JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح وإظهار تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للفلوريد الدقيق لأنسجة القلب البشرية المنحازة للغاية ، والمكونة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي تشارك في استزراعها مع الخلايا الليفية القلبية (CFs) داخل هيدروجيل حيوي قائم على الكولاجين ، للتطبيقات في هندسة أنسجة القلب ، وفحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض.

Abstract

السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم لا يزال كما أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). ومع ذلك ، فإن نمذجة التعقيد الفسيولوجي والبيولوجي لعضلات القلب ، عضلة القلب ، من الصعب تحقيقها في المختبر. أساسا، تكمن العقبات في الحاجة إلى خلايا القلب البشرية (CMs) التي هي إما الكبار أو تظهر الأنماط الظاهرية مثل الكبار ويمكن تكرار بنجاح تعقيد عضلة القلب الخلوية والهندسة المعمارية المعقدة 3D. لسوء الحظ ، بسبب المخاوف الأخلاقية وعدم وجود أنسجة القلب البشرية الأولية المشتقة من المريض ، إلى جانب الحد الأدنى من انتشار CMs ، كان الحصول على CMs البشرية القابلة للحياة خطوة محدودة لهندسة أنسجة القلب. وتحقيقا لهذه الغاية، تحولت معظم البحوث نحو التمايز القلبي للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hiPSCs) كمصدر رئيسي ل CMs البشرية، مما أدى إلى دمج hiPSC-CMs على نطاق واسع ضمن المقايسات المختبرية لنمذجة الأنسجة القلبية.

هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير 3D ناضجة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic. نحن نشرح ونوضح بصريا إنتاج نموذج أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد في المختبر على رقاقة من CMs المشتقة من hiPSC. نحن نصف في المقام الأول بروتوكول تنقية لتحديد ل CMs، والثقافة المشتركة للخلايا مع نسبة محددة عن طريق خلط CMs مع CFs الإنسان (hCFs)، وتعليق هذه الثقافة المشتركة داخل الهيدروجيل القائم على الكولاجين. كما أننا نثبت حقن الهيدروجيل المحمل بالخلايا داخل جهازنا الدقيق الدقيق المحدد جيدا ، المضمن مع الأعمدة البيضاوية المتداخلة التي تعمل كتدبير سطحي للحث على درجة عالية من محاذاة الخلايا المحيطة ومصفوفة الهيدروجيل ، تحاكي بنية عضلة القلب الأصلية. ونحن نتصور أن النموذج المقترح 3D الأنسجة القلبية غير المثيلة على رقاقة مناسبة لدراسات البيولوجيا الأساسية, نمذجة الأمراض, ومن خلال استخدامه كأداة فحص, اختبار الأدوية.

Introduction

وقد تم استكشاف نهج هندسة الأنسجة على نطاق واسع، في السنوات الأخيرة، لمرافقة في النتائج السريرية في الجسم الحي في الطب التجديدي والنمذجة المرض1،2. وقد تم التركيز بشكل خاص على نمذجة الأنسجة القلبية في المختبر بسبب الصعوبات الكامنة في مصادر الأنسجة القلبية الأولية البشرية وإنتاج بدائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، مما يحد من الفهم الأساسي للآليات المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)1،3. وقد شملت النماذج التقليدية في كثير من الأحيان 2D مقايسات ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن أهمية زراعة خلايا القلب داخل بيئة ثلاثية الأبعاد لمحاكاة كل من المناظر الطبيعية الأصلية للقلب والتفاعلات الخلوية المعقدة قد تميزت على نطاق واسع4،5. بالإضافة إلى ذلك، شملت معظم النماذج المنتجة حتى الآن ثقافة أحادية من CMs تختلف عن الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يتكون القلب من أنواع خلايا متعددة6 داخل بنية ثلاثية الأبعاد معقدة7، مما يبرر الحاجة الماسة لتحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل نماذج المختبر ثلاثية الأبعاد لمحاكاة المكونات الخلوية للقلب العضلي الأصلي بشكل أفضل.

حتى الآن، تم استكشاف العديد من النهج المختلفة لإنتاج نماذج 3D المحاكاة الحيوية من عضلة القلب8. وتتراوح هذه النهج من الاجهزة التجريبية التي تسمح لحساب في الوقت الحقيقي من القوة المتولدة، من CMs أحادية الثقافة المصنفة على أفلام رقيقة (تعتبر الأفلام رقيقة العضلات (MTFs))9،إلى الخلايا القلبية المشاركة في الثقافة 3D المصفوفات هيدروجيل علقت بين cantilevers قائمة بذاتها (تعتبر أنسجة القلب المهندسة (EHTs))10. وقد ركزت نهج أخرى على تنفيذ تقنيات micromolding لتقليد أنيسوتروبي عضلة القلب, من CMs أحادية الثقافة في هيدروجيل 3D علقت بين microposts جاحظ في التصحيح الأنسجة11, إلى CMs أحادية الثقافة المصنفة بين microgrooves البادئة12,13. ولذلك، فإن من المناسب استخدام هذه التقنية التي تتماشى مع التطبيق المقصود والمسألة البيولوجية المقابلة له، هناك مزايا وعيوب متأصلة لكل من هذه الأساليب.

القدرة على تعزيز نضوج CMs المستمدة من الخلايا الجذعية أمر ضروري للهندسة المختبرية الناجحة للأنسجة عضلة القلب الشبيهة بالبالغين وترجمة النتائج اللاحقة إلى التفسيرات السريرية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم استكشاف أساليب لنضوج CMs على نطاق واسع، سواء في 2D و3D 14،15،16. على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي المدمج في EHTs، المحاذاة القسرية لل CMs مع تضاريس السطح، إشارات الإشارات، عوامل النمو من الثقافة المشتركة، و / أو ظروف الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد، وما إلى ذلك، كلها تؤدي إلى تغيير لصالح نضوج CM في واحد على الأقل من ما يلي: مورفولوجيا الخلايا، مناولة الكالسيوم، بنية الساركوميري، التعبير الجيني، أو القوة الانقباشية.

ومن بين هذه النماذج، تحتفظ النهج التي تستخدم منصات microfluidic بمزايا معينة في الطبيعة، مثل التحكم في التدرجات، ومحدودية إدخال الخلايا، والحد الأدنى من الكواشف اللازمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد العديد من التكرارات البيولوجية في وقت واحد باستخدام منصات microfluidic، مما يخدم لتشريح أفضل الآلية البيولوجية من الفائدة وزيادة حجم العينة التجريبية لصالح السلطة الإحصائية17،18،19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التصوير الضوئي في عملية تصنيع الجهاز microfluidic يمكن من إنشاء ميزات دقيقة (مثل الطبوغرافيات) على مستوى الدقيقة والنانو ، والتي تعمل كعظة تلسكوبية لتعزيز البنية الخلوية المحيطة وهندسة الأنسجة على المستوىالكلي18و20و21و22 للتطبيقات المختلفة في تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.

أظهرنا سابقا تطوير نموذج جديد للأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد على الشريحة يتضمن تضاريس سطحية ، في شكل أعمدة بيضاوية فطرية ، لمحاذاة خلايا القلب المشاركة في زراعة الهيدروجيل في نسيج متداخل وغير متماثل20. بعد 14 يوما من الثقافة ، تكون الأنسجة التي تشكلت داخل الجهاز microfluidic أكثر نضجا في النمط الظاهري ، وملف التعبير الجيني ، وخصائص التعامل مع الكالسيوم ، والاستجابة الصيدلانية بالمقارنة مع الضوابط أحادية الطبقة و3D isotropic23. يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقة إنشاء هذا النسق ثلاثي الأبعاد المشترك، والمنسق (أي anisotropic) أنسجة القلب البشرية داخل الجهاز microfluidic باستخدام CMs المشتقة من hiPSC. على وجه التحديد، ونحن نشرح أساليب لتمييز وتنقية hiPSCs نحو CMs، ومكملات hCFs مع CMs لإنتاج السكان الثقافة المشتركة المنشأة، وإدراج السكان الخلية مغلفة داخل هيدروجيل الكولاجين في الأجهزة microfluidic، والتحليل اللاحق للأنسجة 3D شيدت من خلال المقايسات الإنقباعي والمناعة. الأنسجة الدقيقة المهندسة ثلاثية الأبعاد الناتجة مناسبة لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسات البيولوجيا الأساسية ، والنمذجة القلبية الوعائية ، والاختبارات الصيدلانية.

Protocol

تنفيذ جميع معالجة الخلية وإعداد الكاشف داخل خزانة السلامة البيولوجية. تأكد من أن جميع الأسطح والمواد والمعدات التي تتلامس مع الخلايا معقمة (أي الرش بالإيثانول بنسبة 70٪). يجب استزراع الخلايا فيحاضنة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. يتم تنفيذ جميع ثقافة hiPSC والتمايز في لوحات 6-well.

1. إنشاء جهاز Microfluidic (المدة التقريبية: 1 أسبوع)

  1. التصوير الضوئي
    ملاحظة: القناع، المصمم باستخدام ملف CAD (المتوفر كملف تكميلي 1)،يحتوي على تصميم القناة microfluidic. طباعة التصميم على قناع شفاف. ثم، قم بإجراء التصوير الضوئي القياسي باستخدام جهاز التصوير الضوئي السلبي SU8 2075 على رقاقة سيليكون مقاس 4 بوصات داخل غرفة نظيفة.
    1. تنظيف رقاقة السيليكون مع الكحول isopropyl (IPA) وجافة مع النيتروجين. خبز في 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للجفاف.
      ملاحظة: التعامل مع رقاقة مع ملاقط رقاقة.
    2. ضع الرقاقة في المعطف الدوار. إيداع 3-4 مل من SU8 في وسط رقاقة، ثم تدور لتشكيل طبقة من 200 ميكرومتر (أي، تكثف 15 ثانية إلى 500 دورة في الدقيقة، تدور لمدة 10 ثانية، تكثف 5 ق إلى 1200 دورة في الدقيقة، وتدور لمدة 30 ثانية، ثم downspin لمدة 15 ثانية حتى توقف).
    3. إزالة رقاقة وخبز لينة لمدة 7 دقائق في 65 درجة مئوية، ثم 45 دقيقة في 95 درجة مئوية.
    4. حرك الرقاقة إلى محاذاة قناع وضع القناع الشفاف في حامل القناع مع فلتر الأشعة فوق البنفسجية. يعرض الرقاقة لدورتين من 230 مج/سم2،مع تأخير 30 ثانية، لتعرض إجمالي قدره 460 م ج/سم2.
    5. قم بعمل خبز بعد التعرض على الرقاقة المكشوفة في فرن 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. إيقاف الفرن في صباح اليوم التالي، وبعد رقاقة قد بردت إلى درجة حرارة الغرفة، وغمرها في SU8 المطور. إزالة رقاقة من المطور كل 5 دقائق ويغسل مع وكالة الألعاب الشعبية، ثم وضعه مرة أخرى في المطور.
    7. بعد حوالي 20 دقيقة، أو عندما يعمل IPA واضحة، وتجفيف رقاقة مع النيتروجين الهواء والخبز الثابت في فرن تعيين إلى 150 درجة مئوية. بمجرد أن يصل الفرن إلى 150 درجة مئوية، قم بإيقاف تشغيله ولكن لا تفتح. اترك الرقاقة في الفرن حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم أزيلي الرقائق.
    8. تأكد من ارتفاع SU8 مع مقياس التنميط والميزات البصرية مع المجهر الخفيف. بمجرد التأكد، الشريط رقاقة داخل طبق بيتري البلاستيك 150 ملم.
  2. الطباعة الحجرية الناعمة
    ملاحظة: الرقاقة، المسجلة على طبق بيتري، تحتاج إلى أن تكون silanized لمنع الالتزام PDMS إلى ميزات SU8.
    1. عكس رقاقة (استغلالها إلى طبق بيتري البلاستيك) على طبق بيتري الزجاج من نفس الحجم التي تحتوي على 0.4 مل من ميثيلتريكلوروسيلين (MTCS) وتعريض رقاقة للأبخرة لمدة 4 دقائق. بدوره رقاقة تستقيم ووضع الغطاء على طبق بيتري.
    2. مزيج 30 غرام من قاعدة الاستومر السيليكون إلى عامل المعالجة بنسبة 10:1. رفع الغطاء عن طبق بيتري وصب polydimethylsiloxane (PDMS) على رقاقة، ثم ديغا داخل مجفف.
    3. مرة واحدة كل فقاعات ذهب، ضع رقاقة في 80 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة لعلاج PDMS.
    4. قم بتقشير PDMS بعناية، ولكم المداخل ومنافذ منافذ الأنسجة والقنوات الإعلامية مع لكمة خزعة 1 مم و 1.5 ملم، على التوالي.
    5. تنظيف قنوات PDMS مع الشريط لإزالة الغبار. بعد ذلك، نقع الأغطية (18 × 18 ملم، No.1) في الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل. ثم، وتجفيف هذه قبالة مع مناديل الأنسجة.
    6. موضوع كل من coverlips وقنوات PDMS (الجانب ميزة يتعرض) إلى البلازما (الإعداد على ارتفاع) لمدة 1 دقيقة، ثم السندات بسرعة معا ووضعها في فرن 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتأمين السندات.
      ملاحظة: أثناء الترابط، من الضروري ممارسة ضغط خفيف على حواف قنوات PDMS لضمان وجود ختم جيد بين PDMS والزجاج مع تجنب القناة نفسها لمنع انهيار القناة.
  3. إعداد الجهاز
    1. غمر أجهزة PDMS المستعبدين في الماء deionized (DI H2O) وautoclave مع دورة السائل. بعد ذلك، يستنشق السائل من الأجهزة وautclave مرة أخرى مع دورة الجاذبية. ثم، يجفف الأجهزة المعقمة بين عشية وضحاها في 80 درجة مئوية.

2. زراعة الخلايا الجذعية (المدة التقريبية: 1-2 أشهر)

  1. hiPSC الثقافة والصيانة
    ملاحظة: يجب أن تكون hiPSCs مثقفة لثلاثة مقاطع متتالية بعد ذوبان الجليد في المختبر قبل حفظ التبريد أو التمايز. هي مثقف hiPSCs في المتوسط إما E8 أو mTeSR1، اعتمادا على خط الخلية، على الغشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة لوحات24.
    1. لمعطف لوحات مع hESC الجودة مصفوفة غشاء الطابق السفلي، إذابة واحد aliquot من المتوسط مصفوفة (حجم تعتمد على الكثير، عموما 200-300 ميكرولتر؛ المخزنة في -80 درجة مئوية) عن طريق إضافته إلى 25 مل من DMEM/F-12K على الجليد. الاستغناء عن 1 مل من هذا التعليق في كل بئر من لوحة 6-جيدا. اترك الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
    2. عند ذوبان الجليد، قم بتعديل وسائط E8 لثقافة hiPSC بإضافة 5 ميكرومتر من Y-2763225 (E8+RI). استخدام هذه الوسائط لمدة 24 ساعة بعد ذلك، ثم تغيير وسائل الإعلام إلى E8 الطازجة.
      ملاحظة: بالنسبة للتغييرات الروتينية في الوسائط، يتم استخدام وسائط E8 غير المعدلة لثقافة hiPSC. للصيانة المنتظمة، يجب تغيير وسائط E8 كل يوم، أي بعد 24 ساعة تقريبا من تغيير الوسائط السابقة.
    3. خلايا المرور في اليوم 3 أو اليوم 4، وسائط يستنشق، ثم يغسل كل بئر مع 1 مل من محلول الفوسفات المخزنة بالفوسفات 1x Dulbecco (DPBS).
      ملاحظة: تأكد من أن الخلايا حول التقاء 70٪. لا تدع لهم تنمو أكثر من 70٪ التقاء.
    4. يستنشق DPBS، ثم إضافة 1 مل من 0.5 mM EDTA إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 6-7 دقائق.
    5. يستنشق بعناية EDTA، إضافة 1 مل من E8 + RI في كل بئر والانفجار ضد السطح مع ماصة 1 مل (~ 5-10 مرات لجمع كل من الخلايا). جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
    6. عد تعليق الخلية والمرور في كثافة الخلية المطلوبة (أي ~ 200 K لكل بئر) في E8 + RI.
    7. تغيير الوسائط إلى E8 (بدون RI) 24 ساعة بعد. لا تترك الخلايا مع RI لأكثر من 24 ساعة.
      ملاحظة: لا ينبغي تسخين E8 إلى 37 درجة مئوية. اتركه دائما في درجة حرارة الغرفة للاحترار قبل ثقافة الخلية.
  2. خلية القلب (CM) موجهة التمايز
    ملاحظة: من المهم ملاحظة وجود التغايرية بين أسطر مختلفة من hiPSCs26,27, لذلك قد تحتاج إلى تحسين الخطوات التالية لكل خط الخلية. اتبع الخطوات التالية لتمايز CM.
    1. إعداد RPMI + B27 - الأنسولين بإضافة 10 مل من B27 ناقص الأنسولين و 5 مل من البنسلين / العقدية (القلم / العقدية) إلى 500 مل من RPMI 1640.
    2. إعداد RPMI + B27 + الأنسولين بإضافة 10 مل من B27 و 5 مل من القلم / العقدية إلى 500 مل من RPMI 1640.
    3. إعداد RPMI ناقص الجلوكوز + B27 + الأنسولين بإضافة 10 مل من B27، 5 مل من القلم / العقدية، و 4 مل من لاكتات الصوديوم إلى 500 مل من RPMI 1640 بدون جلوكوز.
    4. بمجرد أن تصل المركبات المتجانسة إلى 85٪ التقاء، بدء التفريق (اليوم 0) عن طريق استبدال الوسط القديم مع 4 مل من RPMI + B27 - وسيط الأنسولين الذي يحتوي على 10 ميكرومتر CHIR99021 إلى كل بئر من لوحة 6 آبار (أي إضافة 25 ميكرولتر من 10 MM CHIR99021 إلى 25 مل من RPMI + B27 - الأنسولين ثم إضافة 4 مل لكل بئر على الفور).
      ملاحظة: CHIR99021 هو مثبط GSK ويؤدي إلى تنشيط WNT. تركيز الأمثل CHIR99021 والتقاء الأولي يختلف لكل خط الخلية28. تحقق دائما من تدرج تركيز 6-12 ميكرومتر CHIR99021 وسلسلة من كثافات البذر قبل التجربة الفعلية لتحديد الظروف المثلى لبدء التمايز.
    5. بالضبط 24 ساعة في وقت لاحق (اليوم 1)، يستنشق المتوسط واستبدالها مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 - الأنسولين إلى كل بئر.
    6. بالضبط 72 ساعة بعد إضافة CHIR99021 (اليوم 3)، وجمع 2.5 مل من المتوسطة المستهلكة من كل بئر من لوحة 6-جيدا، ويبلغ مجموعها 15 مل من المتوسطة المستهلكة في أنبوب.
    7. لهذا، إضافة 15 مل من RPMI الطازجة + B27 - الأنسولين المتوسطة. أضف IWP2 إلى تركيز 5 ميكرومتر إلى الأنبوب المتوسط المدمج (أي 1 ميكرولتر من IWP2 بمعدل 5 م م لكل 1 مل من المتوسط المجمع أو 30 ميكرولتر من IWP2 إلى 30 وسيطا إجماليا مل).
    8. إزالة ~ 1.5 مل من المتوسط المتبقي لكل بئر من لوحة بحيث يبقى 1 مل من المتوسط. قم بتدافي اللوحة بقوة لضمان إزالة كافية لحطام الخلية. ثم يستنشق بقية الوسط القديم وإضافة 5 مل من المتوسطة المدمجة التي تحتوي على IWP2 لكل بئر من اللوحة.
      ملاحظة: إضافة IWP2 إلى الخلايا يؤدي إلى تثبيط Wnt.
    9. في اليوم 5، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 - الأنسولين.
    10. CM النضج: في اليوم 7، اليوم 9، واليوم 11، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 + الأنسولين. وينبغي ملاحظة الضرب التلقائي في هذه الأيام.
    11. CM تنقية: في اليوم 13 واليوم 16، بدء المجاعة الجلوكوز عن طريق استنشق المتوسطة من كل بئر، وغسل كل بئر مع 1 مل من 1x DPBS، ومن ثم إضافة 5 مل من RPMI prewarmed ناقص الجلوكوز + B27 + الأنسولين، تكملها مع 4 مل من لاكتات الصوديوم.
    12. في اليوم 19، يستنشق المتوسطة المستهلكة واستبدالها مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 + الأنسولين إلى كل بئر للسماح لاستعادة الخلية بعد تنقية.
    13. في اليوم 21، إعادة طلاء الخلايا، بعد ما يلي وصف بروتوكول فصافر CM (الخطوة 3.3). تهدف إلى لوحة 1.5-2 × 106 خلايا لكل بئر في لوحة 6-جيدا. على سبيل المثال، إذا كان التمايز عالي الكفاءة، فإن توسيع الآبار ال 6 بشكل عام إلى 9 آبار أمر جيد.
    14. من يوم 21 فصاعدا، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 4 مل من RPMI + B27 + الأنسولين كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: HIPSC-CMs جاهزة للاستخدام التجريبي بعد اليوم 23.

3. إنشاء أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد داخل الجهاز microfluidic: (المدة التقريبية: 2-3 ساعة)

  1. ثقافة hCF
    1. ثقافة الخلايا الليفية القلبية البطينية البشرية (hCFs؛ التي تم الحصول عليها تجاريا من لونزوا) في قوارير T75 (بمعدل 250 ألف خلية لكل قارورة) في الخلايا الليفية نمو الوسائط-3 (ختان الإناث3). تغيير وسائل الإعلام كل يومين، والمرور عندما في التقاء 70٪. استخدام hCFs قبل مرور 10، لأنها قد تبدأ في التفريق إلى الخلايا العضلية في الممرات العالية29.
  2. hCF التفكك
    1. وننأى بحمى الهيدروكلوريك، أخرج القارورة أولا من الحاضنة. ضع القارورة داخل خزانة السلامة الحيوية وابدأ في قرصنة الوسائط المستهلكة من القارورة. ثم اغسل قارورة T75 ب 3 مل من 1x DPBS. أغلق الغطاء ودوامة القارورة.
    2. يستنشق DPBS. خذ 3 مل من 1x تريبسين-EDTA (0.05٪) وإضافته إلى القارورة. إمالة القارورة ودوامة لمعطف القاع. اتركه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4-6 دقائق ، والتحقق من القارورة تحت المجهر لضمان انفصال الخلايا ، كما يتضح من خلال شكل الخلية المستديرة والخلايا العائمة. إذا لم يكن كذلك، ثم وضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة دقيقة أخرى.
    3. تحييد عمل التريبسين بإضافة 3 مل من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية قبل الحرب3 إلى القارورة. ثم، ماصة الحل صعودا وهبوطا ضد الجزء السفلي من القارورة لطرد CFs.
    4. جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لحساب الخلايا بالمجهر.
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 × ز لمدة 4 دقائق. يستنشق supernatant الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
    6. Resuspend بيليه في تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الطازجة3، لجعل المطلوب 75 × 106 خلايا / مل. إما مرور جزء (250K الخلايا لكل قارورة T75) أو اتبع البروتوكول أدناه لتوليد أنسجة القلب 3D.
  3. فصافر CM
    ملاحظة: بعد التمايز والتنقية، قم بإعداد CMs للاستخدام في الحقن في أجهزة microfluidic.
    1. أخرج لوحة CMs من الحاضنة وخص وسائل الإعلام. ثم غسل الآبار مع 1 مل من 1x DPBS لكل بئر من لوحة 6-جيدا. خذ 6 مل من DPBS وماصة 1 مل لكل بئر.
    2. يستنشق DPBS الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا المرفقة لوحة. ماصة 6 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة (على سبيل المثال، TrypLE Express) وإضافة 1 مل لكل بئر. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. تحييد الانزيم مع حجم متساو من RPMI + B27 + الأنسولين (أي 1 مل لكل بئر) وتفكيك الخلايا ميكانيكيا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ضد وعاء الثقافة مع ماصة 1 مل.
    4. جمع CMs في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 3 دقائق.
    5. يستنشق العملاق. إعادة إنفاق بيليه الخلية في 5 مل من RPMI + B27 + الأنسولين. Pipette الحل صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل لضمان خلط السليم. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لتحديد العدد الإجمالي للخلية.
    6. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 300 × ز لمدة 3 دقائق (لضمان إزالة كاملة من TrypLE)، وتنشق supernatant. ثم، إضافة حجم مناسب من RPMI + B27 + الأنسولين لتحقيق 75 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: إذا لم ينتج عن التمايز/الاختيار القلبي ارتفاع CM٪ (أي >80٪)، كما يتضح من خلال التخزين المناعي أو قياس التدفق الخلوي للبروتينات الخاصة ب CM مثل cTnT، فلا تعتبر الخلايا مناسبة لتكوين الأنسجة. وينبغي تحسين عملية التمايز عندما يحدث ذلك عن طريق تعديل تركيزات CHIR99021 وكثافة البدء الأولية. إذا كان تنقية CM يحتاج إلى تحسين ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل فرز CMs إما مع فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) أو فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS)30و31و32.
  4. إعداد الكولاجين
    ملاحظة: إعداد الكولاجين من تركيز عال من مخزون الكولاجين (تتراوح بين 8-11 ملغ / مل). الكولاجين المستخدمة لإنشاء الخلية: خليط هيدروجيل هو في 6 ملغ / مل، والتركيز النهائي هو 2 ملغم / مل. اعتمادا على عدد الأجهزة التي يجب حقنها ، يجب حساب حجم محلول الكولاجين الذي يجب إجراؤه مرة أخرى.
    1. احتفظ بجميع الكواشف المطلوبة على الجليد داخل غطاء السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: الكولاجين هو هيدروجيل للحرارة. لذلك ، يجب أن تظل درجة الحرارة منخفضة لمنع البلمرة المبكرة.
    2. تناول 75 ميكرولتر من الكولاجين (8 ملغم/مل) ووزعه في أنبوب طرد دقيق على الجليد. محلول الكولاجين لزج للغاية ، لذا يستنشقه ببطء مع ماصة.
    3. خذ 13.85 ميكرولتر من الوسائط (أي RPMI + B27 + الأنسولين) والاستغناء عنها في نفس الأنبوب.
    4. ثم تأخذ 10 ميكرولتر من الفينول الأحمر وإضافة إلى الخليط وإعادة الإنفاق.
    5. وأخيرا، تأخذ 1.15 ميكرولتر من 1N NaOH وإضافة إلى تعليق.
    6. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر، إعادة تعليق التعليق.
      ملاحظة: الكولاجين الأسهم لديه حموضة حمضية، مما يستلزم إضافة NaOH لتحييد قبل استخدامه لتغليف خلايا القلب. فينول الأحمر بمثابة مؤشر درجة الحموضة; لذلك، أضف هذا قبل إضافة NaOH. عند هذه النقطة، فإن محلول الكولاجين يكون أصفر، مما يدل على حموضة له. بعد إضافة NaOH ، يجب أن يتحول الحل البرتقالي إلى اللون الوردي الفاتح ، مما يشير إلى تحييده.
  5. خليط هيدروجيل وإعداد الخلية
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم تغليف الخلايا داخل هيدروجيل الكولاجين القائم. وينبغي وضع الخلايا، وكذلك جميع السلائف الهيدروجيل، على الجليد خلال الخطوات التالية.
    1. عند هذه النقطة، إذا لم يتم بعد محاولة CFs، تخزين تعليق CM في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، مع غطاء فك للسماح بتدفق الغاز، داخل حاضنة 37 درجة مئوية. بالتوازي، فصل CFs وجمع في كثافة 75 × 106 خلايا / مل لتحميل الجهاز.
    2. امزج CMs المعلقة مع CFs بنسبة 4:1. خذ a aliquot من 8 ميكرولتر من CMs وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي الطازجة على الجليد. ثم تأخذ 2 ميكرولتر من CFs وإضافة إلى تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي.
    3. إعادة تعليق الخلية، والاستيلاء على 5.6 ميكرولتر من تعليق الخلية، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الطازجة.
    4. خذ 4 ميكرولتر من الكولاجين المعد للتو في الخطوات المذكورة أعلاه وأضف إلى خليط 4:1 CM:CF. إضافة 2.4 ميكرولتر من عامل النمو انخفاض (GFR) مصفوفة غشاء الطابق السفلي، مما يجعل كثافة الخلية النهائية كما 35 × 106 خلايا / مل لحقن الجهاز. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لضمان أن تعليق الخلية متجانسة.
  6. إدراج الجهاز
    ملاحظة: بمجرد إعداد خليط الخلية:هيدروجيل، فإنه يحتاج إلى إدراجها في الأجهزة.
    1. أخرج أجهزة microfluidic المعقمة تلقائيا من الفرن الذي 80 درجة مئوية وقم بتعيينها في خزانة السلامة الحيوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إدخال تعليق الخلية للسماح للأجهزة بالتبريد لدرجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على العقم.
    2. ضع الأجهزة في أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مم ، بمعدل 3-4 أجهزة لكل طبق. املأ طبق بيتري مقاس 150 × 15 مم بطبقة رقيقة من طبق DI H2O ليحمل 3 من أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مم. هذه الخطوة يخلق بيئة رطبة المحيطة الأجهزة microfluidic.
    3. استخدام طرف جديد وإعادة إنفاق الخلية: خليط هيدروجيل جيدا عن طريق pipetting تعليق في حين أن الأنبوب لا يزال على الجليد.
    4. أدخل الطرف في منفذ الحقن للجهاز وحقن ببطء وثبات 3 ميكرولتر من تعليق الخلية: هيدروجيل في مدخل منطقة الأنسجة لجهاز ميكروفلويديك باستخدام طرف ماصة 20 ميكرولتر. بمجرد ملء المنفذ، أوقف الحقن وأزل الطرف. كرر لجميع الأجهزة، أو كامل تعليق هيدروجيل المعدة.
      ملاحظة: حجم صغير من الخلية: تعليق هيدروجيل يسخن / يبرد بسرعة كبيرة، لذلك فمن المناسب للحفاظ على تعليق على الجليد لأطول فترة ممكنة. عند إدراج، ماصة الحل قبالة الجليد وإدراجها في الأجهزة في أسرع وقت ممكن، كما هيدروجيل قد تبدأ في البلمرة في طرف ماصة. من المهم إنشاء كميات صغيرة من تعليق الخلية: هيدروجيل في وقت واحد، لذلك إذا كان العديد من الأجهزة التي سيتم حقنها، فإن تعليق الخلية:هيدروجيل يجب أن تكون طازجة لكل مجموعة من 4 أجهزة.
    5. الوجه الأجهزة داخل أطباق بيتري مع ملاقط ووضعها داخل طبق بيتري كبيرة مع الماء. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 9 دقائق ل البلمرة الهيدروجيل.
    6. أخرج الأجهزة من الحاضنة، وقلب الأجهزة بشكل مستقيم، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 9 دقائق لإكمال بلمرة الهيدروجيل.
    7. حقن RPMI + B27 + الأنسولين في قنوات الوسائط المحيطة (~ 20 ميكرولتر لكل جهاز). ضع الأجهزة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. تغيير وسائل الإعلام داخل القنوات الإعلامية مع RPMI الطازجة + B27 + الأنسولين كل يوم. وقد ثبت أن الأجهزة التي يتم استزراعها من 14-21 يوما20.
      ملاحظة: نظرا لصغر حجم الوسائط لكل رقاقة، لمنع تبخر الوسائط، من المهم الحفاظ على الأجهزة داخل طبق بيتري كبير مليء ب DI H2O، والذي يعمل كغرفة مرطبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم إخراج قطرات صغيرة من RPMI + B27 + الأنسولين الزائد على الجزء العلوي من مداخل القناة / منافذها أثناء التغييرات الروتينية في الوسائط.

4. تحليل الأنسجة

  1. تصوير مباشر
    ملاحظة: يجب إجراء جميع التصوير الحي مع حاضنة مرحلة للحفاظ على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    1. ضع الأجهزة في حاضنة مرحلة يتم التحكم فيها بيئيا. سجل مقاطع فيديو 30 s من بقع متعددة داخل كل جهاز بمعدل الإطار الأقصى.
    2. لتقييم انقباض الأنسجة بعد استخراج إشارات الضرب، استخدم رمز MATLAB التكميلي المكتوب خصيصا لاستخراج القمم(الملف التكميلي 2)لحساب التباين الفاصل بين الضربات.
    3. تغيير الوسائط في الأجهزة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، ثم وضع مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية.
  2. تلطيخ مناعة
    1. إعداد برنامج تلفزيوني-الجليسين: حل 100 mM الجليسين في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.02٪ NaN3 للتخزين على المدى الطويل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    2. إعداد برنامج تلفزيوني توين -20: إضافة 0.05٪ توين-20 لبرنامج تلفزيوني وإضافة 0.02٪ NaN3 للتخزين على المدى الطويل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    3. إعداد IF المخزن المؤقت: إضافة 0.2٪ تريتون X-100, 0.1٪ BSA, و 0.05٪ توين-20 إلى PBS, وإضافة 0.02٪ NaN3 للتخزين طويل الأجل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    4. إعداد مصل الماعز 10٪: Resuspend مصل الماعز الليوفيلي في 2 مل من برنامج تلفزيوني لجعل مصل الماعز 100٪. ثم، تمييع 2 مل مع 18 مل من برنامج تلفزيوني لجعل مصل الماعز 10٪.
    5. إصلاح العينات بإضافة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى قنوات الأنسجة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. غسل الخلايا عن طريق إضافة PBS-Glycine إلى قنوات الأنسجة 2x لمدة 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة.
    7. غسل الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني -Tween-20 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة IF العازلة إلى قنوات الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    9. منع الخلايا عن طريق إضافة 10٪ حل مصل الماعز إلى قنوات الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    10. تمييع الأجسام المضادة الأولية غير المترافقة في مصل الماعز بنسبة 10٪ بتركيزات مرغوبة (راجع الملف التكميلي 3)،إضافة إلى قنوات الأنسجة، واحتضان العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    11. في اليوم التالي، غسل العينات عن طريق إضافة PBS-Tween-20 إلى قنوات الأنسجة 3x لمدة 20 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: من الخطوة 4.2.12 على تنفيذ كافة المهام في الظلام، بحيث يتم حماية العينات من الضوء.
    12. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في PBS-Tween-20 بتركيزات مرغوبة، والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة لجمع أي رواسب، ثم إضافة إلى قنوات الأنسجة.
    13. بعد 30 دقيقة-1 ساعة، وغسل العينات مع برنامج تلفزيوني توين-20 3x لمدة 10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
    14. إضافة المضادة للتلاشي أو المتوسطة المتصاعدة المطلوبة إلى قنوات الأنسجة. ثم، يمكن تصوير العينات باستخدام المجهر الفلوري أو مع المجهر confocal، إذا كان التكبير أعلى هو المطلوب. لتصور كامل الأنسجة 3D، يمكن أن تكون مكدسة الصور في مختلف الطائرات ض وإعادة بنائها لتشكيل صور 3D تمثيلية.

النتائج

للحصول على مجموعة عالية من أجهزة CMs من hiPSCs ، يتم استخدام نسخة معدلة تتضمن مزيجا من بروتوكول تمايز ليان33 وخطوات تنقية Tohyama34 (راجع الشكل 1A للجدول الزمني التجريبي). وhiPSCs تحتاج إلى أن تكون مستعمرة مثل، ~ 85٪ التقاء، وانتشرت بالتساوي في جميع أنحاء الثقافة...

Discussion

تشكيل نموذج الأنسجة القلبية البشرية في المختبر مع تعزيز التفاعلات الخلية الخلية وهيكل 3D المحاكاة الحيوية أمر حتمي للبحوث الأساسية القلب والأوعية الدموية والتطبيقات السريريةالمقابلة 1. يشرح هذا البروتوكول الموجز تطوير أنسجة القلب غير المثيلية البشرية ثلاثية الأبعاد د?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نود أن نشكر جائزة NSF CAREER #1653193، وجائزة المحقق الجديد للجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية (ABRC) (ADHS18-198872)، وجائزة مؤسسة فلين لتوفير مصادر التمويل لهذا المشروع. تم الحصول على خط hiPSC ، SCVI20 ، من جوزيف سي وو ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه في معهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية بتمويل من NIH R24 HL117756. تم الحصول على خط hiPSC ، IMR90-4 ، من معهد WiCell للأبحاث55،56.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001can also be made in house
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

References

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. . Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved