Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Zusammenfassung

Die weltweit häufigste Todesursache bleibt herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Modellierung der physiologischen und biologischen Komplexität des Herzmuskels, des Myokards, ist jedoch notorisch schwierig in vitro zu erreichen. Hindernisse liegen hauptsächlich in der Notwendigkeit menschlicher Kardiomyozyten (CMs), die entweder erwachsen sind oder erwachsene Phänotypen aufweisen und die zelluläre Komplexität und komplizierte 3D-Architektur des Myokards erfolgreich replizieren können. Leider war aufgrund ethischer Bedenken und des Mangels an primärem, vom Patienten abgeleitetem menschlichem Herzgewebe in Kombination mit der minimalen Proliferation von CMs die Beschaffung lebensfähiger menschlicher CMs ein limitierender Schritt für das Herzgewebe-Engineering. Zu diesem Zweck hat sich die meiste Forschung in Richtung kardialer Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) als primäre Quelle menschlicher CMs entwickelt, was zu einer breiten Einbeziehung von hiPSC-CMs in In-vitro-Assays für die Kardiengewebemodellierung führte.

Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll zur Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem mikrofluidischen Gerät. Wir erklären und demonstrieren insbesondere die Herstellung eines 3D-in-vitro-anisotropen Herzgewebe-on-a-Chip-Modells aus hiPSC-abgeleiteten CMs. Wir beschreiben in erster Linie ein Reinigungsprotokoll zur Auswahl für CMs, die Co-Kultur von Zellen mit einem definierten Verhältnis durch Mischen von CMs mit menschlichen CFs (hCFs) und die Suspension dieser Co-Kultur innerhalb des kollagenbasierten Hydrogels. Wir demonstrieren außerdem die Injektion des zellbeladenen Hydrogels in unser gut definiertes mikrofluidisches Gerät, eingebettet in versetzte elliptische Mikropfosten, die als Oberflächentopographie dienen, um ein hohes Maß an Ausrichtung der umgebenden Zellen und der Hydrogelmatrix zu induzieren und die Architektur des nativen Myokards nachzuahmen. Wir stellen uns vor, dass das vorgeschlagene anisotrope 3D-Kardiengewebe-on-Chip-Modell für grundlegende biologische Studien, Krankheitsmodellierung und durch seine Verwendung als Screening-Tool für pharmazeutische Tests geeignet ist.

Einleitung

Tissue Engineering-Ansätze wurden in den letzten Jahren umfassend erforscht, um klinische In-vivo-Befunde in der regenerativen Medizin und Krankheitsmodellierung zu begleiten^1,2. Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten bei der Beschaffung von humanem primärem Herzgewebe und der Herstellung physiologisch relevanter In-vitro-Surrogate wurde insbesondere der In-vitro-Kardgewebemodellierung besondere Bedeutung beigemischt, was das grundlegende Verständnis der komplexen Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) einschränkt^1,3. Traditionelle Modelle haben oft 2D-Monolayer-Kultur-Assays beinhaltet. Die Bedeutung der Kultivierung von Herzzellen in einer 3D-Umgebung, um sowohl die native Landschaft des Myokards als auch komplexe zelluläre Interaktionen nachzuahmen, wurde jedoch ausführlich charakterisiert^4,5. Darüber hinaus enthielten die meisten bisher hergestellten Modelle eine Monokultur von CMs, die von Stammzellen differenziert wurden. Das Herz besteht jedoch aus mehreren Zelltypen⁶ innerhalb einer komplexen 3D-Architektur^7,was die kritische Notwendigkeit rechtfertigt, die Komplexität der Gewebezusammensetzung in 3D-In-vitro-Modellen zu verbessern, um zelluläre Bestandteile des nativen Myokards besser nachzuahmen.

Bis heute wurden viele verschiedene Ansätze erforscht, um biomimetische 3D-Modelle des Myokards⁸zu erstellen. Diese Ansätze reichen von experimentellen Setups, die die Echtzeitberechnung der erzeugten Kraft ermöglichen, von Monokultur-CMs, die auf dünnen Filmen gesät sind (als muskulöse dünne Schichten (MTFs))^9,bis hin zu Co-Kultur-Herzzellen in 3D-Hydrogelmatrizen, die zwischen freistehenden Auslegern schweben (als künstliche Herzgewebe (EHTs))¹⁰. Andere Ansätze haben sich auf die Implementierung von Mikroformtechniken konzentriert, um die myokardiale Anisotropie nachzuahmen, von Monokultur-CMs in einem 3D-Hydrogel, das zwischen hervorstehenden Mikropfosten in einem Gewebepflaster¹¹suspendiert ist, bis hin zu Monokultur-CMs, die zwischen eingerückten Mikrorillen gesät sind^12,13. Es gibt inhärente Vor- und Nachteile für jede dieser Methoden, daher ist es wichtig, die Technik zu verwenden, die mit der beabsichtigten Anwendung und der entsprechenden biologischen Frage übereinstimmt.

Die Fähigkeit, die Reifung von aus Stammzellen gewonnenen CMs zu verbessern, ist für das erfolgreiche In-vitro-Engineering von adultem Myokardgewebe und die Translation der nachfolgenden Befunde in klinische Interpretationen unerlässlich. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Reifung von CMs umfassend erforscht, sowohl in 2D als auch in 3D^14,15,16. Zum Beispiel führen elektrische Stimulation, die in EHTs integriert ist, erzwungene Ausrichtung von CMs mit der Oberflächentopographie, Signalsignale, Wachstumsfaktoren aus Co-Kultur und / oder 3D-Hydrogelbedingungen usw. zu einer Veränderung zugunsten der CM-Reifung in mindestens einer der folgenden: Zellmorphologie, Kalziumhandhabung, Sarkomerikstruktur, Genexpression oder kontraktile Kraft.

Von diesen Modellen behalten die Ansätze, die mikrofluidische Plattformen verwenden, bestimmte Vorteile in der Natur, wie die Kontrolle von Gradienten, begrenzten Zelleintrag und minimal notwendige Reagenzien. Darüber hinaus können viele biologische Replikate auf einmal mit mikrofluidischen Plattformen erzeugt werden, die dazu dienen, den biologischen Mechanismus von Interesse besser zu sezieren und die experimentelle Stichprobengröße zugunsten der statistischen Leistung zu erhöhen^17,18,19. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung der Photolithographie im mikrofluidischen Geräteherstellungsprozess die Erstellung präziser Merkmale (z. B. Topographien) auf Mikro- und Nanoebene, die als mesoskopische Hinweise zur Verbesserung der umgebenden Zellstruktur und der Gewebearchitektur auf Makroebene dienen^18,20 ,^21,22 für verschiedene Anwendungen in der Geweberegeneration und Krankheitsmodellierung.

Wir haben bereits die Entwicklung eines neuartigen 3D-Herzgewebe-On-Chip-Modells demonstriert, das Oberflächentopographie in Form von angeborenen elliptischen Mikropfosten enthält, um hydrogelverkapselte co-kultivierte Herzzellen in ein miteinander verbundenes, anisotropes Gewebe auszurichten²⁰. Nach 14 Tagen Kultur sind die im mikrofluidischen Gerät gebildeten Gewebe im Vergleich zu Monoschicht- und 3D-isotropen Kontrollen reifer in ihrem Phänotyp, Genexpressionsprofil, Kalziumhandhabungseigenschaften und pharmazeutischen^{Reaktionen 23}. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Methode zur Herstellung dieses 3D-kokultivierten, ausgerichteten (d.h. anisotropen) menschlichen Herzgewebes innerhalb des mikrofluidischen Geräts unter Verwendung von hiPSC-abgeleiteten CMs. Insbesondere erläutern wir die Methoden zur Differenzierung und Reinigung von hiPSCs in Richtung CMs, die Supplementierung von hCFs mit CMs zur Erzeugung einer etablierten Co-Kulturpopulation, das Einfügen der im Kollagenhydrogel verkapselten Zellpopulation in die mikrofluidischen Geräte und die anschließende Analyse der 3D-konstruierten Gewebe durch kontraktile und immunfluoreszierende Assays. Die resultierenden 3D-Mikrogewebe eignen sich für verschiedene Anwendungen, einschließlich grundlegender biologischer Studien, CVD-Modellierung und pharmazeutischer Tests.

Protokoll

Führen Sie die gesamte Zellhandhabung und Reagenzienvorbereitung in einer Biosicherheitswerkbank durch. Stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen, Materialien und Geräte, die mit Zellen in Kontakt kommen, steril sind (d. h. mit 70% Ethanol besprühen). Die Zellen sollten in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO₂ Inkubator kultiviert werden. Die gesamte hiPSC-Kultur und -Differenzierung erfolgt in 6-Well-Platten.

1. Erstellung mikrofluidischer Geräte (ungefähre Dauer: 1 Woche)

1. fotolithografie
   HINWEIS: Die Maske, die mit der CAD-Datei (als Zusatzdatei 1bereitgestellt) entworfen wurde, enthält das Design des mikrofluidischen Kanals. Drucken Sie das Design auf eine transparente Maske. Führen Sie dann eine Standard-Fotolithographie mit dem Negativ-Fotolack SU8 2075 auf einem 4-Zoll-Siliziumwafer in einem Reinraum durch.
   1. Reinigen Sie einen Siliziumwafer mit Isopropylalkohol (IPA) und trocknen Sie ihn mit Stickstoff. Bei 200 °C 5 min zur Austrocknung backen.
      HINWEIS: Behandeln Sie den Wafer mit einer Waferpinzette.
   2. Legen Sie den Wafer in den Spincoater. Lagern Sie 3-4 ml SU8 in der Mitte des Wafers ab, drehen Sie sich dann, um eine Schicht von 200 μm zu bilden (dh 15 s auf 500 U / min hochfahren, 10 s drehen, 5 s auf 1.200 U / min hochfahren und für 30 s drehen, dann 15 s herunterdrehen, bis gestoppt).
   3. Waffel entfernen und 7 min bei 65 °C weich backen, dann 45 min bei 95 °C.
   4. Bewegen Sie den Wafer in einen Mask aligner und legen Sie die transparente Maske mit einem UV-Filter in den Maskenhalter. Setzen Sie den Wafer 2 Zyklen von 230 mJ/cm²mit einer Verzögerung von 30 s aus, was einer Gesamtexposition von 460 mJ/cm2^erwirrt.
   5. Backen Sie die freiliegende Waffel nach der Exposition über Nacht in einem 50 °C-Ofen.
   6. Schalten Sie den Ofen am nächsten Morgen aus, und nachdem die Waffel auf Raumtemperatur abgekühlt ist, tauchen Sie sie in SU8-developer. Entfernen Sie den Wafer alle 5 Minuten vom Entwickler, waschen Sie ihn mit IPA und legen Sie ihn dann wieder in den Entwickler.
   7. Nach ca. 20 min oder wenn das IPA klar läuft, trocknen Sie die Waffel mit Luftstickstoff und backen Sie sie in einem auf 150 °C eingestellten Ofen hart; Sobald der Ofen 150 °C erreicht, schalten Sie ihn aus, aber öffnen Sie ihn nicht. Lassen Sie die Waffel im Ofen, bis sie Raumtemperatur erreicht hat, und entfernen Sie dann die Waffel.
   8. Bestätigen Sie die Höhe der SU8 mit einem Profilometer und die optischen Merkmale mit einem Lichtmikroskop. Nach der Bestätigung kleben Sie den Wafer in eine 150 mm Kunststoff-Petrischale.
2. Weiche Lithographie
   HINWEIS: Der Wafer, der auf die Petrischale geklebt wird, muss silanisiert werden, um zu verhindern, dass das PDMS an den SU8-Funktionen haftet.
   1. Den Wafer (auf eine Kunststoff-Petrischale gezapft) über eine Glas-Petrischale gleicher Größe mit 0,4 ml Methyltrichlorsilan (MTCS) umkehren und den Wafer 4 min lang den Dämpfen aussetzen. Drehen Sie die Waffel aufrecht und legen Sie den Deckel auf die Petrischale.
   2. Mischen Sie 30 g Silikonelastomerbasis im Verhältnis 10:1 zum Härter. Nehmen Sie den Deckel von der Petrischale und gießen Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) auf den Wafer und entgasen Sie dann in einem Aussätzer.
   3. Sobald alle Blasen verschwunden sind, stellen Sie den Wafer für 1,5 h bei 80 °C, um das PDMS auszuhärten.
   4. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig ab und stanzen Sie die Ein- und Ausgänge für die Gewebeanschlüsse und Medienkanäle mit einem 1 mm bzw. 1,5 mm Biopsiestempel.
   5. Reinigen Sie die PDMS-Kanäle mit Klebeband, um Staub zu entfernen. Als nächstes die Abdecklippen (18 x 18 mm, Nr. 1) in 70% Ethanol für mindestens 15 min einweichen. Diese trocknen Sie diese dann mit Gewebetüchern ab.
   6. Sowohl die Coverlips als auch die PDMS-Kanäle (Feature-Seite belichtet) für 1 minute dem Plasma (Einstellung auf hoch) zulegen, dann schnell miteinander verbinden und über Nacht in einen 80 °C-Ofen legen, um die Verbindung zu sichern.
      HINWEIS: Während der Verklebung ist es wichtig, leichten Druck auf die Kanten der PDMS-Kanäle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen PDMS und Glas zu gewährleisten und gleichzeitig den Kanal selbst zu vermeiden, um einen Kanalkollaps zu verhindern.
3. Gerätevorbereitung
   1. Tauchen Sie die gebundenen PDMS-Geräte in entionisiertes Wasser (DI H₂O) und Autoklaven mit dem Flüssigkeitskreislauf. Als nächstes saugen Sie die Flüssigkeit aus den Geräten ab und autoklavieren Sie erneut mit dem Schwerkraftzyklus. Anschließend die sterilisierten Geräte über Nacht bei 80 °C dehydrieren.

2. Stammzellkultur (ungefähre Dauer: 1-2 Monate)

1. hiPSC-Kultur und -Wartung
   HINWEIS: Die hiPSCs müssen nach dem Auftauen in vitro vor der Kryokonservierung oder Differenzierung für drei aufeinanderfolgende Passagen kultiviert werden. hiPSCs werden je nach Zelllinie in E8- oder mTeSR1-Medium auf den matrixbeschichteten Basalmembranplatten^{24 kultiviert.}
   1. Um Platten mit hESC-Qualität Basalmembranmatrix zu beschichten, tauen Sie ein Aliquot des Matrixmediums (chargenabhängiges Volumen, in der Regel 200-300 μL; bei -80 °C gelagert) auf, indem Sie es auf 25 mL DMEM/F-12K auf Eis geben. Geben Sie 1 ml dieser Suspension in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Lassen Sie die Platte mindestens 1 h bei 37 °C im Inkubator.
   2. Modifizieren Sie nach dem Auftauen das E8-Medium für die hiPSC-Kultur, indem Sie 5 μM Y-27632²⁵ (E8+ RI) hinzufügen. Verwenden Sie dieses Medium anschließend 24 Stunden lang und wechseln Sie dann das Medium auf frisches E8.
      HINWEIS: Für routinemäßige Medienwechsel werden unveränderte E8-Medien für die hiPSC-Kultur verwendet. Für eine regelmäßige Wartung müssen E8-Medien täglich gewechselt werden, ca. 24 h nach dem vorherigen Medienwechsel.
   3. Passagezellen an Tag 3 oder Tag 4, Aspiraieren Sie Medien und waschen Sie sie dann gut mit 1 ml 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Lösung (DPBS).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen zu etwa 70% konfluent sind. Lassen Sie sie nicht über 70% Konfluenz wachsen.
   4. Saugen Sie das DPBS ab, fügen Sie dann 1 ml 0,5 mM EDTA zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 6-7 min.
   5. EDTA vorsichtig absaugen, 1 ml E8 + RI in jede Vertiefung geben und mit einer 1-ml-Pipette gegen die Oberfläche strahlen (~ 5-10 mal, um alle Zellen zu sammeln). Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   6. Zählen Sie die Zellsuspension und den Zelldurchgang bei der gewünschten Zelldichte (d. h. ~ 200 K pro Vertiefung) in E8 + RI.
   7. Wechseln Sie das Medium 24 h danach auf E8 (ohne RI). Lassen Sie die Zellen mit RI nicht mehr als 24 h.
      HINWEIS: E8 sollte nicht auf 37 °C erhitzt werden. Lassen Sie es immer bei Raumtemperatur zum Erwärmen vor der Zellkultur.
2. Kardiomyozyten (CM) gerichtete Differenzierung
   HINWEIS: Es ist wichtig, das Vorhandensein von Heterogenität zwischen verschiedenen Linien der hiPSCs^26,27zu beachten, so dass die folgenden Schritte möglicherweise für jede Zelllinie optimiert werden müssen. Führen Sie die folgenden Schritte zur CM-Differenzierung aus.
   1. Bereiten Sie RPMI + B27 - Insulin vor, indem Sie 10 ml B27 minus Insulin und 5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Streptokokken) zu 500 ml RPMI 1640 hinzufügen.
   2. Bereiten Sie RPMI + B27 + Insulin vor, indem Sie 10 ml B27 und 5 ml Pen / Streptokokken zu 500 ml RPMI 1640 hinzufügen.
   3. Bereiten Sie RPMI minus Glukose + B27 + Insulin vor, indem Sie 10 ml B27, 5 ml Pen / Streptokokken und 4 mM Natriumlactat zu 500 ml RPMI 1640 ohne Glukose hinzufügen.
   4. Sobald die hiPSCs 85% Konfluenz erreicht haben, beginnen Sie mit der Differenzierung (Tag 0), indem Sie das alte Medium durch 4 ml des RPMI + B27 - Insulinmediums mit 10 μM CHIR99021 zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte ersetzen (dh 25 μL von 10 mM CHIR99021 in 25 ml RPMI + B27 - Insulin hinzufügen und dann sofort 4 ml pro Vertiefung hinzufügen).
      HINWEIS: CHIR99021 ist ein GSK-Inhibitor und führt zur Wnt-Aktivierung. Die optimale Konzentration von CHIR99021 und die anfängliche Konfluenz variieren für jede Zelllinie²⁸. Überprüfen Sie vor dem eigentlichen Experiment immer einen Konzentrationsgradienten von 6-12 μM CHIR99021 und eine Reihe von Aussaatdichten, um optimale Bedingungen für die Einleitung der Differenzierung zu bestimmen.
   5. Genau 24 h später (Tag 1) saugen Sie das Medium an und ersetzen Sie es mit 5 ml vorgewarmtem RPMI + B27 - Insulin zu jeder Vertiefung.
   6. Genau 72 h nach CHIR99021-Zugabe (Tag 3) sammeln Sie 2,5 ml des verbrauchten Mediums aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte, insgesamt 15 ml des verbrauchten Mediums in einem Röhrchen.
   7. Fügen Sie dazu 15 ml frisches RPMI + B27 - Insulinmedium hinzu. IWP2 wird in einer Konzentration von 5 μM in das kombinierte Mediumröhrchen gegeben (d. h. 1 μL IWP2 bei 5 mM pro 1 ml kombiniertes Medium oder 30 μL IWP2 in 30 Gesamt-ml-Medien).
   8. Entfernen Sie ~ 1,5 ml des verbleibenden Mediums pro Vertiefung der Platte, so dass 1 ml des Mediums übrig bleibt. Schwenken Sie die Platte kräftig, um eine ausreichende Entfernung von Zellablagerungen zu gewährleisten. Dann saugen Sie den Rest des alten Mediums an und fügen Sie 5 ml des kombinierten Mediums hinzu, das IWP2 pro Vertiefung der Platte enthält.
      HINWEIS: Die Zugabe von IWP2 zu den Zellen führt zu einer Wnt-Hemmung.
   9. An Tag 5 saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an und ersetzen Sie es durch 5 ml vorgewarmtes RPMI + B27 - Insulin.
   10. CM-Reifung: An Tag 7, Tag 9 und Tag 11 saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an und ersetzen Es durch 5 ml vorgewärmtes RPMI + B27 + Insulin. Spontane Schläge sollten in diesen Tagen beobachtet werden.
   11. CM-Reinigung: Beginnen Sie an Tag 13 und Tag 16 mit dem Glukosemangel, indem Sie das Medium aus jeder Vertiefung absaugen, jede Vertiefung mit 1 ml 1x DPBS waschen und dann 5 ml vorgewärmte RPMI minus Glukose + B27 + Insulin, ergänzt mit 4 mM Natriumlactat, hinzufügen.
   12. An Tag 19 saugen Sie das verbrauchte Medium an und ersetzen Es durch 5 ml vorgewarmtes RPMI + B27 + Insulin in jede Vertiefung, um eine Zellerholung nach der Reinigung zu ermöglichen.
   13. Am Tag 21 replate Zellen nach dem unten beschriebenen CM-Dissoziationsprotokoll (Schritt 3.3). Ziel ist es, 1,5-2 x 10⁶ Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte zu platten. Wenn es sich beispielsweise um eine hocheffiziente Differenzierung handelt, ist es im Allgemeinen gut, die 6 Bohrungen in 9 Vertiefungen zu erweitern.
   14. Ab Tag 21 saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an und ersetzen Sie es alle 2-3 Tage durch 4 ml RPMI + B27 + Insulin.
       HINWEIS: Die hiPSC-CMs sind nach Tag 23 für den experimentellen Einsatz bereit.

3. Erstellung von 3D-Herzgewebe innerhalb des mikrofluidischen Geräts: (Ungefähre Dauer: 2-3 h)

1. hCF Kultur
   1. Kultur humanventrikulärer herzfibroblasten (hCFs; kommerziell von Lonza gewonnen) in T75-Kolben (bei 250K Zellen pro Kolben) in Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag und gehen Sie bei 70% Konfluent. Verwenden Sie die hCFs vor Passage 10, da sie sich an hohen Passagen zu Myofibroblasten unterscheiden können²⁹.
2. hCF-Dissoziation
   1. Um die hCFs zu dissoziieren, nehmen Sie zuerst den Kolben aus dem Inkubator heraus. Legen Sie den Kolben in die Biosicherheitswerkbank und beginnen Sie, die verbrauchten Medien aus dem Kolben anzusaugen. Anschließend den T75-Kolben mit 3 ml 1x DPBS waschen. Schließen Sie die Kappe und schwenken Sie den Kolben.
   2. Saugen Sie die DPBS an. Nehmen Sie 3 ml vorgewärmtes 1x Trypsin-EDTA (0,05%) und fügen Sie es dem Kolben hinzu. Kippen Sie den Kolben und schwenken Sie, um den Boden zu beschichten. Lassen Sie es für 4-6 minuten in einem 37 °C-Inkubator und überprüfen Sie den Kolben unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen lösen, wie durch die runde Zellform und die schwimmenden Zellen nachgewiesen wird. Wenn nicht, legen Sie den Kolben für eine weitere Minute wieder in den Inkubator.
   3. Neutralisieren Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie 3 ml vorgewärmtes FGM3 in den Kolben geben. Dann pipetten Sie die Lösung auf und ab gegen den Boden des Kolbens, um die CFs zu verdrängen.
   4. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und dosieren Sie sie in einem Hämozytometer, um die Zellen mit einem Mikroskop zu zählen.
   5. Zentrifuge die Zellsuspension bei 200 x g für 4 min. Saugen Sie den Überstand an, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
   6. Das Pellet in frischem FGM3 wieder auffüllen, um die gewünschten 75 x 10⁶ Zellen/ml herzustellen. Entweder einen Teil (250K Zellen pro T75-Kolben) oder befolgen Sie das folgende Protokoll, um 3D-Herzgewebe zu erzeugen.
3. CM-Dissoziation
   HINWEIS: Bereiten Sie nach der Differenzierung und Reinigung die CMs für die Verwendung bei der Injektion in mikrofluidische Geräte vor.
   1. Nehmen Sie die Platte der CMs aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Dann waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml 1x DPBS pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Nehmen Sie 6 ml DPBS und pipetten Sie 1 ml pro Vertiefung.
   2. Saugen Sie das DPBS an, achten Sie darauf, die an der Platte befestigten Zellen nicht zu stören. Pipette 6 mL warme Zellablösungslösung (z. B. TrypLE express) und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator für 10 min.
   3. Neutralisieren Sie das Enzym mit einem gleichen Volumen an RPMI + B27+ Insulin (d.h. 1 ml pro Vertiefung) und dissoziieren Sie die Zellen mechanisch, indem Sie mit einer 1 mL Pipette gegen das Kulturgefäß auf und ab pipettieren.
   4. Sammeln Sie die CMs in einem 15-ml-Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 300 x g für 3 min.
   5. Saugen Sie den Überstand an. Das Zellpellet wird in 5 ml RPMI + B27 + Insulin resuspendiert. Pipetetten Sie die Lösung mit einer 1-ml-Pipette auf und ab, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und dosieren Sie sie in einem Hämozytometer, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen.
   6. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 300 x g für 3 min (um eine vollständige Entfernung von TrypLE zu gewährleisten) und saugen Sie den Überstand an. Fügen Sie dann ein geeignetes Volumen von RPMI + B27 + Insulin hinzu, um 75 x 10⁶ Zellen / ml zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn die kardiale Differenzierung/Selektion nicht zu einem hohen CM% (d.h. >80%) führt, wie durch Immunfärbung oder Durchflusszytometrie für CM-spezifische Proteine wie cTnT nachgewiesen, betrachten Sie Zellen nicht als für die Gewebebildung geeignet. Der Differenzierungsprozess sollte in diesem Fall durch Anpassung der CHIR99021-Konzentrationen und der anfänglichen Startdichte optimiert werden. Wenn die CM-Reinigung verbessert werden muss, können andere Methoden verwendet werden, z. B. die Sortierung von CMs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS)^30,31,32.
4. Kollagen-Präparat
   HINWEIS: Bereiten Sie Kollagen aus der hohen Konzentration von Kollagenvorrat (von 8-11 mg / ml) vor. Das Kollagen, das zur Herstellung der Zell-Hydrogel-Mischung verwendet wird, liegt bei 6 mg / ml und die Endkonzentration beträgt 2 mg / ml. Abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Geräte muss das Volumen der zu herstellungden Kollagenlösung zurückgerechnet werden.
   1. Bewahren Sie alle erforderlichen Reagenzien auf Eis in einer Biosicherheitshaube auf.
      HINWEIS: Kollagen ist ein thermoresponsives Hydrogel. Daher muss die Temperatur niedrig bleiben, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
   2. Nehmen Sie 75 μL Kollagen (8 mg/ml) und dosieren Sie es in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Kollagenlösung ist sehr viskos, also langsam mit einer Pipette absaugen.
   3. Nehmen Sie 13,85 μL Medium (d. h. RPMI + B27 + Insulin) und geben Sie es in dasselbe Röhrchen.
   4. Dann nehmen Sie 10 μL Phenolrot und fügen Sie es der Mischung hinzu und resuspend.
   5. Nehmen Sie schließlich 1,15 μL 1N NaOH und fügen Sie sie der Suspension hinzu.
   6. Mit einer 200 μL Pipettenspitze die Suspension wieder aufschnüsen.
      HINWEIS: Das Stammkollagen hat einen sauren pH-Wert, der die Zugabe von NaOH zur Neutralisierung erfordert, bevor es zur Verkapselung der Herzzellen verwendet wird. Phenolrot wirkt als pH-Indikator; Fügen Sie dies daher vor dem NaOH-Zusatz hinzu. An diesem Punkt ist die Kollagenlösung gelb, was ihren Säuregehalt anbezeigt. Nach der Zugabe von NaOH sollte die Lösung orange bis hellrosa werden, was auf ihre Neutralisation hinweist.
5. Hydrogelmischung und Zellvorbereitung
   HINWEIS: In diesem Schritt erfolgt die Verkapselung der Zellen innerhalb des kollagenbasierten Hydrogels. Die Zellen sowie alle Hydrogelvorstufen sollten bei den nächsten Schritten auf Eis gelegt werden.
   1. Wenn die CFs noch nicht trypsinisiert wurden, lagern Sie die CM-Suspension an dieser Stelle in einem 15-ml-Zentrifugenrohr, wobei der Deckel abgeschraubt ist, um den Gasfluss zu ermöglichen, in einem 37 °C-Inkubator. Dissoziieren Sie parallel die CFs und sammeln mit einer Dichte von 75 x 10⁶ Zellen/ml zum Laden des Geräts.
   2. Mischen Sie die suspendierten CMs mit CFs im Verhältnis 4:1. Nehmen Sie ein Aliquot von 8 μL CMs und fügen Sie es in ein frisches Zentrifugenröhrchen auf Eis. Nehmen Sie dann 2 μL CFs und fügen Sie die Zellsuspension im Zentrifugenröhrchen hinzu.
   3. Resuspendieren Sie die Zellsuspension, greifen Sie 5,6 μL der Zellsuspension und legen Sie sie in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Nehmen Sie 4 μL des Kollagens, das gerade in den obigen Schritten zubereitet wurde, und fügen Sie es zu einer 4: 1 CM: CF-Mischung hinzu. Fügen Sie 2,4 μL Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix hinzu, wodurch die endgültige Zelldichte 35 x 10⁶ Zellen / ml für die Geräteinjektion beträgt. Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension homogen ist.
6. Einsetzen des Geräts
   HINWEIS: Sobald die cell:hydrogel-Mischung vorbereitet ist, muss sie in die Geräte eingeführt werden.
   1. Nehmen Sie autoklavierte mikrofluidische Geräte aus dem 80 °C-Ofen und stellen Sie sie vor dem Einsetzen der Zellsuspension für mindestens 1 h in die Biosicherheitswerkbank, damit die Geräte unter Beibehaltung der Sterilität auf Raumtemperatur abkühlen können.
   2. Legen Sie die Geräte in 60 x 15 mm Petrischalen, bei 3-4 Geräten pro Schüssel. Füllen Sie eine 150 x 15 mm Petrischale mit einer dünnen Schicht DI H₂O, um 3 der 60 x 15 mm Petrischalen zu halten. Dieser Schritt schafft eine befeuchtete Umgebung, die die mikrofluidischen Geräte umgibt.
   3. Verwenden Sie eine neue Spitze und resuspendieren Sie die cell:hydrogel-Mischung gründlich, indem Sie die Suspension pipettieren, während das Rohr auf Eis bleibt.
   4. Führen Sie die Spitze in den Injektionsanschluss des Geräts ein und injizieren Sie langsam und stetig 3 μL der cell:hydrogel Suspension mit einer 20 μL Pipettenspitze in den Gewebebereichseinlass eines mikrofluidischen Geräts. Sobald der Anschluss gefüllt ist, stoppen Sie die Injektion und entfernen Sie die Spitze. Wiederholen Sie dies für alle Geräte oder die gesamte vorbereitete Hydrogelsuspension.
      HINWEIS: Das kleine Volumen der cell:hydrogel Suspension erwärmt / kühlt sehr schnell ab, daher ist es wichtig, die Suspension so lange wie möglich auf Eis zu halten. Beim Einsetzen die Lösung vom Eis pipetten und so schnell wie möglich in die Geräte einführen, da das Hydrogel in der Pipettenspitze polymerisieren kann. Es ist wichtig, kleine Volumina der cell:hydrogel-Suspension gleichzeitig zu erzeugen, so dass, wenn viele Geräte injiziert werden sollen, die cell:hydrogel-Suspension für jeden Satz von 4 Geräten frisch gemacht werden muss.
   5. Drehen Sie die Geräte in ihren Petrischalen mit einer Pinzette um und legen Sie sie mit Wasser in die große Petrischale. Inkubieren Sie in einem 37 °C-Inkubator für 9 min zur Hydrogelpolymerisation.
   6. Nehmen Sie die Geräte aus dem Inkubator, drehen Sie die Geräte aufrecht und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 9 minuten, um die Hydrogelpolymerisation abzuschließen.
   7. Injizieren Sie RPMI + B27 + Insulin in die flankierenden Medienkanäle (~ 20 μL pro Gerät). Stellen Sie die Geräte bei 37 °C wieder in den Inkubator. Wechseln Sie täglich die Medien innerhalb der Medienkanäle mit frischem RPMI + B27 + Insulin. Es wurde nachgewiesen, dass die Geräte von 14-21 Tagen kultiviert werden²⁰.
      HINWEIS: Aufgrund des geringen Medienvolumens pro Chip ist es wichtig, die Geräte in einer großen Petrischale mit DI_H2O zu halten, die als befeuchtete Kammer dient, um eine Verdunstung von Medien zu verhindern. Zusätzlich können kleine Tröpfchen von überschüssigem RPMI + B27 + Insulin bei routinemäßigen Medienwechseln auf die Oberseite der Kanalein-/-auslässe pipettiert werden.

4. Gewebeanalyse

1. Live-Bildgebung
   HINWEIS: Alle Live-Bildgebung sollte mit einem Stufeninkubator durchgeführt werden, um 37 °C und 5% CO_{2 zu}erhalten.
   1. Legen Sie die Geräte in einen umweltkontrollierten Stufeninkubator. Nehmen Sie 30-s-Videos von mehreren Spots in jedem Gerät mit der maximalen Bildrate auf.
   2. Um die Gewebekontraktilität nach der Extraktion der Prügelsignale zu beurteilen, verwenden Sie den ergänzenden, speziell geschriebenen MATLAB-Code, um Peaks (Supplementary File 2) zur Berechnung der Variabilität des Inter-Beat-Intervalls zu extrahieren.
   3. Wechseln Sie die Medien in Geräten in der Zellkulturhaube und legen Sie sie dann wieder in den Zellkultur-Inkubator.
2. Immunfluoreszierende Färbung
   1. PBS-Glycin vorbereiten: 100 mM Glycin in PBS auflösen und 0,02% NaN₃ zur Langzeitlagerung hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
   2. PBS-Tween-20 vorbereiten: Fügen Sie PBS 0,05% Tween-20 hinzu und fügen Sie 0,02% NaN₃ für die Langzeitlagerung hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
   3. IF-Puffer vorbereiten: Fügen Sie 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA und 0,05% Tween-20 zu PBS hinzu und fügen Sie 0,02% NaN₃ zur Langzeitspeicherung hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
   4. Bereiten Sie 10% Ziegenserum vor: Resuspend das lyophilisierte Ziegenserum in 2 ml PBS, um 100% Ziegenserum herzustellen. Dann verdünnen Sie die 2 ml mit 18 ml PBS, um 10% Ziegenserum herzustellen.
   5. Fixieren Sie die Proben, indem Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in die Gewebekanäle geben und bei 37 °C für 20 min inkubieren.
   6. Waschen Sie die Zellen, indem Sie PBS-Glycin 2x in die Gewebekanäle für 10 min Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.
   7. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von PBS-Tween-20 für 10 min bei Raumtemperatur.
   8. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie den Gewebekanälen für 30 Minuten bei Raumtemperatur einen IF-Puffer hinzufügen.
   9. Blockieren Sie die Zellen, indem Sie 10% ige Ziegenserumlösung für 1 h bei Raumtemperatur in die Gewebekanäle zuweisen.
   10. Die nicht konjugierten primären Antikörper in 10% Ziegenserum in den gewünschten Konzentrationen verdünnen (siehe Ergänzungsdatei 3),in die Gewebekanäle geben und die Proben über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   11. Am nächsten Tag waschen Sie die Proben, indem Sie PBS-Tween-20 3x für jeweils 20 minuten bei Raumtemperatur in die Gewebekanäle zuweisen.
       HINWEIS: Führen Sie ab Schritt 4.2.12 alle Aufgaben im Dunkeln aus, damit die Proben vor Licht geschützt sind.
   12. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in PBS-Tween-20 in den gewünschten Konzentrationen, zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 10 min, um alle Ausfällungen zu sammeln, und fügen Sie sie dann den Gewebekanälen hinzu.
   13. Nach 30 min-1 h waschen Sie die Proben mit PBS-Tween-20 3x jeweils 10 min bei Raumtemperatur.
   14. Fügen Sie den Gewebekanälen Anti-Fade oder gewünschtes Montagemedium hinzu. Anschließend können die Proben mittels Fluoreszenzmikroskopie oder mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, wenn eine höhere Vergrößerung gewünscht wird. Um das gesamte 3D-Gewebe zu visualisieren, können Bilder auf verschiedenen Z-Ebenen gestapelt und zu repräsentativen 3D-Bildern rekonstruiert werden.

Ergebnisse

Um eine hochgereinigte Population von CMs aus hiPSCs zu erhalten, wird eine modifizierte Version verwendet, die eine Kombination aus dem Lian-Differenzierungsprotokoll³³ und den Tohyama-Reinigungsschritten³⁴ beinhaltet (siehe Abbildung 1A für den experimentellen Zeitplan). Die hiPSCs müssen kolonieartig sein, ~85% konfluent und gleichmäßig in der Kultur gut 3-4 Tage nach der Passage zu Beginn der CM-Differenzierung verteilt sein (

Diskussion

Die Bildung eines in vitro humanen Herzgewebemodells mit verbesserten Zell-Zell-Interaktionen und biomimetischer 3D-Struktur ist für die kardiovaskuläre Grundlagenforschung und entsprechende klinische Anwendungen unerlässlich¹. Dieses skizzierte Protokoll erklärt die Entwicklung von 3D-humanem anisotropem Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät unter Verwendung der Co-Kultur von Stammzell-abgeleiteten CMs mit verbindenden CFs, die in einem Kollagenhydrogel verkapselt sind, um die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica