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Resumo

Apresentamos um método para a geração e caracterização de culturas organoides da mucosa oral derivadas do epitélio da língua de camundongos adultos.

Resumo

O revestimento mucoso que cobre o interior da boca, a mucosa oral, é um tecido altamente compartimentado e pode ser subdividido em mucosa bucal, gengiva, lábios, palato e língua. Sua camada superior, o epitélio oral, é mantida por células-tronco adultas ao longo da vida. A proliferação e diferenciação de células-tronco epiteliais adultas têm sido intensamente estudadas usando modelos de camundongos in vivo , bem como modelos in vitro baseados em células alimentadoras bidimensionais (2D). Complementar a esses métodos é a tecnologia organoide, onde as células-tronco adultas são incorporadas em um hidrogel rico em matriz extracelular (ECM) e fornecidas com um meio de cultura contendo um coquetel definido de fatores de crescimento. Nessas condições, as células-tronco adultas proliferam e formam espontaneamente aglomerados de células tridimensionais (3D), os chamados organoides. As culturas organoides foram inicialmente estabelecidas a partir de células-tronco epiteliais do intestino delgado murino. No entanto, o método já foi adaptado para outros tipos de células-tronco epiteliais. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração e caracterização de culturas organoides da mucosa oral murina. As células epiteliais primárias são isoladas do tecido murino da língua, incorporadas em um hidrogel de MEC e cultivadas em um meio contendo: fator de crescimento epidérmico (EGF), R-spondina e fator de crescimento de fibroblastos (FGF) 10. Dentro de 7 a 14 dias após a semeadura inicial, os organoides resultantes podem ser passados para maior expansão e criopreservação. Além disso, apresentamos estratégias para a caracterização de culturas organoides estabelecidas por meio de imagens 3D de montagem total e análise de expressão gênica. Este protocolo pode servir como uma ferramenta para investigar o comportamento das células-tronco epiteliais orais ex vivo de maneira reducionista.

Introdução

A mucosa oral é o revestimento mucoso que cobre o interior da nossa boca. Funciona como a entrada do trato alimentar e está envolvida no início do processo digestivo 1,2. Além disso, a mucosa oral atua como barreira do nosso corpo para o ambiente externo, fornecendo proteção contra agressões físicas, químicas e biológicas1. Com base na função e na histologia, a mucosa oral em mamíferos pode ser dividida em três tipos: mucosa mastigatória (incluindo palato duro e gengiva), mucosa de revestimento (funcionando como superfície do palato mole, superfície ventral da língua e superfície bucal) e mucosa especializada (cobrindo a superfície dorsal da língua)2. Todos os tecidos da mucosa oral consistem em duas camadas: o epitélio escamoso estratificado na superfície e a lâmina própria subjacente1. O queratinócito epitelial oral é o principal tipo de célula do epitélio, que também é a localização das células imunes intraepiteliais, como as células de Langerhans1. O compartimento estromal, a lâmina própria, compreende os diferentes tipos de células, como fibroblastos, células endoteliais, células neuronais e células imunes1. Como em todos os epitélios estratificados, as células-tronco e progenitoras residem na camada basal do epitélio oral1. Essas células especializadas têm a capacidade de substituir o tecido perdido por meio de divisões celulares e, portanto, alimentar a renovação celular ao longo da vidaadulta 3. Em contraste com outros epitélios, como o epitélio intestinal4 ou a epiderme da pele5, o epitélio oral permanece pouco compreendido. No entanto, estudos recentes descobriram diferentes genes, como Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 e Gli1, que marcam células-tronco epiteliais orais e progenitoras em camundongos 1,6,7,8. Como o epitélio oral é a origem dos carcinomas orais e um ator crítico na inflamação, ferimento e regeneração da mucosa1, uma melhor compreensão de sua biologia celular básica é fundamental para possíveis novas abordagens terapêuticas e descobertas de medicamentos.

Modelos animais têm sido amplamente utilizados para estudos básicos sobre o epitélio da mucosa oral1. Por exemplo, os marcadores acima mencionados de células-tronco epiteliais orais e progenitoras foram amplamente definidos usando modelos de camundongos com rastreamento de linhagem genética 1,6,7,8,9. No entanto, abordagens ex vivo usando células cultivadas de origem humana ou murina também têm sido amplamente utilizadas10. Convencionalmente, esse trabalho de cultura celular tem sido realizado usando linhagens celulares derivadas de carcinoma espinocelular oral (CECs) ou linhagens celulares geradas a partir de células primárias imortalizadas (espontânea ou geneticamente)10. Esses métodos de cultura de células 2D têm limitações com implicações críticas na investigação da homeostase adulta: (1) a imortalização celular é acompanhada por um grande grau de instabilidade genética, (2) capacidade limitada de diferenciação, (3) necessidade de células alimentadoras e (4) um meio de crescimento amplamente indefinido contendo soro11. Coletivamente, esses métodos in vitro padrão-ouro não permitiram culturas de longo prazo de células-tronco epiteliais sem limitar sua capacidade de proliferar e se diferenciar, bem como transformar seu genoma selvagem.

A tecnologia organoide surgiu como uma ferramenta para estabelecer culturas de tecido epitelial quase nativo in vitro11. Em seu estudo de 2009, Sato et al. descreveram o primeiro sistema de cultura organoide epitelial12. Seu método foi baseado na incorporação de células-tronco individuais do intestino delgado marcadas pelo gene alvo Wnt / β-catenina Lgr513em um hidrogel rico em matriz extracelular (ECM) 3D12. Ao fornecer um coquetel definido de fatores de crescimento importantes para a estaminalidade, as células-tronco epiteliais adultas semeadas foram capazes de proliferar até sua capacidade em cultura12. Eventualmente, aglomerados de células se formaram a partir das células-tronco de ciclagem ativa contendo todos os principais tipos de células epiteliais intestinais12, que se assemelhe efetivamente ao tecido de origem11. Em contraste com as culturas 2D convencionais, a tecnologia organoide permitiu a manutenção a longo prazo das células-tronco epiteliais intestinais murinas sob condições livres de alimentação com um meio livre de soro e totalmente definido10,11. Além disso, o método não altera significativamente a composição genética ou o fenótipo das células-tronco cultivadas11. Além disso, a cultura de longo prazo manteve a capacidade da célula-tronco de proliferar e se diferenciar sem a necessidade de imortalização celular11. Em pouco mais de uma década, esse sistema inicial de cultura organoide epitelial foi alterado para cultivar células-tronco adultas de muitos outros tecidos epiteliais, como o cólon (intestino grosso)12,14,15endométrio16fígado17,18Pulmões19,20, glândulas mamárias21Ovários22pâncreas23,24, epiderme da pele25e estômago26. Enquanto a maioria dos protocolos usava células-tronco epiteliais adultas derivadas de mamíferos, como humanos11,27mouses11Gatos28Cães29e suínos30, foi até possível gerar organoides epiteliais a partir de glândulas de veneno de cobra31. A tecnologia organoide tornou-se um método de cultura de células-tronco amplamente utilizado com alto grau de versatilidade11. Como os organoides epiteliais permanecem em grande parte geneticamente32,33e fenotipicamente estáveis, são excelentes modelos para edição de genes34,35estudar a função do gene36ou tumorigênese27,37,38,39,40. Além disso, culturas organoides podem ser transplantadas em camundongos37,41e são usados para estudar as interações hospedeiro-micróbio42(incluindo infecções patogênicas43,44,45). Além disso, co-culturas baseadas em organoides com células do microambiente, como células imunes46,47,48e fibroblastos49,50 foram descritos. No contexto da doença, os organoides têm sido usados por gerações de biobancos de tecidos vivos21,22,51bem como testar drogas27para eficácia52,53e toxicidade54.

Neste protocolo, descrevemos uma metodologia otimizada para o estabelecimento e manutenção de culturas organoides da mucosa oral a partir do epitélio da língua murina. Baseia-se em relatos anteriores que descrevem o isolamento do epitélio da língua usando digestão enzimática55 e a derivação de organoides epiteliais da mucosa oral de camundongos e humanos52,53. O meio de crescimento para organoides murinos da mucosa oral contém fatores críticos que mantêm o estado das células-tronco. A R-espondina ativa a cascata de sinalização Wnt/β-catenina5, enquanto o fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) 10 são citocinas e ligantes de receptores tirosina quinases que estimulam várias vias de sinalização, como a via MAPK/ERK e a via PI3K/AKT/mTOR25. Descrevemos ainda em detalhes como as culturas organoides podem ser caracterizadas pela análise da expressão gênica e proteica e comparadas com o tecido de origem.

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Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em conformidade com a legislação da União Europeia e da Alemanha sobre experimentação animal.

NOTA: Prepare o local de trabalho, incluindo instrumentos cirúrgicos estéreis (pinças finas, tesouras finas e bisturis) e placas de Petri cheias de PBSO frio. Descongele o BME durante a noite e mantenha-o a 4 °C ou no gelo até o uso. Pré-aqueça as placas de cultura de células em uma incubadora durante a noite antes de iniciar o isolamento celular. Todos os materiais são fornecidos na Tabela de Materiais.

1 Estabelecimento de cultura organoide da mucosa oral murina

  1. Dissecção da língua murina
    1. Eutanásia do camundongo de acordo com as diretrizes institucionais e respectivas legislações nacionais e intergovernamentais.
      NOTA: Para este protocolo, os camundongos foram sacrificados por exposição ao CO2, pois a luxação cervical pode levar à instabilidade da cabeça, o que resulta em dificuldades com a extração de órgãos.
    2. Coloque o mouse de costas e fixe-o prendendo as patas em uma base adequada.
    3. Desinfete o mouse borrifando-o com 70% de EtOH até que esteja completamente molhado.
    4. Corte a pele com uma tesoura, primeiro verticalmente ao longo da traqueia, do esterno ao lábio, e depois horizontalmente da traqueia em direção à clavícula em ambos os lados. Cada incisão tem cerca de 2 cm de comprimento.
    5. Afaste o pelo para descobrir a mandíbula.
    6. Corte os músculos da mandíbula até a parte de trás da cavidade oral.
    7. Abra a cavidade oral o máximo possível puxando a mandíbula inferior e superior em direções opostas usando duas pinças, o que resulta na luxação da mandíbula inferior.
    8. Use uma pinça romba para agarrar a língua e remova o máximo possível da língua, cortando verticalmente na parte de trás.
    9. Coloque a língua em PBS frio livre de Mg2+ e Ca2+ (PBSO).
    10. Corte a língua horizontalmente para separar a mucosa dorsal e ventral da língua.
      NOTA: A mucosa dorsal da língua é a parte superior da língua e a língua ventral é a parte inferior da língua que está em contato com o assoalho oral. Ambas as mucosas podem ser discriminadas por sua morfologia, pois a mucosa dorsal da língua é visivelmente rugosa, enquanto a mucosa ventral da língua tem uma superfície lisa. A língua ventral cobre uma área menor do que a língua dorsal (~ 5 x 2 mm de língua ventral; ~ 8 x 3 mm de língua dorsal).
    11. Opcional: Fixe uma parte da lingueta em meio fixador (por exemplo, paraformaldeído a 4%) ou temperatura de corte ideal (OCT) para criopreservação.
    12. Opcional: Fragmentos de congelamento instantâneo para isolamento de RNA ou proteína a -80 °C.
  2. Digestão para separação do epitélio e da lâmina própria
    1. Preparar um cocktail enzimático fresco contendo 1 mg/ml de colagenase A e 2 mg/ml de Dispase II em PBSO e aquecer a solução a 37 °C antes da utilização.
    2. Injetar pelo menos 500 μL do coquetel enzimático no espaço subepitelial a partir da extremidade posterior cortada da língua usando uma agulha de 26 G.
    3. Insira a agulha profundamente no tecido que perfura a lâmina própria e o músculo subjacente, permanecendo cuidadosamente paralelo ao epitélio.
    4. Injete o coquetel enquanto retrai lentamente a agulha.
      NOTA: Um clareamento na cor e uma expansão visível do tecido da língua confirmam uma injeção suficiente das enzimas de digestão. Além disso, uma indução de uma fase transparente sob o epitélio indica uma injeção adequada.
    5. Repita a injeção até cinco vezes.
    6. Transfira o tecido para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo o mesmo coquetel enzimático.
    7. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C num agitador (a 300 rpm).
    8. Transfira o tecido para uma placa de Petri contendo PBSO.
    9. Agarre o músculo e a ponta da língua com uma pinça e puxe cuidadosamente o músculo para longe do epitélio. Se houver resistência, provavelmente na extremidade de corte posterior, levante o epitélio com uma pinça romba.
    10. Lave o epitélio separado com PBSO e prossiga para a aplicação desejada. Para o estabelecimento de organoides, prossiga para a etapa 1.3.1 e, para preparações de tecidos, prossiga para a etapa 4.1.1.
  3. Estabelecimento de organoides murinos da mucosa oral a partir de tecido primário
    1. Corte o epitélio em pedaços pequenos de cerca de 2 x 2 mm de tamanho.
    2. Digerir o tecido em 1 ml de tripsina a 0,125% adicionada a PBSO a 37 °C.
      NOTA: A digestão não deve exceder 30 min.
    3. Verifique a digestão regularmente agitando a cada 10 min.
    4. Quando a mistura ficar turva (dependendo da quantidade de tecido) ou quando uma mistura de aglomerados de células for observada, estenda a interrupção por vórtice por 5 s e pipetando para cima e para baixo 10-20 vezes.
    5. Lave uma vez completando com 10 mL de meio Advanced DMEM/F12+++.
    6. Filtre diretamente a suspensão celular usando um filtro de células de 70 μm.
    7. Centrifugue a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio DMEM/F12+++ avançado para contagem.
    9. Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer ou um método equivalente.
    10. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
    11. Ressuspenda o pellet no BME (mantenha o BME no gelo para evitar a solidificação). Calcule a quantidade de BME, dependendo do número de células (aproximadamente 10.000 células/40 μL de BME). Se o meio não puder ser aspirado completamente, remova cuidadosamente o restante usando uma pipeta de 100 μL.
      NOTA: A concentração de BME não deve ser inferior a 70%, pois isso pode levar a uma solidificação insuficiente.
    12. Coloque as células no fundo das placas de cultura de células pré-aquecidas (suspensão) em gotículas de 10 μL usando uma pipeta P100.
    13. Coloque a placa de cultura de cabeça para baixo na incubadora por 30 min-1 h para permitir que o BME solidifique.
    14. Prepare a quantidade necessária de meio organoide da mucosa oral murina adicionando recentemente o inibidor de ROCK e a Primocin (ver Tabelas de Materiais e Tabela 1).
    15. Após a solidificação, adicione o meio pré-aquecido às gotículas da célula, pipetando cuidadosamente contra a parede dos poços para evitar o desprendimento das gotículas.
    16. Incubar as placas em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
    17. Troque o meio a cada 2-3 dias. O inibidor de ROCK e a Primocin permanecem no meio de cultura nas duas primeiras passagens.

2 Passagem, criopreservação e descongelamento de organoides murinos da mucosa oral

  1. Passagem de culturas organoides da mucosa oral murina
    1. Os organoides murinos da mucosa oral podem ser passados pela primeira vez entre 10 e 12 dias após o plaqueamento inicial.
    2. Para dividir, ressuspenda as gotículas de BME no meio com uma pipeta P1000 e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de PBSO gelado.
    3. Complete o volume com 5 mL de meio DMEM/F12+++ avançado gelado.
    4. Centrifugue organoides a 300 x g por 5 min a 4 °C.
    5. Aspirar o sobrenadante e digerir os organoides utilizando 0,125% de tripsina em PBSO.
    6. Ressuspenda o pellet em 1 mL de solução de tripsina a 0,125% e incube a suspensão a 37 ° C até que os organoides se quebrem em pedaços. Verifique a digestão a cada 2 min.
    7. Ressuspenda completamente a suspensão celular pipetando para cima e para baixo 20-30 vezes usando uma pipeta P1000 e repita a ressuspensão severa com uma pipeta P200.
    8. Lave as células com 10 mL de meio DMEM/F12+++ avançado.
    9. Opcional: Filtre diretamente a suspensão celular usando um filtro de células de 70 μm para gerar uma suspensão celular homogênea.
    10. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
    11. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento no EMB e proceder com os organoides conforme descrito nos passos 1.3.8-1.3.17.
  2. Criopreservação e descongelamento de culturas organoides da mucosa oral murina
    1. Para criopreservação, deixe os organoides murinos da mucosa oral crescerem por 3-5 dias após a passagem.
    2. Separar os organoides das placas de cultura conforme descrito nos passos 2.1.2-2.1.4.
    3. Após a centrifugação, ressuspenda os organoides em 1 mL de meio de congelamento (meio DMEM/F12+++ avançado contendo 10% de FCS e 10% de DMSO) e transfira a suspensão celular para 2 mL de criogeniais.
    4. Coloque as células nos recipientes de congelamento desejados a -80 °C por até 24 h. Para armazenamento de longo prazo, mantenha as células abaixo de -120 °C, por exemplo, em um tanque de nitrogênio líquido.
    5. Descongele as células criopreservadas a 37 °C e transfira rapidamente a suspensão celular para um tubo cônico contendo 9 mL de meio Advanced DMEM/F12+++ pré-aquecido.
    6. Centrifugar a suspensão celular a 350 x g e 4 °C durante 5 min.
    7. Rejeitar o sobrenadante e prosseguir com os organoides conforme descrito nos passos 1.3.8 a 1.3.17.

3 Análise da expressão gênica do tecido da mucosa oral murina e organoides

  1. Extração de RNA de organoides murinos da mucosa oral e tecido nativo
    1. Colha os organoides murinos da mucosa oral conforme descrito nas etapas 2.1.2-2.1.4.
    2. Descarte o sobrenadante e lave os organoides em PBSO frio.
    3. Centrifugar os organoides a 300 x g e 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
    4. Para isolar o RNA do tecido nativo, use o epitélio separado (consulte a etapa 1.2.10).
    5. Corte o tecido em pequenos pedaços de 2 mm x 2 mm.
    6. Para isolamento de RNA, use um método ou kit estabelecido: Ressuspenda organoides ou pedaços de tecido em, respectivamente, tampão de lise de 350 ou 700 μL.
    7. Organoides duramente lisados em vórtice por pelo menos 10 s e lisam o tecido por pelo menos 30 s.
    8. Colocar a solução a -80 °C durante pelo menos 2 h.
    9. Descongele o lisado celular no gelo e prossiga com o isolamento do RNA de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Síntese de cDNA por reação de transcrição reversa
    1. Meça a concentração de RNA e calcule o volume para uma entrada total de RNA de 0,1-1 μg.
    2. Para síntese de cDNA, use um kit de síntese de cDNA seguindo as instruções do fabricante. Para este experimento, foi utilizada a seguinte formulação: 4 μL de mistura de reação 5x, 1 μL de transcriptase reversa, x μL de 0,1-1 μg de RNA total e x μL de água livre de nuclease até 20 μL do volume final.
    3. Realize a transcrição reversa em um programa de ciclador de três etapas com o seguinte programa: 25 ° C por 5 min, 42 ° C por 30 min e 85 ° C por 5 min.
    4. Armazenar cDNA a -20 °C.
  3. Análise da expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real
    1. Para a PCR quantitativa em tempo real, realizar todas as reações em duplicatas técnicas.
    2. Prepare uma mistura de 5 μL de qPCR Supermix, 1 μL de primer reverso (400 nM), 1 μL de primer direto (400 nM), 1 μL de cDNA (10-20 ng/poço) e 2 μL de água livre de nuclease.
    3. Para amplificação, use as configurações padrão da seguinte forma: ativação da polimerase e desnaturação do DNA a 95 ° C por 30 s, desnaturação a 95 ° C por 5-10 s, recozimento / extensão e leitura em placa a 60 ° C por 60 s por 40 ciclos. Realize a análise da curva de fusão a 65-95 °C com incrementos de 0,5 °C a 2-5 s/passo (ou use as configurações padrão do instrumento).
    4. Analise os dados usando os métodos desejados, como os métodos ΔCt ou ΔΔCt56 ou usando um software de análise fornecido pelo fabricante do termociclador seguindo as instruções fornecidas.

4 Análise da expressão proteica do tecido murino da mucosa oral e organoides

NOTA: A coloração de montagem total do epitélio da língua foi realizada em uma placa de 24 poços, transferindo o tecido com pinça de poço para poço em cada etapa.

  1. Fixação de tecido mucoso oral murino e culturas organoides
    1. Para a coloração de tecido de montagem total, prossiga a partir da etapa 1.2.10 e continue com a etapa 4.1.5.
    2. Para coloração de organoides, colha organoides conforme descrito na etapa 2.1.2 e continue com a etapa 4.1.3.
    3. Complete a suspensão celular com 10 mL de PBSO.
    4. Centrifugar a suspensão celular a 350 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    5. Fixe o epitélio ou organoides em paraformaldeído a 4% por 30 min em temperatura ambiente (21 °C).
    6. Lave as amostras uma vez em PBSO. Centrifugar os organoides a 350 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
  2. Coloração de montagem total de tecido mucoso oral murino e culturas organoides
    1. Desmascare os epítopos incubando as amostras em solução de Triton X-100 a 0,2% por 20 min em temperatura ambiente.
    2. Transferir as amostras para a solução de bloqueio (soro de burro a 5% em PBSO) e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
    3. Diluir os anticorpos em solução de bloqueio e incubar as amostras em solução de anticorpos durante a noite a 4 °C.
    4. Lave as células ou tecidos três vezes (5 min cada) com tampão de lavagem contendo 0,1% de Tween-20 e 1% de PBSO em ddH2O.
    5. Diluir os anticorpos secundários 1:400 em PBSO.
    6. Incubar as amostras em solução de anticorpos secundários durante 3 h à temperatura ambiente.
    7. Repita a etapa de lavagem 4.2.4. Para amostras de tecido, prossiga com a etapa 4.2.8. Para amostras organoides, prossiga com a etapa 4.2.9.
    8. Coloque o epitélio em uma lâmina com o lado basal (lado que estava preso à lâmina própria) voltado para cima. Montar o epitélio em um mountant aquoso com DAPI e uma lamínula. Prossiga com a etapa 4.2.11.
    9. Para amostras de organoides, ressuspenda os organoides corados em qualquer matriz de gel adequada que solidifique à temperatura ambiente.
    10. Pipete rapidamente as gotículas em uma placa de fundo de vidro de 96 poços (5 μL/poço). Coloque a placa no gelo e deixe a matriz de gel solidificar por 15 min. Monte os organoides em um mountant aquoso com DAPI adicionando 100 μL por poço.
    11. Armazenar as amostras coradas a 4 °C protegidas da luz até à análise das imagens.

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Resultados

Este protocolo descreve a separação do epitélio da língua da lâmina própria subjacente e do músculo usando um coquetel enzimático (Figura 1). O epitélio separado pode ainda ser usado para geração de organoides, bem como colhido para diferentes tipos de análises de genes e proteínas. Da mesma forma, a camada digerida de lâmina própria e músculo pode ser usada para procedimentos de escolha.

Para culturas organoides, ...

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Discussão

Digestão tecidual
A digestão da colagenase ajuda a separar o epitélio da lâmina própria subjacente e do tecido muscular. Esta etapa permite uma melhor comparação do tecido primário com os organoides da mucosa oral gerados posteriormente. Como a superdigestão com enzimas afeta a capacidade de formação de organoides das células-tronco epiteliais adultas, aconselhamos realizar a incubação da colagenase por não mais de 1 h e a digestão da tripsina não mai...

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Divulgações

K.K. é nomeado o inventor de uma patente pendente relacionada à tecnologia organoide.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Sabine Kranz pela ajuda. Gostaríamos de agradecer à Unidade Central de Microscopia Confocal e Classificação de Células Baseada em Citometria de Fluxo do IZKF W ürzburg porapoiar este estudo. Este trabalho foi financiado por uma doação do German Cancer Aid (via IZKF / MSNZ Würzburg para KK).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

Referências

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