und Arzneimittelentdeckungen.

Tiermodelle wurden häufig für Grundlagenstudien am Epithel der Mundschleimhautverwendet 1. Zum Beispiel wurden die oben genannten Marker von oralen Epithelstamm- und Vorläuferzellen weitgehend unter Verwendung von Mausmodellen zur genetischen Abstammungsverfolgung definiert 1,6,7,8,9. Ex-vivo-Ansätze mit kultivierten Zellen menschlichen oder murinen Ursprungs wurden jedoch auch in großem Umfang verwendet10. Herkömmlicherweise wurden solche Zellkulturen unter Verwendung von Zelllinien durchgeführt, die von oralen Plattenepithelkarzinomen (OSCCs) abgeleitet wurden, oder mit Zelllinien, die aus (spontan oder genetisch) immortalisierten Primärzellen gewonnen wurden10. Diese 2D-Zellkulturmethoden weisen Einschränkungen auf, die kritische Auswirkungen auf die Untersuchung der adulten Homöostase haben: (1) Die Zellimmortalisierung geht mit einem hohen Grad an genetischer Instabilität einher, (2) einer eingeschränkten Fähigkeit zur Differenzierung, (3) Bedarf an Feeder-Zellen und (4) einem weitgehend undefinierten Wachstumsmedium, das Serumenthält 11. Zusammengenommen erlaubten diese In-vitro-Methoden des Goldstandards keine Langzeitkulturen von epithelialen Stammzellen, ohne ihre Fähigkeit zur Vermehrung und Differenzierung sowie zur Transformation ihres Wildtyp-Genoms einzuschränken.

Die Organoid-Technologie hat sich als Werkzeug zur Etablierung von Kulturen von nahezu nativem Epithelgewebe herausgestellt in vitro11. In ihrer Studie aus dem Jahr 2009 beschrieben Sato et al. das erste epitheliale Organoid-Kultursystem12. Ihre Methode basierte auf der Einbettung einzelner Dünndarmstammzellen, die mit dem Wnt/β-Catenin-Zielgen markiert waren Lgr513in ein 3D-Hydrogel mit extrazellulärer Matrix (ECM)12. Durch die Bereitstellung eines definierten Cocktails von Wachstumsfaktoren, die für die Stammzellen wichtig sind, konnten sich die ausgesäten adulten epithelialen Stammzellen in Kultur bis zu ihrer Kapazität vermehren12. Schließlich bildeten sich Zellcluster aus den aktiv zirkulierenden Stammzellen, die alle wichtigen intestinalen Epithelzelltypen enthielten12, die dem Herkunftsgewebe11. Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Kulturen ermöglichte die Organoid-Technologie die Langzeitkonservierung von murinen Darmepithel-Stammzellen unter feederfreien Bedingungen mit einem serumfreien und vollständig definierten Medium10,11. Darüber hinaus verändert die Methode das Erbgut oder den Phänotyp der kultivierten Stammzellen nicht signifikant11. Darüber hinaus blieb durch die Langzeitkultur die Fähigkeit der Stammzelle erhalten, sich zu vermehren und zu differenzieren, ohne dass eine Zellimmortalisierung erforderlich war11. Innerhalb von etwas mehr als einem Jahrzehnt wurde dieses frühe epitheliale Organoid-Kultursystem so modifiziert, dass adulte Stammzellen aus vielen anderen Epithelgeweben wie dem Dickdarm gezüchtet wurden12,14,15Endometrium16Leber17,18Lunge19,20, Brustdrüsen21eierstöcke22Bauchspeicheldrüse23,24, Epidermis der Haut25und Magen26. Während die meisten Protokolle adulte epitheliale Stammzellen verwendeten, die von Säugetieren wie dem Menschen stammten11,27Mäuse11Katzen28Hunde29und Schweine30ist es sogar gelungen, epitheliale Organoide aus Schlangengiftdrüsen zu erzeugen31. Die Organoid-Technologie hat sich zu einer weit verbreiteten Stammzellkulturmethode mit einem hohen Maß an Vielseitigkeit entwickelt11. Da epitheliale Organoide weitgehend genetisch32,33und phänotypisch stabil sind sie hervorragende Modelle für die Geneditierung34,35zur Untersuchung der Genfunktion36oder Tumorgenese27,37,38,39,40. Darüber hinaus können Organoidkulturen in Mäuse transplantiert werden37,41und werden verwendet, um Wirt-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen42(einschließlich pathogener Infektionen43,44,45). Darüber hinaus können Organoid-basierte Co-Kulturen mit Zellen der Mikroumgebung, wie z.B. Immunzellen, durchgeführt werden46,47,48und Fibroblasten49,50 beschrieben worden. Im Zusammenhang mit Krankheiten werden Organoide seit Generationen von Biobanken für lebendes Gewebe verwendet21,22,51sowie die Prüfung von Medikamenten27für die Wirksamkeit52,53und Toxizität54.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine optimierte Methodik für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Organoidkulturen der Mundschleimhaut aus murinem Zungenepithel. Sie basiert auf früheren Berichten, die die Isolierung des Zungenepithels mittels enzymatischer Verdauung55 und die Ableitung von epithelialen Organoiden aus der Mundschleimhaut von Mäusen und Menschenbeschreiben 52,53. Das Wachstumsmedium für murine Organoide der Mundschleimhaut enthält kritische Faktoren, die den Stammzellzustand aufrechterhalten. R-Spondin aktiviert die Wnt/β-Catenin-Signalkaskade5, während der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 10 Zytokine und Liganden von Rezeptor-Tyrosinkinasen sind, die mehrere Signalwege wie den MAPK/ERK-Signalweg und den PI3K/AKT/mTOR-Signalwegstimulieren 25. Wir beschreiben weiterhin, wie die Organoidkulturen durch Gen- und Proteinexpressionsanalyse charakterisiert und mit dem Ursprungsgewebe verglichen werden können.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit dem Tierversuchsrecht der Europäischen Union und Deutschlands durchgeführt.

HINWEIS: Bereiten Sie den Arbeitsplatz vor, einschließlich steriler chirurgischer Instrumente (feine Pinzetten, feine Scheren und Skalpelle) und Petrischale, die mit kaltem PBSO gefüllt sind. Tauen Sie BME über Nacht auf und bewahren Sie es bis zur Verwendung bei 4 °C oder auf Eis auf. Erwärmen Sie die Zellkulturplatten über Nacht in einem Inkubator, bevor Sie mit der Zellisolierung beginnen. Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1 Etablierung einer Organoidkultur der Mundschleimhaut der Maus

  1. Präparierung der Mauszunge
    1. Euthanasieren Sie die Maus gemäß den institutionellen Richtlinien und den jeweiligen nationalen und zwischenstaatlichen Rechtsvorschriften.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden Mäuse durch CO2 -Exposition euthanasiert, da eine Gebärmutterhalsluxation zu einer Instabilität des Kopfes führen kann, was zu Schwierigkeiten bei der Organentnahme führt.
    2. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie sie, indem Sie die Pfoten auf eine geeignete Unterlage stecken.
    3. Desinfizieren Sie die Maus, indem Sie sie mit 70% EtOH besprühen, bis sie vollständig nass ist.
    4. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere ein, zuerst vertikal entlang der Luftröhre vom Brustbein bis zur Lippe und dann horizontal von der Luftröhre in Richtung Schlüsselbein auf beiden Seiten. Jeder Schnitt ist ca. 2 cm lang.
    5. Ziehe das Fell zur Seite, um den Kiefer freizulegen.
    6. Schneiden Sie durch die Kiefermuskulatur bis zum hinteren Teil der Mundhöhle.
    7. Öffnen Sie die Mundhöhle so weit wie möglich, indem Sie mit zwei Pinzetten an Unter- und Oberkiefer in entgegengesetzte Richtungen ziehen, was die Luxation des Unterkiefers zur Folge hat.
    8. Greife die Zunge mit einer stumpfen Pinzette und entferne so viel Zunge wie möglich, indem du vertikal im Rücken schneidest.
    9. Legen Sie die Zunge in kaltes PBS, das frei von Mg2+ und Ca2+ (PBSO) ist.
    10. Schneiden Sie die Zunge waagerecht ein, um die schleimhaut der dorsalen und ventralen Zunge zu trennen.
      HINWEIS: Die Schleimhaut der dorsalen Zunge ist die obere Seite der Zunge und die ventrale Zunge ist die untere Seite der Zunge, die mit dem Mundboden in Kontakt steht. Beide Schleimhäute sind anhand ihrer Morphologie zu unterscheiden, da die Zungenschleimhaut sichtbar aufgeraut ist, während die Bauchzungenschleimhaut eine glatte Oberfläche aufweist. Die Bauchzunge nimmt eine kleinere Fläche ein als die Rückenzunge (~ 5 x 2 mm Bauchzunge; ~ 8 x 3 mm Rückenzunge).
    11. Optional: Befestigen Sie einen Teil der Zunge für die Kryokonservierung entweder in einem Fixiermittel (z. B. 4 % Paraformaldehyd) oder einem Medium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT).
    12. Optional: Schnapp-Gefrieren von Fragmenten für die RNA- oder Proteinisolierung bei -80 °C.
  2. Aufschluss zur Trennung von Epithel und Lamina propria
    1. Bereiten Sie vor Gebrauch einen frischen enzymatischen Cocktail zu, der 1 mg/ml Kollagenase A und 2 mg/ml Dispase II in PBSO enthält, und wärmen Sie die Lösung auf 37 °C auf.
    2. Injizieren Sie mindestens 500 μl des enzymatischen Cocktails mit einer 26-G-Nadel aus dem hinteren abgeschnittenen Ende der Zunge in den subepithelialen Raum.
    3. Führen Sie die Nadel tief in das Gewebe ein, perforieren Sie die Lamina propria und den darunter liegenden Muskel, wobei Sie vorsichtig parallel zum Epithel bleiben.
    4. Injizieren Sie den Cocktail, während Sie die Nadel langsam zurückziehen.
      HINWEIS: Eine Aufhellung der Farbe und sichtbare Ausdehnung des Zungengewebes bestätigt eine ausreichende Injektion der Verdauungsenzyme. Auch die Induktion einer transparenten Phase unter dem Epithel deutet auf eine ordnungsgemäße Injektion hin.
    5. Wiederholen Sie die Injektion bis zu fünfmal.
    6. Übertragen Sie das Gewebe in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das den gleichen enzymatischen Cocktail enthält.
    7. Die Probe wird 1 h lang bei 37 °C auf einem Shaker (bei 300 U/min) inkubiert.
    8. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale, die PBSO enthält.
    9. Fassen Sie den Muskel und die Zungenspitze mit einer Pinzette und ziehen Sie den Muskel vorsichtig vom Epithel weg. Wenn du auf Widerstand stößt, wahrscheinlich am hinteren Schnittende, hebe das Epithel mit einer stumpfen Pinzette an.
    10. Waschen Sie das abgetrennte Epithel mit PBSO und fahren Sie mit der gewünschten Anwendung fort. Für die Etablierung von Organoiden ist mit Schritt 1.3.1 und für Gewebe-Ganzbettpräparate mit Schritt 4.1.1 fortzufahren.
  3. Etablierung von murinen Organoiden der Mundschleimhaut aus Primärgewebe
    1. Schneide das Epithel in kleine Stücke von ca. 2 x 2 mm Größe.
    2. Verdauen Sie das Gewebe in 1 ml 0,125 % Trypsin, das PBSO bei 37 °C zugesetzt wird.
      HINWEIS: Die Verdauung sollte 30 Minuten nicht überschreiten.
    3. Überprüfen Sie die Verdauung regelmäßig, indem Sie alle 10 Minuten schütteln.
    4. Wenn die Mischung trüb wird (abhängig von der Gewebemenge) oder wenn eine Mischung von Zellklumpen beobachtet wird, verlängern Sie die Störung, indem Sie 5 s lang vortexen und 10-20 Mal auf und ab pipettieren.
    5. Einmal waschen, indem Sie 10 ml Advanced DMEM/F12+++ Medium auffüllen.
    6. Filtrieren Sie die Zellsuspension direkt mit einem 70 μm Zellsieb.
    7. Zentrifugieren Sie bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
    8. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Advanced DMEM/F12+++ Medium zur Zählung.
    9. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer oder einer gleichwertigen Methode.
    10. Bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand aspirieren.
    11. Suspendieren Sie das Pellet wieder in BME (halten Sie BME auf Eis, um eine Verfestigung zu verhindern). Berechnen Sie die Menge an BME in Abhängigkeit von der Zellzahl (ca. 10.000 Zellen/40 μl BME). Wenn das Medium nicht vollständig abgesaugt werden kann, entfernen Sie den Rest vorsichtig mit einer 100-μl-Pipette.
      HINWEIS: Die Konzentration von BME sollte nicht weniger als 70% betragen, da dies zu einer unzureichenden Verfestigung führen kann.
    12. Plattieren Sie die Zellen mit einer P100-Pipette auf der Unterseite der vorgewärmten Zellkulturplatten (Suspensionsplatten) in 10-μl-Tröpfchen.
    13. Legen Sie die Kulturplatte für 30 min-1 h kopfüber in den Inkubator, damit sich der BME verfestigen kann.
    14. Bereiten Sie die erforderliche Menge an organischem Organoidmedium für die Mundschleimhaut der Maus vor, indem Sie den ROCK-Inhibitor und Primocin frisch hinzufügen (siehe Materialtabellen und Tabelle 1).
    15. Geben Sie nach der Erstarrung das vorgewärmte Medium zu den Zelltröpfchen, indem Sie vorsichtig gegen die Wand der Vertiefungen pipettieren, um ein Ablösen der Tröpfchen zu vermeiden.
    16. Die Platten werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
    17. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. ROCK-Inhibitor und Primocin verbleiben in den ersten beiden Passagen im Kulturmedium.

2 Passieren, Kryokonservierung und Auftauen von murinen Organoiden der Mundschleimhaut

  1. Passage von Organoidkulturen der murinen Mundschleimhaut
    1. Maus-Organoide der Mundschleimhaut können zum ersten Mal zwischen 10 und 12 Tagen nach der Erstplattierung passageiert werden.
    2. Zum Aufteilen werden die BME-Tröpfchen mit einer P1000-Pipette im Medium resuspendiert und in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 2 mL eiskaltem PBSO überführt.
    3. Füllen Sie das Volumen mit 5 mL eiskaltem Advanced DMEM/F12+++ Medium auf.
    4. Organoide bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    5. Aspirieren Sie den Überstand und verdauen Sie die Organoide mit 0,125 % Trypsin in PBSO.
    6. Das Pellet wird in 1 ml 0,125%iger Trypsinlösung resuspendiert und die Suspension bei 37 °C inkubiert, bis die Organoide in Stücke zerfallen. Überprüfen Sie die Verdauung alle 2 Minuten.
    7. Resuspendieren Sie die Zellsuspension gründlich, indem Sie mit einer P1000-Pipette 20-30 Mal auf und ab pipettieren und die harte Resuspension mit einer P200-Pipette wiederholen.
    8. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Advanced DMEM/F12+++ Medium.
    9. Optional: Direkte Filterung der Zellsuspension mit einem 70 μm Zellsieb, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen.
    10. Die Zellsuspension bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    11. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in BME und fahren Sie mit den Organoiden wie in den Schritten 1.3.8 bis 1.3.17 beschrieben fort.
  2. Kryokonservierung und Auftauen von murinen Organoidkulturen der Mundschleimhaut
    1. Lassen Sie für die Kryokonservierung murine Organoide der Mundschleimhaut 3-5 Tage nach der Passage wachsen.
    2. Organoide wie in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.4 beschrieben von den Kulturplatten lösen.
    3. Nach der Zentrifugation werden die Organoide in 1 ml Gefriermedium (Advanced DMEM/F12+++ Medium mit 10 % FCS und 10 % DMSO) resuspendiert und die Zellsuspension in 2 ml-Kryoröhrchen überführt.
    4. Legen Sie die Zellen in die gewünschten Gefrierbehälter bei -80 °C für bis zu 24 h. Für die Langzeitlagerung bewahren Sie die Zellen unter -120 °C auf, z. B. in einem Flüssigstickstofftank.
    5. Tauen Sie die kryokonservierten Zellen bei 37 °C auf und überführen Sie die Zellsuspension schnell in ein konisches Röhrchen mit 9 ml vorgewärmtem Advanced DMEM/F12+++ Medium.
    6. Die Zellsuspension bei 350 x g und 4 °C 5 min zentrifugieren.
    7. Der Überstand wird verworfen und mit den Organoiden wie in den Schritten 1.3.8 bis 1.3.17 beschrieben fortgefahren.

3 Genexpressionsanalyse von murinem Mundschleimhautgewebe und Organoiden

  1. RNA-Extraktion aus murinen Organoiden der Mundschleimhaut und nativem Gewebe
    1. Entnahme der murinen Organoide der Mundschleimhaut, wie in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.4 beschrieben.
    2. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Organoide in kaltem PBSO.
    3. Die Organoide werden bei 300 x g und 4 ΰC 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    4. Um RNA aus nativem Gewebe zu isolieren, verwenden Sie das abgetrennte Epithel (siehe Schritt 1.2.10).
    5. Schneiden Sie das Taschentuch in kleine Stücke von 2 mm x 2 mm.
    6. Verwenden Sie für die RNA-Isolierung eine etablierte Methode oder ein etabliertes Kit: Resuspendieren Sie Organoide oder Gewebestücke in 350 bzw. 700 μl Lysepuffer.
    7. Organoide mindestens 10 s lang scharf vortexlysiert und das Gewebe mindestens 30 s lang lysiert.
    8. Stellen Sie die Lösung mindestens 2 h lang auf -80 °C.
    9. Tauen Sie das Zelllysat auf Eis auf und fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
  2. cDNA-Synthese durch reverse Transkriptionsreaktion
    1. Messen Sie die RNA-Konzentration und berechnen Sie das Volumen für einen Gesamt-RNA-Input von 0,1-1 μg.
    2. Verwenden Sie für die cDNA-Synthese ein cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für dieses Experiment wurde die folgende Formulierung verwendet: 4 μL 5x Reaktionsmix, 1 μL Reverse Transkriptase, x μL 0,1-1 μg Gesamt-RNA und x μL nukleasefreies Wasser bis zu 20 μL des Endvolumens.
    3. Führen Sie die reverse Transkription in einem dreistufigen Cycler-Programm mit dem folgenden Programm durch: 25 °C für 5 Minuten, 42 °C für 30 Minuten und 85 °C für 5 Minuten.
    4. cDNA bei -20 °C lagern.
  3. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR
    1. Für die quantitative real-time PCR führen Sie alle Reaktionen in technischen Duplikaten durch.
    2. Bereiten Sie eine Mischung aus 5 μl qPCR-Supermix, 1 μl Reverse-Primer (400 nM), 1 μl Forward-Primer (400 nM), 1 μl cDNA (10-20 ng/Well) und 2 μl nukleasefreiem Wasser vor.
    3. Für die Amplifikation sind die folgenden Standardeinstellungen zu verwenden: Polymeraseaktivierung und DNA-Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Denaturierung bei 95 °C für 5-10 s, Glühen/Verlängern und Plattenlesen bei 60 °C für 60 s für 40 Zyklen. Führen Sie die Schmelzkurvenanalyse bei 65-95 °C in Schritten von 0,5 °C bei 2-5 s/Schritt durch (oder verwenden Sie die Standardeinstellungen des Geräts).
    4. Analysieren Sie die Daten unter Verwendung der gewünschten Verfahren, wie z. B. des ΔCt- oder ΔΔCt-Verfahrens56, oder unter Verwendung einer Analysesoftware, die vom Hersteller des Thermocyclers gemäß den angegebenen Anweisungen bereitgestellt wird.

4 Proteinexpressionsanalyse von murinem Mundschleimhautgewebe und Organoiden

HINWEIS: Die Färbung des Zungenepithels wurde in einer 24-Well-Platte durchgeführt, wobei das Gewebe in jedem Schritt mit einer Pinzette von Well zu Well übertragen wurde.

  1. Fixierung von murinem Mundschleimhautgewebe und Organoidkulturen
    1. Für die Färbung von Gewebe-Whole-Mount fahren Sie mit Schritt 1.2.10 fort und fahren mit Schritt 4.1.5 fort.
    2. Für die Organoidfärbung werden Organoide wie in Schritt 2.1.2 beschrieben entnommen und mit Schritt 4.1.3 fortgefahren.
    3. Füllen Sie die Zellsuspension mit 10 mL PBSO auf.
    4. Die Zellsuspension bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    5. Fixieren Sie das Epithel oder die Organoide in 4%igem Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur (21 °C).
    6. Waschen Sie die Proben einmal in PBSO. Die Organoide werden bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  2. Whole-Mount-Färbung von murinem Mundschleimhautgewebe und Organoidkulturen
    1. Entlarven Sie die Epitope, indem Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,2%iger Triton X-100-Lösung inkubieren.
    2. Die Proben werden in die Blockierungslösung (5 % Eselsserum in PBSO) überführt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
    3. Die Antikörper werden in einer Blockierungslösung verdünnt und die Proben über Nacht in einer Antikörperlösung bei 4 °C inkubiert.
    4. Waschen Sie die Zellen oder das Gewebe dreimal (jeweils 5 Minuten) mit Waschpuffer, der 0,1 % Tween-20 und 1 % PBSO in ddH2O enthält.
    5. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper 1:400 in PBSO.
    6. Die Proben werden 3 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Sekundärantikörperlösung inkubiert.
    7. Waschschritt 4.2.4 wiederholen. Für Gewebeproben fahren Sie mit Schritt 4.2.8 fort. Für Organoidproben fahren Sie mit Schritt 4.2.9 fort.
    8. Lege das Epithel mit der basalen Seite (Seite, die an der Lamina propria befestigt war) nach oben auf einen Objektträger. Montieren Sie das Epithel in einem wässrigen Eindeckmittel mit DAPI und einem Deckglas. Fahren Sie mit Schritt 4.2.11 fort.
    9. Bei Organoidproben resuspendieren Sie die gefärbten Organoide in einer geeigneten Gelmatrix, die sich bei Raumtemperatur verfestigt.
    10. Pipettieren Sie Tröpfchen schnell in eine 96-Well-Glasbodenplatte (5 μl/Well). Legen Sie die Platte auf Eis und lassen Sie die Gelmatrix 15 min lang festigen. Die Organoide werden in einem wässrigen Eindeckmittel mit DAPI durch Zugabe von 100 μl pro Vertiefung eingelagert.
    11. Lagern Sie die gefärbten Proben bis zur Bildanalyse bei 4 °C lichtgeschützt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung des Zungenepithels von der darunter liegenden Lamina propria und dem Muskel mittels eines enzymatischen Cocktails (Abbildung 1). Das abgetrennte Epithel kann weiterhin für die Organoiderzeugung verwendet und für verschiedene Arten von Gen- und Proteinanalysen geerntet werden. Ebenso kann die verdaute Schicht aus Lamina propria und Muskel für Verfahren der Wahl verwendet werden.

Bei Organ...

Diskussion

Verdauung des Gewebes
Die Kollagenase-Verdauung hilft bei der Trennung des Epithels von der darunter liegenden Lamina propria und dem Muskelgewebe. Dieser Schritt ermöglicht einen besseren Vergleich des Primärgewebes mit den anschließend erzeugten Mundschleimhaut-Organoiden. Da eine Überverdauung mit Enzymen die Organoidbildungskapazität der adulten epithelialen Stammzellen beeinträchtigt, empfehlen wir, die Kollagenase-Inkubation nicht länger als 1 h und die T...

Offenlegungen

K.K. wird als Erfinder in einem angemeldeten Patent genannt, das mit der Organoid-Technologie zusammenhängt.

Danksagungen

Die Autorinnen und Autoren danken Sabine Kranz für die Mithilfe. Wir danken der Core Unit für Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie-basierte Zellsortierung des IZKF Würzburg für die Unterstützung dieser Studie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Krebshilfe (über IZKF/MSNZ Würzburg an K.K.) finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

Referenzen

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