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요약

우리는 성체 마우스의 혀 상피에서 유래한 구강 점막 오가노이드 배양의 생성 및 특성화를 위한 방법을 제시합니다.

초록

입 안을 덮고 있는 구강 점막은 고도로 구획화된 조직으로 협측 점막, 치은, 입술, 입천장, 혀로 세분될 수 있습니다. 구강 상피의 최상층은 성체 줄기세포에 의해 일생 동안 유지됩니다. 성체 상피 줄기 세포의 증식 및 분화는 in vivo 마우스 모델과 in vitro 모델을 기반으로 하는 2차원(2D) 공급 세포를 사용하여 집중적으로 연구되었습니다. 이러한 방법을 보완하는 것은 오가노이드 기술로, 성체 줄기세포를 세포외 기질(ECM)이 풍부한 하이드로겔에 삽입하고 정의된 성장 인자 칵테일을 포함하는 배양 배지를 제공합니다. 이러한 조건에서 성체 줄기세포는 증식하여 자발적으로 오가노이드(organoid)라고 하는 3차원(3D) 세포 클러스터를 형성합니다. 오가노이드 배양은 처음에 쥐의 소장 상피 줄기 세포에서 확립되었습니다. 그러나 이 방법은 이후 다른 상피 줄기 세포 유형에 맞게 조정되었습니다. 여기에서는 쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 생성 및 특성화를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 일차 상피 세포는 쥐의 혀 조직에서 분리되어 ECM 하이드로겔에 삽입되고 표피 성장 인자(EGF), R-스폰딘 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 10를 포함하는 배지에서 배양됩니다. 초기 파종(seeding) 후 7일에서 14일 이내에 생성된 오가노이드(organoid)를 추가 확장 및 동결 보존을 위해 계대배양할 수 있습니다. 또한 3D 전체 마운트 이미징 및 유전자 발현 분석을 통해 확립된 오가노이드 배양의 특성화를 위한 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 환원주의적 방식으로 생체 외 구강 상피 줄기 세포 행동을 조사하는 도구 역할을 할 수 있습니다.

서문

구강 점막은 입 안을 덮고 있는 점막막입니다. 그것은 소화관의 입구로 기능하며 소화 과정의 시작에 관여합니다 1,2. 또한 구강 점막은 외부 환경에 대한 우리 몸의 장벽 역할을 하여 물리적, 화학적, 생물학적 모욕으로부터 보호합니다1. 기능과 조직학에 따라 포유류의 구강 점막은 저작 점막(경구개 및 치은 포함), 내막 점막(연구개 표면, 혀의 복부 표면 및 협측 표면으로 기능), 특수 점막(혀의 등쪽 표면을 덮음)의 세 가지 유형으로 나눌 수 있습니다2. 모든 구강 점막 조직은 두 개의 층으로 구성됩니다: 표면 층화된 편평 상피와 그 아래에 있는 얇은 판propria 1. 구강 상피 각질세포(oral epithelial keratinocyte)는 상피의 주요 세포 유형으로, 랑게르한스 세포(Langerhans cells)와 같은 상피내 면역 세포의 위치이기도 합니다1. 기질 구획(plamal compartment)인 얇은 판 프로프리아(lamina propria)는 섬유아세포(fibroblast), 내피 세포(endothelial cell), 신경 세포(neuronal cell), 면역 세포(immune cell)와 같은 다양한 세포 유형으로 구성된다1. 모든 성층 상피에서와 마찬가지로 줄기 세포와 전구 세포는 구강 상피의 기저층에 상주합니다1. 이러한 특수 세포는 세포 분열을 통해 손실된 조직을 대체할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 따라서 성인 생활 전반에 걸쳐 세포 회전율에 영양을 공급합니다3. 장 상피4 또는 피부 표피5와 같은 다른 상피와 달리 구강 상피는 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. 그러나 최근 연구에서는 생쥐 1,6,7,8의 구강 상피 줄기 및 전구 세포를 표시하는 Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 및 Gli1과 같은 다양한 유전자를 발견했습니다. 구강 상피는 구강암의 기원이며 점막 염증, 상처및 재생에 중요한 역할을 하기 때문에 1 구강 상피의 기본 세포 생물학에 대한 더 나은 이해는 잠재적인 새로운 치료 접근법과 약물 발견에 가장 중요합니다.

동물 모델은 구강 점막 상피에 대한 기초 연구에 널리 사용되어 왔다1. 예를 들어, 앞서 언급한 구강 상피 줄기 및 전구 세포의 마커는 주로 유전자 계통 추적 마우스 모델 1,6,7,8,9를 사용하여 정의되었습니다. 그러나 인간 또는 쥐 기원의 배양된 세포를 사용하는 생체 외 접근법도 광범위하게 사용되었습니다10. 종래, 이러한 세포 배양 작업은 구강 편평 세포 암종(OSCCs)에서 유래한 세포주 또는 (자발적 또는 유전적으로 불멸화된) 일차 세포로부터 생성된 세포주를 사용하여 수행되었습니다10. 이러한 2D 세포 배양 방법은 성체 동종화(homoeostasis)를 조사하는 데 중요한 영향을 미치는 한계가 있습니다: (1) 세포 불멸화는 상당한 수준의 유전적 불안정성, (2) 제한된 분화 능력, (3) 영양 세포에 대한 요구 사항, (4) 혈청11을 포함하는 크게 정의되지 않은 성장 배지를 동반합니다. 총체적으로, 이러한 황금 표준 시험관 내 방법은 상피 줄기 세포의 증식 및 분화 능력과 야생형 게놈 형질전환 능력을 제한하지 않고는 상피 줄기 세포의 장기 배양을 허용하지 않았습니다.

오가노이드 기술은 가까운 천연 상피 조직의 배양을 확립하는 도구로 부상했습니다 in vitro11. 2009년 연구에서 Sato 등은 최초의 상피 오가노이드 배양 시스템을 설명했습니다12. 그들의 방법은 Wnt/β-catenin 표적 유전자로 표시된 개별 소장 줄기 세포를 삽입하는 것을 기반으로 했습니다 Lgr5133D 세포외 기질(ECM)이 풍부한 하이드로겔로 변환12. 줄기세포형성에 중요한 성장 인자의 정의된 칵테일을 제공함으로써, 씨앗을 뿌린 성체 상피 줄기세포는 배양에서 자신의 능력까지 증식할 수 있었습니다12. 결국, 모든 주요 장 상피 세포 유형을 포함하는 활발하게 순환하는 줄기 세포에서 세포 클러스터가 형성되었습니다12, 효과적으로 기원 조직과 유사11. 기존의 2D 배양과 달리, 오가노이드 기술은 혈청이 없고 완전히 정의된 배지를 사용하여 먹이가 없는 조건에서 쥐 장 상피 줄기세포를 장기간 유지할 수 있었습니다10,11. 또한, 이 방법은 배양된 줄기세포의 유전적 구성이나 표현형을 크게 변화시키지 않습니다11. 더욱이, 장기간의 배양은 세포 불멸화에 대한 요구 사항 없이 줄기세포의 증식 및 분화 능력을 유지했습니다11. 불과 10년이 조금 넘는 기간 내에 이 초기 상피 오가노이드 배양 시스템은 결장(대장)과 같은 다른 많은 상피 조직에서 성체 줄기 세포를 성장시키도록 수정되었습니다12,14,15자궁내막16간17,18폐19,20, 유선(mammary gland)21난소22췌23,24, 피부 표피25, 그리고 위장26. 대부분의 프로토콜은 인간과 같은 포유류에서 유래한 성체 상피 줄기세포를 사용했지만11,27마우스11고양이28개29, 그리고 돼지30, 심지어 뱀 독샘에서 상피 오가노이드를 생성하는 것도 가능했습니다31. 오가노이드 기술은 높은 수준의 다양성을 지닌 널리 사용되는 줄기세포 배양 방법이 되었습니다11. 상피 오가노이드는 대부분 유전적으로 남아 있습니다.32,33그리고 표현형적으로 안정적이며, 유전자 편집을 위한 훌륭한 모델입니다34,35유전자 기능을 연구하기 위해36또는 종양 형성27,37,38,39,40. 또한 오가노이드 배양을 마우스에 이식할 수 있습니다37,41숙주-미생물 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다.42(병원성 감염 포함43,44,45). 또한, 오가노이드 기반은 면역 세포와 같은 미세환경의 세포와 공동 배양합니다.46,47,48및 섬유아세포49,50 에 기재되어 있습니다. 질병의 맥락에서 오가노이드는 여러 세대에 걸쳐 살아있는 조직 바이오뱅크에 사용되어 왔습니다21,22,51약물 테스트뿐만 아니라27효능52,53및 독성54.

이 프로토콜에서는 쥐의 혀 상피에서 구강 점막 오가노이드 배양의 확립 및 유지를 위한 최적화된 방법론을 설명합니다. 이는 효소 소화를 사용하여 혀 상피를 분리하는 것과55 마우스와 인간 구강 점막에서 상피 오가노이드를 유도하는 것을 설명하는 이전 보고를 기반으로 합니다52,53. 쥐 구강 점막 오가노이드의 성장 배지에는 줄기세포 상태를 유지하는 중요한 요인이 포함되어 있습니다. R-spondin은 Wnt/β-catenin 신호전달 cascade5를 활성화하고, 표피성장인자(EGF) 및 섬유아세포 성장인자(FGF) 10은 MAPK/ERK 경로 및 PI3K/AKT/mTOR 경로25와 같은 여러 신호전달 경로를 자극하는 수용체 티로신 키나아제의 사이토카인 및 리간드입니다. 또한 유전자 및 단백질 발현 분석을 통해 오가노이드 배양을 특성화하고 기원 조직과 비교하는 방법을 자세히 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 동물 실험에 대한 유럽 연합 및 독일 법률에 따라 수행되었습니다.

참고: 멸균 수술 도구(가는 집게, 가는 가위, 메스)와 차가운 PBSO로 채워진 페트리 접시를 포함한 작업 장소를 준비하십시오. BME를 밤새 해동하고 사용할 때까지 4°C 또는 얼음 위에 보관하십시오. 세포 분리를 시작하기 전에 밤새 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 예열합니다. 모든 자료는 재료 표에 나와 있습니다.

1 쥐 구강 점막 오가노이드 배양 확립

  1. 쥐 혀의 해부
    1. 제도적 지침과 해당 국가 및 정부 간 법률에 따라 마우스를 안락사시킵니다.
      참고: 이 프로토콜의 경우, 경추 탈구로 인해 머리가 불안정해질 수 있으므로 생쥐는 CO2 노출에 의해 안락사되었으며, 이로 인해 장기 적출에 어려움이 생길 수 있습니다.
    2. 마우스를 등에 눕히고 발을 적절한 밑받침에 고정하여 고정합니다.
    3. 마우스가 완전히 젖을 때까지 70% EtOH를 분사하여 마우스를 소독합니다.
    4. 가위로 피부를 자르되, 처음에는 흉골에서 입술까지 기관을 따라 수직으로, 그 다음에는 기관에서 양쪽의 쇄골을 향해 수평으로 자릅니다. 절개 부위는 약 2cm 정도입니다.
    5. 털을 옆으로 당겨 턱을 드러냅니다.
    6. 턱 근육을 구강 뒤쪽까지 자릅니다.
    7. 두 개의 집게를 사용하여 아래턱과 위턱을 반대 방향으로 당겨 구강을 최대한 열어 아래턱의 탈구를 초래합니다.
    8. 뭉툭한 집게를 사용하여 혀를 잡고 뒤를 세로로 잘라 가능한 한 많은 혀를 제거합니다.
    9. Mg2+ 및 Ca2+ (PBSO)가 없는 차가운 PBS에 혀를 넣습니다.
    10. 혀를 수평으로 잘라 등쪽과 배쪽 혀 점막을 분리합니다.
      참고: 등쪽 혀 점막은 혀의 위쪽이고 복부 혀는 구강 바닥과 접촉하는 혀의 아래쪽입니다. 두 점막은 등쪽 혀 점막이 눈에 띄게 거칠어지는 반면 복부 혀 점막은 매끄러운 표면을 가지고 있기 때문에 형태에 따라 구별 될 수 있습니다. 복부 혀는 등쪽 혀보다 작은 면적을 덮습니다(~ 5 x 2mm 복부 혀, ~ 8 x 3mm 등쪽 혀).
    11. 선택 사항: 동결 보존을 위해 혀의 한 부분을 고정제(예: 4% 파라포름알데히드) 또는 최적 절단 온도(OCT) 매체에 고정합니다.
    12. 선택 사항: -80 °C에서 RNA 또는 단백질 분리를 위한 스냅 동결 단편.
  2. 상피와 lamina propria의 분리를 위한 소화
    1. PBSO에 1mg/mL 콜라겐분해효소 A와 2mg/mL Dispase II를 함유한 신선한 효소 칵테일을 준비하고 사용하기 전에 37°C로 예열 용액을 준비합니다.
    2. 26G 바늘을 사용하여 혀의 뒤쪽 절단 끝에서 상피하 공간으로 최소 500μL의 효소 칵테일을 주입합니다.
    3. 바늘을 얇은 판과 그 아래 근육을 천공하는 조직에 깊숙이 삽입하고 상피와 평행을 유지하면서 조심스럽게 삽입합니다.
    4. 바늘을 천천히 집어넣으면서 칵테일을 주입합니다.
      참고: 색이 밝아지고 혀 조직이 눈에 띄게 확장되면 소화 효소가 충분히 주입되었음을 확인할 수 있습니다. 또한 상피 아래에 투명한 상이 유도되면 적절한 주입을 나타냅니다.
    5. 주입을 최대 5회까지 반복합니다.
    6. 조직을 동일한 효소 칵테일이 들어 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    7. 셰이커(300rpm에서)에서 37°C에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
    8. 조직을 PBSO가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
    9. 핀셋으로 근육과 혀끝을 잡고 상피에서 근육을 조심스럽게 당겨 빼냅니다. 아마도 뒤쪽 절단 끝에서 저항이 발생하면 뭉툭한 핀셋으로 상피를 들어 올립니다.
    10. 분리된 상피를 PBSO로 세척하고 원하는 용도로 진행합니다. 오가노이드 확립의 경우 1.3.1 단계로 진행하고 조직 전체 마운트 준비의 경우 4.1.1 단계로 진행합니다.
  3. 일차 조직에서 쥐 구강 점막 오가노이드 확립
    1. 상피를 약 2 x 2mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
    2. 37°C에서 PBSO에 0.125% 트립신을 첨가한 1mL로 조직을 분해합니다.
      알림: 소화는 30분을 초과해서는 안 됩니다.
    3. 10분마다 흔들어 정기적으로 소화를 확인하십시오.
    4. 혼합물이 흐려지거나(조직의 양에 따라 다름) 세포 덩어리의 혼합물이 관찰되면 5초 동안 볼텍싱하고 10-20회 위아래로 피펫팅하여 파괴를 확장합니다.
    5. 10mL의 Advanced DMEM/F12+++ 배지를 보충하여 한 번 세척합니다.
    6. 70μm cell-strainer를 사용하여 cell suspension을 직접 여과합니다.
    7. 350 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기.
    8. 상등액을 버리고 카운팅을 위해 1mL의 Advanced DMEM/F12+++ 배지에 세포를 재현탁합니다.
    9. Neubauer 계수 챔버 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 세포를 계수합니다.
    10. 350 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
    11. 펠릿을 BME에 다시 현탁시킵니다(응고를 방지하기 위해 BME를 얼음 위에 두십시오). 세포 수(약 10,000개 세포/40μL BME)에 따라 BME의 양을 계산합니다. 배지를 완전히 흡입할 수 없는 경우 100μL 피펫을 사용하여 나머지 매체를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: BME의 농도는 70% 이상이어야 하며, 이는 불충분한 응고로 이어질 수 있습니다.
    12. P100 피펫을 사용하여 예열된 세포 배양(현탁액) 플레이트의 바닥에 있는 세포를 10μL 액적으로 플레이트링합니다.
    13. 배양 플레이트를 인큐베이터에 30분-1시간 동안 거꾸로 놓고 BME가 응고되도록 합니다.
    14. ROCK 억제제와 Primocin을 갓 첨가한 필요한 양의 쥐 구강 점막 오가노이드 배지를 준비합니다( 재료 표 및 표 1 참조).
    15. 응고 후, 물방울 분리를 방지하기 위해 웰 벽에 조심스럽게 피펫팅하여 예열된 배지를 세포 방울에 추가합니다.
    16. 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
    17. 2-3일마다 매체를 교체하십시오. ROCK 억제제와 Primocin은 처음 두 통로 동안 배양 배지에 머무릅니다.

2 쥐 구강 점막 오가노이드의 패시징, 동결 보존 및 해동

  1. 쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 패시징
    1. 쥐 구강 점막 오가노이드는 초기 도금 후 10일에서 12일 사이에 처음으로 배양할 수 있습니다.
    2. 분리를 위해 P1000 피펫으로 배지의 BME 방울을 재현탁하고 2mL의 얼음처럼 차가운 PBSO가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
    3. 얼음처럼 차가운 Advanced DMEM/F12+++ 배지 5mL로 용량을 채웁니다.
    4. 300 x g 의 원심분리기 오가노이드를 4°C에서 5분 동안 사용합니다.
    5. 상층액을 흡인하고 PBSO에서 0.125% 트립신을 사용하여 오가노이드를 분해합니다.
    6. 펠릿을 1mL의 0.125% 트립신 용액에 재현탁시키고 오가노이드가 조각으로 부서질 때까지 37°C에서 현탁액을 배양합니다. 2분마다 소화를 확인하십시오.
    7. P1000 피펫을 사용하여 20-30회 위아래로 피펫팅하여 세포 현탁액을 철저히 재현탁하고 P200 피펫으로 거친 재현탁을 반복합니다.
    8. 10mL의 Advanced DMEM/F12+++ 배지로 세포를 세척합니다.
    9. 선택 사항: 70μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 직접 필터링하여 균일한 세포 현탁액을 생성합니다.
    10. 350 x g 에서 4°C에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
    11. 상등액을 흡입하고 BME에서 펠릿을 재현탁하고 1.3.8-1.3.17 단계에 설명된 대로 오가노이드를 진행합니다.
  2. 쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 동결 보존 및 해동
    1. 냉동 보존을 위해 쥐 구강 점막 오가노이드가 패시에이징 후 3-5일 동안 자라도록 합니다.
    2. 2.1.2-2.1.4단계에 설명된 대로 배양 플레이트에서 오가노이드를 분리합니다.
    3. 원심분리 후 1mL의 동결 배지(10% FCS 및 10% DMSO를 함유한 Advanced DMEM/F12+++ 배지)에 오가노이드를 재현탁하고 세포 현탁액을 2mL 극저온으로 옮깁니다.
    4. -80°C에서 최대 24시간 동안 원하는 냉동 용기에 셀을 넣습니다. 장기 보관을 위해 셀을 -120 °C 이하로 유지하십시오(예: 액체 질소 탱크).
    5. 37°C에서 동결 보존된 세포를 해동하고 세포 현탁액을 9mL의 예열된 Advanced DMEM/F12+++ 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 빠르게 옮깁니다.
    6. 350 x g 및 4°C에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
    7. 상층액을 버리고 1.3.8-1.3.17 단계에 설명된 대로 오가노이드를 진행합니다.

3 쥐, 구강 점막 조직 및 오가노이드의 유전자 발현 분석

  1. 쥐, 구강 점막 오가노이드 및 천연 조직에서 RNA 추출
    1. 2.1.2-2.1.4 단계에 설명된 대로 쥐 구강 점막 오가노이드를 수확합니다.
    2. 상층액을 버리고 오가노이드를 차가운 PBSO로 세척합니다.
    3. 오가노이드를 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    4. 네이티브 조직에서 RNA를 분리하려면 분리된 상피를 사용합니다(1.2.10단계 참조).
    5. 조직을 2mm x 2mm의 작은 조각으로 자릅니다.
    6. RNA 분리를 위해 확립된 방법 또는 키트를 사용하십시오: 오가노이드 또는 조직 조각을 각각 350 또는 700 μL 용해 완충액에 재현탁합니다.
    7. 최소 10초 동안 오가노이드를 거칠게 소용돌이치게 용해하고 최소 30초 동안 조직을 용해시킵니다.
    8. 용액을 -80°C에서 최소 2시간 동안 놓습니다.
    9. 얼음에서 세포 용해물을 해동하고 제조업체의 지침에 따라 RNA 분리를 진행합니다.
  2. 역전사 반응에 의한 cDNA 합성
    1. RNA 농도를 측정하고 0.1-1 μg의 총 RNA 입력에 대한 부피를 계산합니다.
    2. cDNA 합성의 경우 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하십시오. 이 실험을 위해 다음 제형이 사용되었습니다 : 4 μL의 5x 반응 혼합물, 1 μL의 역전사 효소, x μL의 총 RNA 0.1-1 μg 및 x μL의 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피의 최대 20 μL까지 사용할 수 있습니다.
    3. 다음 프로그램을 사용하여 3단계 cycler 프로그램에서 역전사를 수행합니다: 25°C에서 5분, 42°C에서 30분, 85°C에서 5분.
    4. cDNA는 -20°C에서 보관하십시오.
  3. 정량적 Real-Time PCR에 의한 유전자 발현 분석
    1. 정량적 Real-Time PCR의 경우, 기술적 중복에서 모든 반응을 수행합니다.
    2. qPCR Supermix 5μL, 역방향 프라이머(400nM) 1μL, 순방향 프라이머(400nM) 1μL, cDNA(10-20ng/well) 1μL 및 뉴클레아제가 없는 물 2μL의 혼합물을 준비합니다.
    3. 증폭을 위해 다음과 같은 표준 설정을 사용하십시오: 95°C에서 30초 동안 중합효소 활성화 및 DNA 변성, 95°C에서 5-10초 동안 변성, 60°C에서 40주기 동안 60초 동안 어닐링/확장 및 플레이트 판독. 65-95°C에서 2-5초/단계로 0.5°C 단위로 용융 곡선 분석을 수행합니다(또는 기기의 기본 설정 사용).
    4. ΔCt 또는 ΔΔCt 방법56과 같은 원하는 방법을 사용하거나 주어진 지침에 따라 열순환기 제조업체에서 제공하는 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

4: 쥐, 구강 점막 조직 및 오가노이드의 단백질 발현 분석

참고: 혀 상피의 전체 마운트 염색은 24웰 플레이트에서 수행되었으며, 각 단계에서 겸자로 조직을 웰에서 웰로 이동시켰습니다.

  1. 쥐 구강 점막 조직 및 오가노이드 배양의 고정
    1. 조직 전체 마운트 염색의 경우 1.2.10단계부터 진행하여 4.1.5단계를 계속합니다.
    2. 오가노이드 염색의 경우 2.1.2단계에 설명된 대로 오가노이드를 수확하고 4.1.3단계를 계속합니다.
    3. 세포 현탁액에 PBSO 10mL를 보충합니다.
    4. 세포 현탁액을 350 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    5. 상피 또는 오가노이드를 4% 파라포름알데히드에 실온(21°C)에서 30분 동안 고정합니다.
    6. PBSO에서 샘플을 한 번 세척합니다. 오가노이드를 350 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
  2. 쥐 구강 점막 조직 및 오가노이드 배양의 전체 마운트 염색
    1. 실온에서 20분 동안 0.2% Triton X-100 용액에 시료를 배양하여 항원결정기의 가면을 벗깁니다.
    2. 샘플을 차단 용액(PBSO의 5% 당나귀 혈청)으로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. 차단 용액에 항체를 희석하고 항체 용액에 시료를 4°C에서 밤새 배양합니다.
    4. ddH2O에 0.1% Tween-20 및 1% PBSO가 함유된 세척 버퍼로 세포 또는 조직을 세 번(각 5분) 세척합니다.
    5. 2차 항체를 PBSO에서 1:400으로 희석합니다.
    6. 샘플을 실온에서 3시간 동안 2차 항체 용액에 배양합니다.
    7. 세탁 단계 반복 4.2.4. 조직 샘플의 경우 4.2.8단계를 진행합니다. 오가노이드 샘플의 경우 4.2.9단계를 진행합니다.
    8. 상피를 기저 쪽(lamina propria에 부착된 쪽)이 위를 향하도록 슬라이드에 놓습니다. DAPI와 커버 슬립이 있는 수성 마운트턴트에 상피를 장착합니다. 4.2.11단계를 진행합니다.
    9. 오가노이드 샘플의 경우, 착색된 오가노이드를 실온에서 응고되는 적절한 겔 매트릭스에 재현탁합니다.
    10. 방울을 96웰 유리 바닥판(5 μL/well)에 빠르게 피펫으로 주입합니다. 접시를 얼음 위에 놓고 젤 매트릭스가 15분 동안 굳어지도록 합니다. 웰당 100μL를 첨가하여 DAPI를 사용하여 수성 마운트에 오가노이드를 장착합니다.
    11. 이미지 분석까지 빛으로부터 보호되는 4°C에서 염색된 샘플을 보관하십시오.

결과

이 프로토콜은 효소 칵테일을 사용하여 혀 상피를 기저 얇은 판 및 근육에서 분리하는 방법을 설명합니다(그림 1). 분리된 상피는 오가노이드 생성에 추가로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 유형의 유전자 및 단백질 분석을 위해 수확할 수 있습니다. 마찬가지로, lamina propria와 근육의 소화 된 층은 선택한 절차에 사용될 수 있습니다.

토론

조직 소화
콜라겐분해효소 소화는 기저에 있는 얇은 판(lamina propria)과 근육 조직(muscle tissue)에서 상피를 분리하는 데 도움이 됩니다. 이 단계를 통해 일차 조직과 이후에 생성된 구강 점막 오가노이드를 더 잘 비교할 수 있습니다. 효소의 과소화는 성체 상피 줄기 세포의 오가노이드 형성 능력에 영향을 미치므로 콜라겐분해효소 배양은 1시간 이하, 트립신 ?...

공개

K.K.는 오가노이드 기술과 관련하여 출원 중인 특허의 발명자로 선정되었습니다.

감사의 말

저자는 도움을 준 Sabine Kranz에게 감사를 표합니다. 이 연구를 지원해 주신 IZKF Würzburg의 Core Unit for Confocal Microscopy and Flow Cytometry-based Cell Sorting에 감사드립니다. 이 연구는 독일 암 원조(German Cancer Aid)의 보조금으로 지원되었습니다(IZKF/MSNZ 뷔르츠부르크를 통해 K.K.로).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

참고문헌

  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568 (2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912 (2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375 (2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493 (2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588 (2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

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