JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שיטה ליצירה ואפיון של תרביות אורגנואידים ברירית הפה שמקורן באפיתל הלשון של עכברים בוגרים.

Abstract

הרירית המכסה את החלק הפנימי של הפה שלנו, רירית הפה, היא רקמה ממודרת מאוד וניתן לחלק אותה לרירית הבוקאלית, חניכיים, שפתיים, חיך ולשון. השכבה העליונה שלו, אפיתל הפה, נשמרת על ידי תאי גזע בוגרים לאורך כל החיים. התפשטות והתמיינות של תאי גזע אפיתל בוגרים נחקרו באופן אינטנסיבי באמצעות מודלים של עכברים in vivo וכן תאי הזנה דו-ממדיים (2D) המבוססים על מודלים במבחנה . משלימה לשיטות אלה היא טכנולוגיית אורגנואידים, שבה תאי גזע בוגרים מוטמעים בהידרוג'ל עשיר במטריצה חוץ-תאית (ECM) ומסופקים עם מדיום תרבית המכיל קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה. בתנאים אלה, תאי גזע בוגרים מתרבים ויוצרים באופן ספונטני אשכולות תאים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), מה שנקרא אורגנואידים. תרביות אורגנואידים הוקמו בתחילה מתאי גזע אפיתל במעי הדק של עכברים. עם זאת, השיטה הותאמה מאז לסוגים אחרים של תאי גזע אפיתליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירה ואפיון של תרביות אורגנואידים ברירית הפה של עכברים. תאי אפיתל ראשוניים מבודדים מרקמת לשון העכבר, מוטמעים בהידרוג'ל ECM, ומתורבתים במדיום המכיל: גורם גדילה אפידרמלי (EGF), R-ספונדין וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) 10. תוך 7 עד 14 ימים מהזריעה הראשונית, ניתן להעביר את האורגנואידים המתקבלים להרחבה נוספת ושימור בהקפאה. בנוסף אנו מציגים אסטרטגיות לאפיון תרביות אורגנואידים מבוססות באמצעות הדמיה תלת מימדית שלמה וניתוח ביטוי גנים. פרוטוקול זה עשוי לשמש ככלי לחקירת התנהגות תאי גזע אפיתל אוראליים ex vivo באופן רדוקציוניסטי.

Introduction

רירית הפה היא הרירית המכסה את פנים הפה שלנו. הוא מתפקד ככניסה לדרכי העיכול ומעורב בהתחלת תהליך העיכול 1,2. בנוסף, רירית הפה משמשת כמחסום של גופנו לסביבה החיצונית ומספקת הגנה מפני עלבונות פיזיים, כימיים וביולוגיים1. בהתבסס על התפקוד וההיסטולוגיה, ניתן לחלק את רירית הפה ביונקים לשלושה סוגים: רירית לעיסה (כולל החך הקשה והחניכיים), רירית הרירית (מתפקדת כמשטח החיך הרך, משטח הגחון של הלשון ומשטח הבוקאלי), והרירית המיוחדת (המכסה את פני השטח הגביים של הלשון)2. כל רקמות רירית הפה מורכבות משתי שכבות: האפיתל הקשקשי המרובד על פני השטח והלמינה פרופריה1 הבסיסית. קרטינוציט האפיתל האוראלי הוא סוג התא העיקרי של האפיתל, שהוא גם מיקומם של תאי חיסון תוך-אפיתליים כגון תאי לנגרהנס1. תא הסטרומה, הלמינה פרופריה, מורכב מסוגי התאים השונים כגון פיברובלסטים, תאי אנדותל, תאים עצביים ותאי חיסון1. כמו בכל האפיתל המרובד, תאי גזע ואב שוכנים בשכבת הבסיס של אפיתל הפה1. לתאים מיוחדים אלה יש את היכולת להחליף רקמות שאבדו באמצעות חלוקות תאים, ולכן להזין את תחלופת התאים לאורך החיים הבוגרים3. בניגוד לאפיתל אחר כמו אפיתל המעי4 או אפידרמיס העור5, אפיתל הפה נותר לא מובן היטב. עם זאת, מחקרים אחרונים חשפו גנים שונים כגון Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 ו-Gli1 המסמנים גזע אפיתל ותאי אב בעכברים 1,6,7,8. מכיוון שהאפיתל האוראלי הוא המקור לקרצינומות הפה ושחקן קריטי בדלקת רירית, פציעה והתחדשות1, הבנה טובה יותר של הביולוגיה הבסיסית של התא היא בעלת חשיבות עליונה לגישות טיפוליות חדשות פוטנציאליות ותגליות תרופות.

מודלים של בעלי חיים היו בשימוש נרחב למחקרים בסיסיים על אפיתל רירית הפה1. לדוגמה, הסמנים הנ"ל של תאי גזע אפיתל ותאי אב הוגדרו במידה רבה באמצעות מודלים של עכברים העוקבים אחר שושלת גנטית 1,6,7,8,9. עם זאת, גישות ex vivo המשתמשות בתאים מתורבתים ממוצא אנושי או עכברי היו בשימוש נרחב10. באופן קונבנציונלי, עבודת תרבית תאים כזו בוצעה באמצעות קווי תאים שמקורם בקרצינומה של תאי קשקש בפה (OSCCs) או קווי תאים שנוצרו מתאים ראשוניים אימורטליים (ספונטניים או גנטיים)10. לשיטות תרבית תאים דו-ממדיות אלה יש מגבלות עם השלכות קריטיות על חקירת ההומיאוסטזיס הבוגר: (1) אימורטליזציה של תאים מלווה בדרגה רבה של חוסר יציבות גנטית, (2) יכולת מוגבלת להתמיין, (3) דרישה לתאי הזנה, ו-(4) מצע גידול לא מוגדר ברובו המכיל סרום11. באופן קולקטיבי, שיטות תקן הזהב הללו לא אפשרו תרביות ארוכות טווח של תאי גזע אפיתל מבלי להגביל את יכולתם להתרבות ולהתמיין כמו גם לשנות את הגנום הפראי שלהם.

טכנולוגיית אורגנואידים התגלתה ככלי להקמת תרביות של רקמת אפיתל קרובה לילידים in vitro11. במחקרם משנת 2009, סאטו ועמיתיו תיארו את מערכת תרבית האורגנואידים האפיתל הראשונה12. השיטה שלהם התבססה על הטמעת תאי גזע בודדים במעי הדק המסומנים על ידי גן המטרה Wnt/β-catenin Lgr513להידרוג'ל עשיר במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (ECM)12. על ידי מתן קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה החשובים לגבעול, תאי הגזע האפיתל הבוגרים שנזרעו הצליחו להתרבות ליכולתם בתרבית12. בסופו של דבר, אשכולות תאים נוצרו מתאי גזע פעילים המכילים את כל סוגי תאי האפיתל העיקריים במעי12הדומה ביעילות לרקמת המקור,11. בניגוד לתרביות דו-ממדיות קונבנציונליות, טכנולוגיית האורגנואידים אפשרה תחזוקה ארוכת טווח של תאי גזע אפיתל במעי העכברים בתנאים נטולי הזנה עם מדיום נטול סרום ומוגדר במלואו10,11. בנוסף, השיטה אינה משנה באופן משמעותי את ההרכב הגנטי או הפנוטיפ של תאי הגזע המתורבתים11. יתר על כן, תרבית ארוכת טווח שמרה על יכולתו של תאי הגזע להתרבות ולהתמיין ללא צורך באימורטליזציה של תאים11. תוך קצת יותר מעשור, מערכת תרבית אורגנואידים אפיתל מוקדמת זו תוקנה לגידול תאי גזע בוגרים מרקמות אפיתל רבות אחרות כגון המעי הגס (המעי הגס)12,14,15רירית הרחם,16כבד17,18ריאות19,20בלוטות החלב,21השחלות22לבלב23,24אפידרמיס העור,25ובבטן,26. בעוד שרוב הפרוטוקולים השתמשו בתאי גזע אפיתל בוגרים שמקורם ביונקים כמו בני אדם11,27עכברים11חתולים28כלבים29וחזירים,30ניתן אפילו ליצור אורגנואידים אפיתל מבלוטות ארס נחשים.,31. טכנולוגיית אורגנואיד הפכה לשיטת תרבית תאי גזע בשימוש נרחב עם רמה גבוהה של צדדיות11. מכיוון שאורגנואידים אפיתל נשארים במידה רבה גנטית32,33ויציבים פנוטיפיים הם מודלים מצוינים לעריכת גנים34,35לחקור את תפקוד הגן36או גידול27,37,38,39,40. בנוסף, ניתן להשתיל תרביות אורגנואידים בעכברים37,41ומשמשים לחקר אינטראקציות בין חיידקים פונדקאים42(כולל זיהומים פתוגניים43,44,45). יתר על כן, תרביות משותפות מבוססות אורגנואידים עם תאים של המיקרו-סביבה כגון תאי חיסון46,47,48ופיברובלסטים49,50 תוארו. בהקשר של מחלות, אורגנואידים שימשו במשך דורות של בנקים ביולוגיים של רקמות חיות21,22,51כמו גם בדיקת תרופות27ליעילות52,53ורעילות54.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מתודולוגיה אופטימלית להקמה ותחזוקה של תרביות אורגנואידים ברירית הפה מאפיתל לשון העכברים. הוא מבוסס על דיווחים קודמים המתארים את בידוד אפיתל הלשון באמצעות עיכול אנזימטי55 וגזירת אורגנואידים אפיתל מרירית הפה של עכברים ובני אדם52,53. מצע הגידול של אורגנואידים ברירית הפה של עכברים מכיל גורמים קריטיים השומרים על מצב תאי הגזע. R-spondin מפעיל את מפל האיתות Wnt/β-catenin5, בעוד שגורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) 10 הם ציטוקינים וליגנדים של קולטן טירוזין קינאז המעוררים מספר מסלולי איתות כגון מסלול MAPK/ERK ומסלול PI3K/AKT/mTOR25. אנו מתארים עוד בפירוט כיצד ניתן לאפיין את תרביות האורגנואידים על ידי ניתוח ביטוי גנים וחלבונים ולהשוות לרקמת המקור.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאם לחקיקה של האיחוד האירופי וגרמניה בנושא ניסויים בבעלי חיים.

הערה: הכן את מקום העבודה, כולל מכשירים כירורגיים סטריליים (מלקחיים עדינים, מספריים עדינים ואזמלים) וצלחות פטרי מלאות ב-PBSO קר. יש להפשיר BME למשך הלילה ולשמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח עד לשימוש. יש לחמם מראש צלחות תרבית תאים באינקובטור למשך הלילה לפני תחילת בידוד התאים. כל החומרים מסופקים בטבלת החומרים.

1 הקמת תרבית אורגנואידים ברירית הפה של עכברים

  1. דיסקציה של לשון עכברים
    1. המתת חסד של העכבר על פי ההנחיות המוסדיות והחקיקה הלאומית והבין-ממשלתית המתאימה.
      הערה: עבור פרוטוקול זה, עכברים הורדמו על ידי חשיפה ל-CO2, מכיוון שפריקת צוואר הרחם עלולה להוביל לחוסר יציבות של הראש, מה שגורם לקשיים בקצירת איברים.
    2. הניחו את העכבר על גבו וקבעו אותו על ידי הצמדת הכפות לשכבה תחתונה מתאימה.
    3. חטאו את העכבר על ידי ריסוס ב-70% EtOH עד שהוא רטוב לחלוטין.
    4. חותכים את העור במספריים, תחילה אנכית לאורך קנה הנשימה מעצם החזה לשפה, ואז אופקית מקנה הנשימה לכיוון עצם הבריח משני הצדדים. כל חתך הוא באורך של כ-2 ס"מ.
    5. משוך הצידה את הפרווה כדי לחשוף את הלסת.
    6. חותכים את שרירי הלסת עד לחלק האחורי של חלל הפה.
    7. פתח את חלל הפה ככל האפשר על ידי משיכת הלסת התחתונה והעליונה לכיוונים מנוגדים באמצעות שני מלקחיים, מה שגורם לפריקת הלסת התחתונה.
    8. השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס את הלשון ולהסיר כמה שיותר מהלשון על ידי חיתוך אנכי בגב.
    9. יש להניח את הלשון ב-PBS קר ללא Mg2+ ו-Ca2+ (PBSO).
    10. חותכים את הלשון אופקית כדי להפריד בין רירית הלשון הגבית והגחונית.
      הערה: רירית הלשון הגבית היא הצד העליון של הלשון, והלשון הגחונית היא הצד התחתון של הלשון שנמצא במגע עם רצפת הפה. ניתן להבחין בין שתי הריריות על ידי המורפולוגיה שלהן, שכן רירית הלשון הגבית מחוספסת באופן ניכר, בעוד שלרירית הלשון הגחונית יש משטח חלק. הלשון הגחונית מכסה שטח קטן יותר מהלשון הגבית (~5 x 2 מ"מ לשון גחונית; ~ 8 x 3 מ"מ לשון גב).
    11. אופציונלי: תקן חלק אחד של הלשון במדיום קיבעון (למשל 4% פרפורמלדהיד) או בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לשימור בהקפאה.
    12. אופציונלי: שברי הקפאה בהצמדה לבידוד RNA או חלבון ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. עיכול להפרדת אפיתל ולמינה פרופריה
    1. הכינו קוקטייל אנזימטי טרי המכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז A ו-2 מ"ג/מ"ל Dispase II ב-PBSO ותמיסת חימום ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. הזרקו לפחות 500 מיקרוליטר מהקוקטייל האנזימטי לחלל התת-אפיתל מהקצה האחורי החתוך של הלשון באמצעות מחט 26 גרם.
    3. הכנס את המחט עמוק לתוך הרקמה המחוררת את הלמינה פרופריה ואת השריר הבסיסי שנותר בזהירות במקביל לאפיתל.
    4. הזרקו את הקוקטייל תוך כדי נסיגה איטית של המחט.
      הערה: הבהרה בצבע והתרחבות נראית לעין של רקמת הלשון מאשרים הזרקה מספקת של אנזימי העיכול. כמו כן, אינדוקציה של שלב שקוף מתחת לאפיתל מעידה על הזרקה תקינה.
    5. חזור על ההזרקה עד חמש פעמים.
    6. העבירו את הרקמה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל את אותו קוקטייל אנזימטי.
    7. דגרו את הדגימה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר (ב-300 סל"ד).
    8. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי המכילה PBSO.
    9. תפוס את השריר ואת קצה הלשון בעזרת פינצטה ומשוך בזהירות את השריר הרחק מהאפיתל. אם נתקלים בהתנגדות, כנראה בקצה החיתוך האחורי, הרם את האפיתל בעזרת פינצטה קהה.
    10. שטפו את האפיתל המופרד עם PBSO והמשיכו ליישום הרצוי. להקמת אורגנואידים המשך לשלב 1.3.1 ולתכשירים להרכבה שלמה של רקמות המשך לשלב 4.1.1.
  3. הקמת אורגנואידים ברירית הפה של עכברים מרקמה ראשונית
    1. חותכים את האפיתל לחתיכות קטנות בגודל של כ-2X2 מ"מ.
    2. עכל את הרקמה ב-1 מ"ל של 0.125% טריפסין שנוסף ל-PBSO ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: העיכול לא יעלה על 30 דקות.
    3. בדוק את העיכול באופן קבוע על ידי ניעור כל 10 דקות.
    4. כאשר התערובת נעשית עכורה (תלוי בכמות הרקמה) או כאשר נצפית תערובת של גושי תאים, האריכו את ההפרעה על ידי מערבולת למשך 5 שניות ופיפטינג למעלה ולמטה 10-20 פעמים.
    5. יש לשטוף פעם אחת על ידי מילוי 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12+++ מתקדם.
    6. סנן ישירות את מתלה התא באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
    7. צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום DMEM/F12+++ מתקדם לספירה.
    9. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה של נויבאואר או שיטה שוות ערך.
    10. צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולשאוף את הסופרנטנט.
    11. השהה מחדש את הכדור ב-BME (שמור את ה-BME על קרח כדי למנוע התמצקות). חשב את כמות ה-BME, בהתאם למספר התא (כ-10,000 תאים/40 מיקרוליטר של BME). אם לא ניתן לשאוב את המדיום לחלוטין, הסר בזהירות את שאר חלקיו באמצעות פיפטה של 100 מיקרוליטר.
      הערה: ריכוז ה-BME לא צריך להיות פחות מ-70%, מכיוון שהדבר עלול להוביל להתמצקות לא מספקת.
    12. צלחת את התאים בתחתית לוחות תרבית תאים (השעיה) שחוממו מראש בטיפות של 10 מיקרוליטר באמצעות פיפטה P100.
    13. הנח את צלחת התרבות הפוכה לתוך החממה למשך 30 דקות-שעה כדי לאפשר ל-BME להתמצק.
    14. הכן את הכמות הנדרשת של מדיום אורגנואיד רירית הפה של עכברים שהוסיף טרי מעכב ROCK ופרימוצין (ראה טבלאות חומרים וטבלה 1).
    15. לאחר ההתמצקות, הוסף את המדיום שחומם מראש לטיפות התא על ידי פיפטינג בזהירות על דופן הבארות כדי למנוע ניתוק טיפות.
    16. דגרו את הצלחות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    17. החלף את המדיום כל 2-3 ימים. מעכב ROCK ופרימוצין נשארים במדיום התרבותי בשני המעברים הראשונים.

2 מעבר, שימור בהקפאה והפשרה של אורגנואידים ברירית הפה של עכברים

  1. מעבר של תרביות אורגנואידים ברירית הפה של עכברים
    1. ניתן להעביר אורגנואידים ברירית הפה של עכברים בפעם הראשונה בין 10 ל-12 ימים לאחר הציפוי הראשוני.
    2. לצורך פיצול, השעו מחדש את טיפות ה- BME במדיום בעזרת פיפטה P1000 והעבירו אותן לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל PBSO קר כקרח.
    3. מלאו את הנפח ב-5 מ"ל של מדיום מתקדם DMEM/F12+++ קר כקרח.
    4. אורגנואידים צנטריפוגות ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. שאפו את הסופרנטנט ועכלו את האורגנואידים באמצעות 0.125% טריפסין ב-PBSO.
    6. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת טריפסין של 0.125% ודגרו על תרחיף ב-37 מעלות צלזיוס עד שהאורגנואידים נשברים לחתיכות. בדוק את העיכול כל 2 דקות.
    7. השעו מחדש את מתלה התא ביסודיות על ידי פיפטה למעלה ולמטה 20-30 פעמים באמצעות פיפטה P1000 וחזרו על השעיה קשה עם פיפטה P200.
    8. שטפו את התאים עם 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12+++ מתקדם.
    9. אופציונלי: סנן ישירות את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי ליצור תרחיף תאים הומוגני.
    10. צנטריפוגה את מתלה התא ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    11. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור ב-BME והמשיכו עם האורגנואידים כמתואר בשלבים 1.3.8-1.3.17.
  2. שימור בהקפאה והפשרה של תרביות אורגנואידים ברירית הפה של עכברים
    1. לשימור בהקפאה, תן לאורגנואידים ברירית הפה של העכברים לצמוח במשך 3-5 ימים לאחר המעבר.
    2. נתק אורגנואידים מלוחות התרבית כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.4.
    3. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה (מדיום DMEM/F12+++ מתקדם המכיל 10% FCS ו-10% DMSO) והעבירו את תרחיף התא ל-2 מ"ל קריוביאלים.
    4. מניחים את התאים במיכלי ההקפאה הרצויים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. לאחסון לטווח ארוך, שמור את התאים מתחת ל-120 מעלות צלזיוס, למשל, במיכל חנקן נוזלי.
    5. הפשירו את התאים השמורים בהקפאה ב-37 מעלות צלזיוס והעבירו במהירות את תרחיף התא לצינור חרוטי המכיל 9 מ"ל של מדיום DMEM/F12+++ מתקדם שחומם מראש.
    6. צנטריפוגה את מתלה התא ב-350 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    7. השליכו את הסופרנטנט והמשיכו עם האורגנואידים כמתואר בשלבים 1.3.8-1.3.17.

3 ניתוח ביטוי גנים של רקמת רירית הפה של עכברים ואורגנואידים

  1. מיצוי RNA מאורגנואידים ברירית הפה של עכברים ורקמות מקומיות
    1. קצור את האורגנואידים ברירית הפה של העכברים כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.4.
    2. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את האורגנואידים ב-PBSO קר.
    3. צנטריפוגה את האורגנואידים ב-300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
    4. כדי לבודד RNA מרקמה טבעית, השתמש באפיתל המופרד (ראה שלב 1.2.10).
    5. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות של 2 מ"מ על 2 מ"מ.
    6. לבידוד RNA, השתמש בשיטה או בערכה מבוססת: השעו מחדש אורגנואידים או חלקי רקמה במאגר ליזה של 350 או 700 מיקרוליטר בהתאמה.
    7. מערבולת קשה ליזה אורגנואידים למשך 10 שניות לפחות וליזה של הרקמה למשך 30 שניות לפחות.
    8. מניחים את התמיסה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
    9. הפשירו את הליזאט של התא על קרח והמשיכו בבידוד RNA בהתאם להוראות היצרן.
  2. סינתזת cDNA על ידי תגובת שעתוק הפוך
    1. מדוד את ריכוז ה-RNA וחשב את הנפח עבור כניסת RNA כוללת של 0.1-1 מיקרוגרם.
    2. לסינתזה של cDNA, השתמש בערכת סינתזה של cDNA בהתאם להוראות היצרן. לניסוי זה נעשה שימוש בנוסחה הבאה: 4 מיקרוליטר של תערובת תגובה פי 5, 1 מיקרוליטר של טרנסקריפטאז הפוך, x מיקרוליטר של 0.1-1 מיקרוגרם של RNA כולל ו-x מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז עד 20 מיקרוליטר מהנפח הסופי.
    3. בצע תמלול הפוך בתוכנית מחזורית בת שלושה שלבים עם התוכנית הבאה: 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. יש לאחסן cDNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. ניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת
    1. עבור ה-PCR הכמותי בזמן אמת, בצע את כל התגובות בשכפולים טכניים.
    2. הכינו תערובת של 5 מיקרוליטר של qPCR Supermix, 1 מיקרוליטר של פריימר הפוך (400 ננומטר), 1 מיקרוליטר של פריימר קדימה (400 ננומטר), 1 מיקרוליטר של cDNA (10-20 ננוגרם/באר) ו-2 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
    3. להגברה, השתמש בהגדרות הסטנדרטיות כדלקמן: הפעלת פולימראז ודנטורציה של DNA ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 שניות, חישול/הארכה וקריאת צלחת ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות למשך 40 מחזורים. בצע ניתוח עקומת התכה ב-65-95 מעלות צלזיוס במרווחים של 0.5 מעלות צלזיוס ב-2-5 שניות/שלב (או השתמש בהגדרות ברירת המחדל של המכשיר).
    4. נתח נתונים בשיטות רצויות כגון שיטות ΔCt או ΔΔCt56 או באמצעות תוכנת ניתוח המסופקת על ידי יצרן התרמוסייקלר בהתאם להוראות הנתונות.

4 ניתוח ביטוי חלבונים של רקמת רירית הפה של עכברים ואורגנואידים

הערה: צביעה שלמה של אפיתל הלשון בוצעה בצלחת של 24 בארות, והעבירה את הרקמה בעזרת מלקחיים מבאר לבאר בכל שלב.

  1. קיבוע רקמת רירית הפה של העכברים ותרביות אורגנואידים
    1. עבור צביעת רקמות שלמות המשך משלב 1.2.10 והמשך לשלב 4.1.5.
    2. לצביעה אורגנואידית, קצור אורגנואידים כמתואר בשלב 2.1.2 והמשך לשלב 4.1.3.
    3. מלאו את מתלה התא ב-10 מ"ל PBSO.
    4. צנטריפוגה את מתלה התא ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    5. מקבעים את האפיתל או האורגנואידים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (21 מעלות צלזיוס).
    6. שוטפים את הדגימות פעם אחת ב- PBSO. צנטריפוגה את האורגנואידים ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  2. צביעה שלמה של רקמת רירית הפה של העכברים ותרביות אורגנואידים
    1. חשוף את האפיטופים על ידי דגירה של הדגימות בתמיסת טריטון X-100 של 0.2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. העבירו את הדגימות לתמיסת החסימה (5% סרום חמור ב-PBSO) ודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    3. יש לדלל את הנוגדנים בתמיסת חסימה ולדגור את הדגימות בתמיסת נוגדנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. שטפו את התאים או הרקמות שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם מאגר כביסה המכיל 0.1% Tween-20 ו-1% PBSO ב-ddH2O.
    5. לדלל את הנוגדנים המשניים 1:400 ב-PBSO.
    6. דגרו את הדגימות בתמיסת נוגדנים משנית למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
    7. חזור על שלב הכביסה 4.2.4. לדגימות רקמות, המשך לשלב 4.2.8. לדגימות אורגנואידים, המשך לשלב 4.2.9.
    8. הנח את האפיתל על שקופית כשהצד הבסיסי (הצד שהיה מחובר ללמינה פרופריה) פונה כלפי מעלה. הרכיב את האפיתל בתושבת מימית עם DAPI והחלקת כיסוי. המשך לשלב 4.2.11.
    9. עבור דגימות אורגנואידים, השעו מחדש את האורגנואידים המוכתמים בכל מטריצת ג'ל מתאימה שמתמצקת בטמפרטורת החדר.
    10. הכניסו במהירות טיפות פיפטה לצלחת תחתונה מזכוכית של 96 בארות (5 מיקרוליטר לבאר). מניחים את הצלחת על קרח ונותנים למטריצת הג'ל להתמצק למשך 15 דקות. הרכיבו את האורגנואידים בתושבת מימית עם DAPI על ידי הוספת 100 מיקרוליטר לבאר.
    11. אחסן את הדגימות המוכתמות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנות מאור עד לניתוח התמונה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של אפיתל הלשון מהלמינה פרופריה והשריר הבסיסיים באמצעות קוקטייל אנזימטי (איור 1). האפיתל המופרד יכול לשמש עוד ליצירת אורגנואידים וכן לקצור לסוגים שונים של ניתוחי גנים וחלבונים. כמו כן, ניתן להשתמש בשכבה המעוכלת של למינה פרופריה ?...

Discussion

עיכול רקמות
עיכול הקולגנאז מסייע בהפרדת האפיתל מהלמינה פרופריה הבסיסית ורקמת השריר. שלב זה מאפשר השוואה טובה יותר של הרקמה הראשונית עם האורגנואידים ברירית הפה שנוצרו לאחר מכן. מכיוון שעיכול יתר עם אנזימים משפיע על יכולת יצירת האורגנואידים של תאי הגזע האפיתל ...

Disclosures

ק.ק. מונה כממציא על פטנט ממתין הקשור לטכנולוגיית אורגנואידים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לסבין קראנץ על הסיוע. ברצוננו להודות ליחידת הליבה למיקרוסקופיה קונפוקלית ומיון תאים מבוסס ציטומטריית זרימה של IZKF Würzburg על תמיכתה במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מהסיוע הגרמני לסרטן (באמצעות IZKF/MSNZ Würzburg ל-K.K).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

References

  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568 (2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912 (2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375 (2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493 (2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588 (2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved