JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является объяснение и демонстрация разработки трехмерной (3D) микрофлюидной модели высокоровневой сердечной ткани человека, состоящей из кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, совместно культивируемых с сердечными фибробластами (FF) в биомиметическом гидрогеле на основе коллагена, для применения в инженерии сердечной ткани, скрининге лекарств и моделировании заболеваний.

Аннотация

Основной причиной смерти во всем мире по-прежнему является сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Тем не менее, моделирование физиологической и биологической сложности сердечной мышцы, миокарда, как известно, трудно выполнить in vitro. В основном, препятствия заключаются в потребности в кардиомиоцитах человека (КМ), которые либо являются взрослыми, либо демонстрируют взрослые фенотипы и могут успешно воспроизводить клеточную сложность миокарда и сложную 3D-архитектуру. К сожалению, из-за этических проблем и отсутствия доступной первичной сердечной ткани человека, полученной от пациента, в сочетании с минимальным распространением КМ, поиск жизнеспособных человеческих КМ был ограничивающим шагом для инженерии сердечной ткани. С этой целью большинство исследований перешли к сердечной дифференцировке индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в качестве основного источника ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ СМ, что привело к широкому включению hiPSC-CMs в анализы in vitro для моделирования сердечной ткани.

Здесь, в этой работе, мы демонстрируем протокол для разработки 3D-зрелой сердечной ткани человека, полученной из стволовых клеток, в микрофлюидном устройстве. Мы специально объясняем и визуально демонстрируем производство 3D-модели анизотропной сердечной ткани in vitro на чипе из КМ, полученных из hiPSC. Мы в первую очередь описываем протокол очистки для выбора для КМ, ко-культуру клеток с определенным соотношением путем смешивания КМ с человеческими ХФ (hCF) и суспензию этой кокультуры в гидрогеле на основе коллагена. Далее мы демонстрируем инъекцию нагруженного клетками гидрогеля в наше четко определенное микрофлюидное устройство, встроенное в шахматном порядке эллиптические микропосты, которые служат топографией поверхности, чтобы вызвать высокую степень выравнивания окружающих клеток и гидрогелевой матрицы, имитируя архитектуру нативного миокарда. Мы предполагаем, что предлагаемая 3D-анисотропная модель сердечной ткани на чипе подходит для фундаментальных биологических исследований, моделирования заболеваний и, благодаря ее использованию в качестве инструмента скрининга, фармацевтического тестирования.

Введение

В последние годы широко изучены подходы к тканевой инженерии для сопровождения клинических результатов in vivo в регенеративной медицине и моделировании заболеваний1,2. Значительное внимание было уделено моделированию сердечной ткани in vitro из-за присущих трудностей в поиске первичной сердечной ткани человека и производстве физиологически значимых суррогатов in vitro, ограничивая фундаментальное понимание сложных механизмов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)1,3. Традиционные модели часто включали 2D-анализы монослойной культуры. Тем не менее, важность культивирования сердечных клеток в 3D-среде для имитации как нативного ландшафта миокарда, так и сложных клеточных взаимодействий была широко охарактеризована4,5. Кроме того, большинство моделей, произведенных до сих пор, включали монокультуру КМ, дифференцированных от стволовых клеток. Тем не менее, сердце состоит из нескольких типов клеток6 в сложной 3D-архитектуре7,что оправдывает критическую необходимость улучшения сложности состава тканей в рамках 3D-моделей in vitro для лучшей имитации клеточных компонентов нативного миокарда.

На сегодняшний день было изучено много различных подходов к созданию биомиметических 3D-моделей миокарда8. Эти подходы варьируются от экспериментальных установок, которые позволяют в режиме реального времени рассчитывать генерируемую силу, от монокультурных КМ, посеянных на тонких пленках (считающихся мышечными тонкими пленками (MTF))9,до совместной культивирования сердечных клеток в 3D-гидрогелевых матрицах, взвешенных среди отдельно стоящих кантилеверов (считающихся инженерными тканями сердца (ET))10. Другие подходы были сосредоточены на реализации методов микроформования для имитации анизотропии миокарда, от монокультурных КМ в 3D-гидрогеле, суспендированном среди выступающих микропостов в тканевомпятне 11,до монокультурных КМ, посеянных среди вдавленных микроплодов12,13. Каждому из этих методов присущи ими преимущества и недостатки, поэтому уместно использовать технику, которая согласуется с предполагаемым применением и соответствующим биологическим вопросом.

Способность усиливать созревание КМ, полученных из стволовых клеток, имеет важное значение для успешной инженерии in vitro взрослой ткани миокарда и трансляции последующих результатов в клинические интерпретации. С этой целью методы зрелых КМ были широко исследованы, как в 2D, так и в 3D14,15,16. Например, электрическая стимуляция, включенная в ЭХТ, принудительное выравнивание КМ с топографией поверхности, сигнальными сигналами, факторами роста от кокультуры и / или условиями 3D-гидрогеля и т. Д., Все это приводит к изменению в пользу созревания СМ по меньшей мере в одном из следующих: морфология клеток, обработка кальция, саркомерная структура, экспрессия генов или сократительная сила.

Из этих моделей подходы, использующие микрофлюидные платформы, сохраняют определенные преимущества в природе, такие как контроль градиентов, ограниченный ввод клеток и минимальные необходимые реагенты. Кроме того, многие биологические реплики могут быть сгенерированы одновременно с использованием микрофлюидных платформ, служащих для лучшего препарирования интересующего биологического механизма и увеличения размера экспериментальной выборки в пользу статистической мощности17,18,19. Кроме того, использование фотолитографии в процессе изготовления микрофлюидных устройств позволяет создавать точные признаки (например, топографии) на микро- и наноуровне, которые служат мезоскопическими сигналами для улучшения окружающей клеточной структуры и архитектуры тканей на макроуровне18,20,21, 22 для различных применений в регенерации тканей и моделировании заболеваний.

Ранее мы продемонстрировали разработку новой 3D-модели сердечной ткани на чипе, которая включает топографию поверхности в виде врожденных эллиптических микропостов для выравнивания гидрогелево-инкапсулированных кокумулированных сердечных клеток во взаимосвязанную анисотропную ткань20. После 14 дней культивирования ткани, образующиеся в микрофлюидном устройстве, являются более зрелыми по своему фенотипу, профилю экспрессии генов, характеристикам обработки кальция и фармацевтическому ответу по сравнению с монослойным и 3D-изотропным контролем23. Протокол, описанный в настоящем описании, описывает способ создания этой 3D-совместно культивируемой, выровненной (т.е. анизотропной) сердечной ткани человека в микрофлюидном устройстве с использованием ХМ, полученных из hiPSC. В частности, мы объясняем способы дифференцировки и очистки hiPSC в сторону КМ, добавление hCF с КМ для получения установленной популяции кокультур, введение клеточной популяции, инкапсулированной в гидрогеле коллагена, в микрофлюидные устройства, и последующий анализ 3D-сконструированных тканей с помощью сократительных и иммунофлуоресцентных анализов. Полученные 3D-инженерные микроткани подходят для различных применений, включая фундаментальные биологические исследования, моделирование сердечно-сосудистых заболеваний и фармацевтические испытания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Выполнять все обработки клеток и подготовку реагентов в шкафу биобезопасности. Убедитесь, что все поверхности, материалы и оборудование, которые вступают в контакт с клетками, стерильны (т. Е. Распыляйте 70% этанола). Клетки следует культивировали в увлажненный инкубатор при 37 °C, 5% CO2. Вся культура и дифференциация hiPSC выполняется в 6-скважинных пластинах.

1. Создание микрофлюидного устройства (приблизительная продолжительность: 1 неделя)

  1. фотолитография
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маска, разработанная с использованием файла CAD (предоставляется в виде дополнительного файла 1),содержит конструкцию микрофлюидного канала. Распечатайте дизайн на прозрачной маске. Затем выполните стандартную фотолитографию с отрицательным фоторезистом SU8 2075 на 4-дюймовой кремниевой пластине в чистой комнате.
    1. Очистите кремниевую пластину изопропиловым спиртом (IPA) и высушите азотом. Выпекать при 200 °C в течение 5 мин для обезвоживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте пластину пинцезом.
    2. Поместите пластину в спин-коатер. Внесите 3-4 мл SU8 в центр пластины, затем вращайтесь, чтобы сформировать слой 200 мкм (т. Е. Нарастите до 15 с до 500 об/мин, открутите в течение 10 с, увеличь от 5 с до 1 200 об/мин и вращайтесь в течение 30 с, затем понижайте в течение 15 с, пока не остановитесь).
    3. Выньте и мягко запекайте в течение 7 мин при 65 °C, затем 45 мин при 95 °C.
    4. Переместите пластину в элайнер маски и поместите прозрачную маску в держатель маски с помощью УФ-фильтра. Подвергайте пластину 2 циклам по 230мДж/см2, с задержкой 30 с, при общей экспозиции 460 мДж/см2.
    5. Выполните выпекание после воздействия на открытой вафле в духовке с 50 °C в течение ночи.
    6. Выключите духовку на следующее утро, а после того, как вафля остынет до комнатной температуры, погружайте ее в SU8-разработчик. Снимайте пластину с разработчика каждые 5 минут и мойте с помощью IPA, а затем поместите ее обратно в разработчика.
    7. Примерно через 20 минут или когда IPA очистится, высушите пластину воздушным азотом и запекайте в духовке, установленной на 150 °C; как только духовка достигнет 150 °C, выключите ее, но не открывайте. Оставьте в духовке до тех пор, пока она не достигнет комнатной температуры, затем снимите.
    8. Подтвердите высоту SU8 с помощью профилометра и оптические характеристики с помощью светового микроскопа. После подтверждения заклейте пластину внутрь пластиковой чашки Петри толщиной 150 мм.
  2. Мягкая литография
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина, приклеенная к чашке Петри, должна быть силанизирована, чтобы предотвратить присоединение PDMS к функциям SU8.
    1. Переверните пластину (прикосните к пластиковой чашке Петри) поверх стеклянной чашки Петри того же размера, содержащей 0,4 мл метилтрихлорсилана (MTCS), и подвергните пластину воздействию паров в течение 4 мин. Поверните пластину в вертикальном положении и положите крышку на чашку Петри.
    2. Смешайте 30 г силиконовой эластомерной основы с отверждающим агентом в соотношении 10:1. Снимите крышку с чашки Петри и вылейте полидиметилсилоксан (PDMS) на пластину, затем дегазируйте в адсорбаторе.
    3. Как только все пузырьки исчезнут, поместите пластину при 80 °C в течение 1,5 ч, чтобы вылечить PDMS.
    4. Тщательно отклейте PDMS и пробивайте входы и выходы для тканевых портов и медиаканалов с помощью 1 мм и 1,5 мм биопсийного перфоратора соответственно.
    5. Очистите каналы PDMS лентой для удаления пыли. Далее замочите крышки (18 х 18 мм, No1) в 70% этаноле не менее чем на 15 мин. Затем высушите их салфетками.
    6. Подвергите как крышки, так и каналы PDMS (выставляемые со стороны объекта) плазме (установка на высокий уровень) в течение 1 мин, затем быстро соедините вместе и поместите в печь с 80 °C на ночь, чтобы закрепить связь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время склеивания важно оказывать мягкое давление на края каналов PDMS, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между PDMS и стеклом, избегая при этом самого канала, чтобы предотвратить разрушение канала.
  3. Подготовка прибора
    1. Погружайте связанные pdms-устройства в деионизированную воду (DI H2O) и автоклав с жидкостным циклом. Затем аспирировать жидкость из устройств и автоклава снова с помощью гравитационного цикла. Затем обезвоживают стерилизованные устройства в течение ночи при 80 °C.

2. Культура стволовых клеток (приблизительная продолжительность: 1-2 месяца)

  1. Культура и обслуживание hiPSC
    ПРИМЕЧАНИЕ: HiPSCs необходимо культивировать в течение трех последовательных проходов после оттаивания in vitro перед криоконсервацией или дифференцировкой. hiPSCs культивируют в среде E8 или mTeSR1, в зависимости от клеточной линии, на пластинах24с покрытием матрицы базальной мембраны.
    1. Чтобы покрыть пластины матрицей базальной мембраны качества hESC, разморозить одну аликвоту матричной среды (объем, зависящий от лота, обычно 200-300 мкл; хранить при -80 °C), добавив ее к 25 мл DMEM/F-12K на льду. Распределить по 1 мл этой суспензии в каждую скважину из 6-скважинной пластины. Оставьте пластину в инкубаторе при 37 °C не менее чем на 1 ч.
    2. После оттаивания модифицируйте носитель E8 для культуры hiPSC, добавив 5 мкМ Y-2763225 (E8+RI). Используйте этот носитель в течение 24 ч после этого, затем измените его на свежий E8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для рутинных изменений носителей для языка и культуры hiPSC используется немодифицированный носитель E8. Для регулярного технического обслуживания носитель E8 необходимо менять каждый день, примерно через 24 ч после предыдущей смены носителя.
    3. Проход клетки на 3-й или 4-й день, аспиратную жиму, затем промыть каждую скважину 1 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco (DPBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки находятся на 70% в слиянии. Не позволяйте им расти дальше 70% слияния.
    4. Аспирировать DPBS, затем добавить 1 мл 0,5 мМ ЭДТА в каждую скважину и инкубировать при комнатной температуре в течение 6-7 мин.
    5. Осторожно аспирировать ЭДТА, добавить 1 мл E8 + RI в каждую скважину и взорвать поверхность пипеткой 1 мл (~ 5-10 раз, чтобы собрать все клетки). Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл.
    6. Подсчитайте суспензию и прохождение ячейки при желаемой плотности ячейки (т.е. ~200 К на скважину) в E8+RI.
    7. Смена носителя на E8 (без RI) через 24 ч. Не оставляйте клетки с RI более 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: E8 не следует нагревать до 37 °C. Всегда оставляйте его при комнатной температуре для согревания перед посевом клеток.
  2. Кардиомиоцитная (СМ) направленная дифференцировка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить существование неоднородности между различными линиями hiPSCs26, 27,поэтому следующие шаги, возможно, потребуется оптимизировать для каждой клеточной линии. Выполните следующие действия для дифференциации CM.
    1. Готовят RPMI + B27 - инсулин, добавляя 10 мл B27 минус инсулин и 5 мл пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококк) к 500 мл RPMI 1640.
    2. Приготовьте RPMI + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27 и 5 мл ручки / стрептококка к 500 мл RPMI 1640.
    3. Приготовьте RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27, 5 мл ручки / стрептококка и 4 мМ лактата натрия к 500 мл RPMI 1640 без глюкозы.
    4. Как только hiPSCs достигнут 85% конфлюентности, начинают дифференцировку (день 0) путем замены старой среды 4 мл RPMI + B27 - инсулиновой среды, содержащей 10 мкМ CHIR99021, к каждой скважине 6-скважинной пластины (т.е. добавляют 25 мкл 10 мМ CHIR99021 в 25 мл RPMI + B27 - инсулина, а затем сразу добавляют 4 мл на скважину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CHIR99021 является ингибитором GSK и приводит к активации Wnt. Оптимальная концентрация CHIR99021 и начальная концентрация варьируются для каждой клеточной линии28. Всегда проверяйте градиент концентрации 6-12 мкМ CHIR99021 и серию плотностей посева перед фактическим экспериментом, чтобы определить оптимальные условия для начала дифференциации.
    5. Ровно через 24 ч (1 день) аспирируют среду и заменяют 5 мл предварительно выпевенного RPMI +B27 – инсулина в каждую скважину.
    6. Ровно через 72 ч после добавления CHIR99021 (День 3) соберите 2,5 мл отработанного носителя из каждой скважины 6-скважинной плиты, в общей сложности 15 мл отработанного носителя в трубе.
    7. К этому добавляют 15 мл свежей RPMI + B27 – инсулиновой среды. Добавьте IWP2 к концентрации 5 мкМ в комбинированную среду (т.е. 1 мкл IWP2 при 5 мМ на 1 мл комбинированной среды или 30 мкл IWP2 в 30 общих мл среды).
    8. Удалите ~1,5 мл оставшейся среды на скважину пластины так, чтобы остался 1 мл среды. Энергично закрутите пластину, чтобы обеспечить адекватное удаление остатков клеток. Затем аспирируют остальную часть старой среды и добавляют 5 мл комбинированной среды, содержащей IWP2, на скважину пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление IWP2 к клеткам приводит к ингибированию Wnt.
    9. На 5 день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выжженного RPMI + B27 - инсулина.
    10. Созревание СМ: На 7-й, 9-й и 11-й день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выровненного RPMI + B27 + инсулин. Спонтанное избиение должно наблюдаться примерно в эти дни.
    11. Очистка СМ: На 13-й и 16-й день начните глюкозное голодание, аспирируя среду из каждой скважины, промывая каждую скважину 1 мл 1x DPBS, а затем добавляя 5 мл предварительного RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, дополненный 4 мМ лактата натрия.
    12. На 19-й день аспирировать отработанную среду и заменить ее 5 мл предварительно выгремленного RPMI + B27 + инсулина в каждую скважину, чтобы обеспечить восстановление клеток после очистки.
    13. На 21-й день повторно размещайте клетки, следуя описанной ниже протоколу диссоциации СМ (шаг 3.3). Стремитесь к пластине 1,5-2 х 106 ячеек на скважину в 6-скважинной пластине. Например, если это высокоэффективная дифференциация, как правило, расширение 6 скважин в 9 скважин является хорошим.
    14. Начиная с 21-го дня, аспирировать среду из каждой скважины и заменять ее 4 мл RPMI + B27 + инсулина каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HiPSC-CMs готовы к экспериментальному использованию после 23-го дня.

3. Создание 3D сердечной ткани в микрофлюидном устройстве: (Приблизительная продолжительность: 2-3 ч)

  1. Культура hCF
    1. Культивируем желудочковые сердечные фибробласты человека (hCF; получены коммерчески из Lonza) в колбах T75 (по 250K клеток на колбу) в Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Меняйте сми через день, и проход при 70% слиянии. Используйте hCF перед пассажем 10, так как они могут начать дифференцироваться до миофибробластов в высоких проходах29.
  2. Диссоциация hCF
    1. Чтобы диссоциировать hCF, сначала выньте колбу из инкубатора. Поместите колбу внутрь шкафа биобезопасности и начните аспирировать отработанные среды из колбы. Затем промыть колбу T75 3 мл 1x DPBS. Закройте колпачок и закрутите колбу.
    2. Аспирировать DPBS. Принимайте 3 мл предварительного 1x Трипсина-ЭДТА (0,05%) и добавьте его в колбу. Наклоните колбу и закрутите, чтобы покрыть дно. Оставьте его в инкубаторе с 37 °C в течение 4-6 минут, проверяя колбу под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отсоеживаются, о чем свидетельствует круглая форма клетки и плавающие клетки. Если нет, то поставьте колбу обратно в инкубатор еще на минуту.
    3. Нейтрализуют действие трипсина, добавив в колбу 3 мл предварительно выплавленного FGM3. Затем пипеткой нажмите раствор вверх и вниз на дно колбы, чтобы выбить ХФ.
    4. Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре, чтобы подсчитать клетки с помощью микроскопа.
    5. Центрифугировать клеточную суспензию при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант, стараясь не потревожить клеточную гранулу.
    6. Повторно суспендировать гранулы в свежем FGM3, чтобы получить желаемые 75 x 106 клеток/мл. Либо проходите часть (250K клеток на колбу T75), либо следуйте приведенному ниже протоколу для создания 3D-сердечной ткани.
  3. Диссоциация СМ
    ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференцировки и очистки подготовьте КМ для использования в инъекциях в микрофлюидные устройства.
    1. Вытащайте пластину СМ из инкубатора и аспирировать жимы. Затем промывайте скважины 1 мл 1x DPBS на скважину 6-скважинной плиты. Возьмите 6 мл DPBS и пипетку по 1 мл на скважину.
    2. Аспирировать DPBS осторожно, чтобы не потревожить клетки, прикрепленные к пластине. Пипетку 6 мл теплого клеточного отслоения раствора (например, TrypLE express) и добавляют 1 мл на колодец. Инкубируют клетки в инкубаторе при 37 °C в течение 10 мин.
    3. Нейтрализовать фермент равным объемом RPMI + B27+ инсулина (т.е. 1 мл на скважину) и механически диссоциировать клетки путем пипетки вверх и вниз против сосуда культуры пипеткой 1 мл.
    4. Соберите КМ в 15 мл центрифужной трубки. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин.
    5. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 5 мл RPMI + B27 + инсулина. Пипетка раствора вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл для обеспечения правильного перемешивания. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре для определения общего количества клеток.
    6. Центрифугируют клетки снова при 300 х г в течение 3 мин (чтобы обеспечить полное удаление TrypLE) и аспирируют супернатант. Затем добавьте соответствующий объем RPMI + B27 + инсулина для достижения 75 х 106 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердечная дифференцировка/отбор не приводит к высокому CM% (т.е. >80%), о чем свидетельствует иммуноокрашивание или проточная цитометрия для CM-специфических белков, таких как cTnT, не рассматривайте клетки как подходящие для формирования ткани. Процесс дифференциации должен быть оптимизирован, когда это происходит, путем корректировки концентраций CHIR99021 и начальной начальной плотности. Если очистка СМ нуждается в улучшении, могут быть использованы другие методы, такие как сортировка для КМ с флуоресцентной активацией сортировки клеток (FACS) или магнитно-активированной сортировки ячеек (MACS)30,31,32.
  4. Препарат коллагена
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте коллаген из высокой концентрации коллагенового запаса (в пределах 8-11 мг/мл). Коллаген, используемый для создания смеси клетки: гидрогель, составляет 6 мг / мл, а конечная концентрация составляет 2 мг / мл. В зависимости от количества устройств для инъекции, объем коллагенового раствора, который должен быть сделан, должен быть снова рассчитан.
    1. Храните все необходимые реагенты на льду внутри вытяжки биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген представляет собой термореагнитный гидрогель. Поэтому температура должна оставаться низкой, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
    2. Возьмите 75 мкл коллагена (8 мг/мл) и раздайте его в микроцентрифужную трубку на льду. Раствор коллагена очень вязкий, поэтому медленно аспирировать его пипеткой.
    3. Возьмите 13,85 мкл среды (т.е. RPMI + B27 + инсулин) и дозируют ее в той же пробирке.
    4. Затем берут 10 мкл фенола красного цвета, добавляют в смесь и повторно суспендировали.
    5. Наконец, возьмите 1,15 мкл 1N NaOH и добавьте к суспензии.
    6. Используя наконечник пипетки 200 мкл, повторно суспензию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый коллаген имеет кислый рН, что требует добавления NaOH для нейтрализации перед использованием его для инкапсуляции сердечных клеток. Фенол красный действует как показатель рН; поэтому добавьте это перед добавлением NaOH. В этот момент раствор коллагена будет желтым, обозначающим его кислотность. После добавления NaOH раствор должен превратиться из оранжевого в светло-розовый, что свидетельствует о его нейтрализации.
  5. Гидрогелевая смесь и клеточный препарат
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе выполняется инкапсуляция клеток в гидрогеле на основе коллагена. Клетки, как и все предшественники гидрогеля, должны быть помещены на лед во время следующих этапов.
    1. На этом этапе, если ХФ еще не были трипсинизированы, храните суспензию СМ в центрифуге 15 мл с открученной крышкой, чтобы обеспечить поток газа, в инкубаторе с 37 °C. Параллельно диссоциируют КС и собирают при плотности 75 х 106 ячеек/мл для загрузки устройства.
    2. Смешайте взвешенные СМ с КФ в соотношении 4:1. Возьмите аликвоту в 8 мкл КМ и добавьте в свежую центрифужную трубку на льду. Затем берут 2 мкл ХФ и добавляют к ячейке суспензию в трубке центрифуги.
    3. Повторно суспендируют клеточную суспензию, возьмите 5,6 мкл клеточной суспензии и поместите ее в свежую микроцентрифужную трубку.
    4. Возьмите 4 мкл коллагена, только что приготовленного на вышеуказанных этапах, и добавьте в смесь 4: 1 СМ: CF. Добавьте 2,4 мкл матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста (СКФ), сделав конечную плотность клеток 35 х10 6 клеток / мл для инъекции устройства. Пипетка смеси вверх и вниз, чтобы убедиться, что клеточная суспензия однородна.
  6. Вставка устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как смесь ячеек: гидрогель подготовлена, ее необходимо вставить в устройства.
    1. Возьмите автоклавные микрофлюидные устройства из печи с температурой 80 °C и установите их в шкаф биобезопасности не менее чем на 1 ч до введения клеточной суспензии, чтобы устройства остыли до комнатной температуры при сохранении стерильности.
    2. Поместите приборы в чашки Петри 60 х 15 мм, по 3-4 устройства на чашку. Наполните чашку Петри 150 x 15 мм тонким слоем DI H2O, чтобы вместить 3 из чаш Петри 60 x 15 мм. Этот шаг создает увлажненную среду, окружающую микрофлюидные устройства.
    3. Используйте новый наконечник и тщательно суспендирование смеси ячейки: гидрогеля путем пипетки суспензии, пока трубка остается на льду.
    4. Вставьте наконечник в инъекционный порт устройства и медленно и неуклонно вводят 3 мкл клеточной:гидрогелевой суспензии в область ткани на входе микрофлюидного устройства с помощью наконечника пипетки 20 мкл. Как только порт заполнен, остановите инъекцию и извлеките наконечник. Повторить для всех устройств или всей приготовленной гидрогелевой суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем ячейки: суспензия гидрогеля нагревается / охлаждается очень быстро, поэтому уместно держать суспензию на льду как можно дольше. При вставке пипетку раствора со льда и вставляют в устройства как можно быстрее, так как гидрогель может начать полимеризоваться в наконечнике пипетки. Важно создавать небольшие объемы клеточной: гидрогелевая суспензия за раз, поэтому, если вводится много устройств, суспензия ячейки: гидрогель должна быть сделана свежей для каждого набора из 4 устройств.
    5. Переверните устройства в чашки Петри пинцеем и поместите их в большую чашку Петри с водой. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C в течение 9 мин для полимеризации гидрогеля.
    6. Выньте устройства из инкубатора, переверните устройства в вертикальном положении и инкубируете при 37 °C в течение 9 мин до полной полимеризации гидрогеля.
    7. Вводят RPMI + B27 + инсулин во фланкинговые медиаканалы (~20 мкл на устройство). Поместите устройства обратно в инкубатор при 37 °C. Меняйте медиа в медиаканалах свежим RPMI + B27 + инсулин каждый день. Было продемонстрировано, что устройства культивированы от 14-21дня 20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого объема среды на чип, чтобы предотвратить испарение среды, важно поддерживать устройства в большой чашке Петри, заполненной DI H2O, которая служит увлажненной камерой. Кроме того, небольшие капли избытка RPMI + B27 + инсулина могут быть пипетированы на верхней части входов / выходов канала во время рутинных изменений среды.

4. Анализ тканей

  1. Визуализация в реальном времени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все живые изображения должны выполняться с помощью сценического инкубатора для поддержания 37 °C и 5% CO2.
    1. Поместите устройства в экологически контролируемый сценический инкубатор. Записывайте 30-с видео нескольких точек внутри каждого устройства с максимальной частотой кадров.
    2. Чтобы оценить сократимость тканей после извлечения сигналов биения, используйте дополнительный специально написанный код MATLAB для извлечения пиков(Дополнительный файл 2)для расчета вариабельности интервала между ударами.
    3. Измените жижи в устройствах в вытяжке клеточной культуры, а затем поместите обратно в инкубатор клеточной культуры.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Приготовить PBS-глицин: растворить глицин 100 мМ в PBS и добавить 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
    2. Подготовьте PBS-Tween-20: добавьте 0,05% Tween-20 в PBS и добавьте 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
    3. Подготовка буфера ПЧ: добавьте в PBS 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA и 0,05% Tween-20 и добавьте 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
    4. Приготовьте 10% козьей сыворотки: повторно суспендировать лиофилизированную козью сыворотку в 2 мл PBS, чтобы получить 100% козью сыворотку. Затем разбавьте 2 мл 18 мл PBS, чтобы получить 10% козьей сыворотки.
    5. Зафиксируйте образцы, добавив 4% параформальдегида (PFA) в тканевые каналы и инкубируя при 37 °C в течение 20 мин.
    6. Промыть клетки, добавив PBS-Глицин в тканевые каналы 2x в течение 10 мин инкубации при комнатной температуре.
    7. Промыть ячейки, добавив PBS -Tween-20 в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Пермеабилизируют клетки, добавляя буфер ПЧ в тканевые каналы в течение 30 мин при комнатной температуре.
    9. Блокируют клетки, добавляя 10% раствор козьей сыворотки в тканевые каналы в течение 1 ч при комнатной температуре.
    10. Разбавляют неконъюгированные первичные антитела в 10% козьей сыворотке при желаемых концентрациях (см. Дополнительный файл 3),добавляют в тканевые каналы и инкубируют образцы при 4 °C в течение ночи.
    11. На следующий день промывайте образцы, добавляя PBS-Tween-20 в тканевые каналы 3x в течение 20 минут каждый при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с шага 4.2.12 включительный, выполняйте все задачи в темноте, чтобы образцы были защищены от света.
    12. Разводят вторичные антитела в PBS-Tween-20 в нужных концентрациях, центрифугу при 10 000 х г в течение 10 мин для сбора любых осадков, затем добавляют в тканевые каналы.
    13. Через 30 мин-1 ч промыть образцы PBS-Tween-20 3x в течение 10 мин каждый при комнатной температуре.
    14. Добавьте анти-выцветающей или желаемую монтажную среду к тканевым каналам. Затем образцы могут быть визуалированы с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокального микроскопа, если желательно более высокое увеличение. Чтобы визуализировать всю 3D-ткань, изображения в разных z-плоскостях могут быть сложены и реконструированы для формирования репрезентативных 3D-изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для получения высокоочищеной популяции КМ из hiPSCs используется модифицированная версия, включающая комбинацию протокола дифференциацииЛиан 33 и этапов очистки Тохьямы34 (см. Фиг.1A для экспериментальной временной шкалы). HiPSCs должны быть колониео...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Формирование модели сердечной ткани человека in vitro с усиленными клеточными взаимодействиями и биомиметической 3D-структурой является обязательным для фундаментальных сердечно-сосудистых исследований и соответствующих клинических применений1. Этот описанный проток...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC), New Investigator Award (ADHS18-198872) и Flinn Foundation Award за предоставление источников финансирования для этого проекта. Линия hiPSC, SCVI20, была получена от Джозефа С. Ву, доктора медицинских наук, доктора философии в Стэнфордском сердечно-сосудистом институте, финансируемом NIH R24 HL117756. Линия hiPSC, IMR90-4, была получена из WiCell Research Institute55,56.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001can also be made in house
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

Ссылки

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147(2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033(2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29(2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397(2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105(2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883(2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741(2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195(2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810(2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809(2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657(2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133(2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены