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Resumen

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Resumen

La principal causa de muerte en todo el mundo persiste como la enfermedad cardiovascular (ECV). Sin embargo, modelar la complejidad fisiológica y biológica del músculo cardíaco, el miocardio, es notoriamente difícil de lograr in vitro. Principalmente, los obstáculos se encuentran en la necesidad de cardiomiocitos humanos (MC) que son adultos o exhiben fenotipos similares a los adultos y pueden replicar con éxito la complejidad celular del miocardio y la intrincada arquitectura 3D. Desafortunadamente, debido a las preocupaciones éticas y a la carencia del tejido cardiaco humano paciente-derivado primario disponible, combinado con la proliferación mínima de CMs, el abastecimiento de CMs humanos viables ha sido un paso limitador para la ingeniería cardiaca del tejido. Con este fin, la mayoría de las investigaciones han hecho la transición hacia la diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) como la fuente primaria de los MC humanos, lo que resulta en la amplia incorporación de hiPSC-CMs dentro de los ensayos in vitro para el modelado de tejido cardíaco.

Aquí en este trabajo, demostramos un protocolo para el desarrollo de un tejido cardíaco humano derivado de células madre maduras 3D dentro de un dispositivo microfluídico. Específicamente se explica y demostrar visualmente la producción de un modelo de tejido cardíaco anisotrópico in vitro en 3D en un chip de CMs derivados de hiPSC. Se describe principalmente un protocolo de purificación para seleccionar para CMs, el co-cultivo de células con una relación definida a través de la mezcla de CMs con CFs humanos (hCFs), y la suspensión de este co-cultivo dentro del hidrogel a base de colágeno. Además, demostrar la inyección de hidrogel cargado de células dentro de nuestro dispositivo microfluídico bien definido, incrustado con micropostes elípticos escalonados que sirven como topografía de la superficie para inducir un alto grado de alineación de las células circundantes y la matriz de hidrogel, imitando la arquitectura del miocardio nativo. Imaginamos que el modelo de tejido cardíaco anisotrópico en chip propuesto en 3D es adecuado para estudios de biología fundamental, modelado de enfermedades y, a través de su uso como herramienta de detección, pruebas farmacéuticas.

Introducción

Los enfoques de ingeniería de tejidos han sido ampliamente explorados, en los últimos años, para acompañar los hallazgos clínicos in vivo en la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades1,2. Se ha puesto un énfasis significativo particularmente en el modelado de tejido cardíaco in vitro debido a las dificultades inherentes en el abastecimiento de tejido cardíaco primario humano y la producción de sustitutos in vitro fisiológicamente relevantes, lo que limita la comprensión fundamental de los complejos mecanismos de las enfermedades cardiovasculares (ECV)1,3. Los modelos tradicionales a menudo han involucrado ensayos de cultivo de monocapa 2D. Sin embargo, la importancia de cultivar células cardíacas dentro de un entorno 3D para imitar tanto el paisaje nativo del miocardio como las interacciones celulares complejas se ha caracterizado ampliamente4,5. Además, la mayoría de los modelos producidos hasta ahora han incluido un monocultivo de MC diferenciados de las células madre. Sin embargo, el corazón se compone de múltiples tipos celulares6 dentro de una compleja arquitectura3D 7,lo que justifica la necesidad crítica de mejorar la complejidad de la composición tisular dentro de los modelos in vitro 3D para imitar mejor los constituyentes celulares del miocardio nativo.

Hasta la fecha, se han explorado muchos enfoques diferentes para producir modelos biomiméticos 3D del miocardio8. Estos enfoques van desde configuraciones experimentales que permiten el cálculo en tiempo real de la fuerza generada, desde monocultivo CMs sembrados en películas delgadas (consideradas películas delgadas musculares (MTFs))9,hasta co-cultivo de células cardíacas en matrices de hidrogel 3D suspendidas entre voladizos independientes (considerados tejidos cardíacos de ingeniería (EHTs))10. Otros enfoques se han centrado en la implementación de técnicas de micromoldeo para imitar la anisotropía miocárdica, desde monocultivo CMs en un hidrogel 3D suspendido entre microposts salientes en un parche tisular11,hasta monocultivo CMs sembrados entre microgrooves dentado12,13. Existen ventajas y desventajas inherentes a cada uno de estos métodos, por lo tanto, es pertinente utilizar la técnica que se alinee con la aplicación prevista y la cuestión biológica correspondiente.

La capacidad de aumentar la maduración de los MC derivados de células madre es esencial para el éxito de la ingeniería in vitro de adulto-como el tejido miocárdico y la traducción de los hallazgos posteriores a las interpretaciones clínicas. Con este fin, los métodos para madurar CMs han sido ampliamente explorados, tanto en 2D como en 3D14,15,16. Por ejemplo, la estimulación eléctrica incorporada en los EHTs, la alineación forzada de los MC con la topografía superficial, las señales de señalización, los factores de crecimiento del co-cultivo y/o las condiciones de hidrogel 3D, etc., conducen a un cambio a favor de la maduración de CM en al menos uno de los siguientes: morfología celular, manejo de calcio, estructura sarcórpica, expresión génica o fuerza contráctil.

De estos modelos, los enfoques que utilizan plataformas microfluídicas conservan ciertas ventajas en la naturaleza, como el control de gradientes, la entrada limitada de celdas y los reactivos mínimos necesarios. Además, muchas réplicas biológicas pueden ser generadas a la vez utilizando plataformas microfluídicas, sirviendo para diseccionar mejor el mecanismo biológico de interés y aumentar el tamaño de la muestra experimental en favor de la potencia estadística17,18,19. Además, el uso de la fotolitografía en el proceso de fabricación de dispositivos microfluídicos permite la creación de características precisas (por ejemplo, topografías) a nivel micro y nano, que sirven como señales mesoscópicas para mejorar la estructura celular circundante y la arquitectura de tejidos a nivel macro18,20,21, 22 para diferentes aplicaciones en regeneración de tejidos y modelado de enfermedades.

Demostramos previamente el desarrollo de un nuevo modelo de tejido cardíaco 3D en chip que incorpora topografía superficial, en forma de microposts elípticos innatos, para alinear las células cardíacas co-cultivadas encapsuladas en hidrogel en un tejido anisotrópico interconectado20. Después de 14 días de cultivo, los tejidos formados dentro del dispositivo microfluídico son más maduros en su fenotipo, perfil de expresión génica, características de manejo de calcio y respuesta farmacéutica en comparación con los controles isótropos monocapa y 3D23. El protocolo descrito en este documento describe el método para crear este co-cultivado en 3D, alineado (es decir, anisotrópico) tejido cardíaco humano dentro del dispositivo microfluídico utilizando CMs derivados de hiPSC. Específicamente, explicamos los métodos para diferenciar y purificar hiPSCs hacia CMs, la suplementación de hCFs con CMs para producir una población establecida de co-cultivo, la inserción de la población celular encapsulada dentro del hidrogel de colágeno en los dispositivos microfluídicos, y el análisis posterior de los tejidos construidos 3D a través de ensayos contráctiles e inmunofluorescentes. Los micro-tejidos de ingeniería 3D resultantes son adecuados para diversas aplicaciones, incluidos estudios de biología fundamental, modelado de ECV y pruebas farmacéuticas.

Protocolo

Realice toda la manipulación celular y la preparación de reactivos dentro de un gabinete de bioseguridad. Asegúrese de que todas las superficies, materiales y equipos que entren en contacto con las células sean estériles (es decir, rocíe con etanol al 70%). Las células deben cultivarse en una incubadora humidificada de 37 °C, 5% de CO2. Todo el cultivo y diferenciación hiPSC se realiza en placas de 6 pocillos.

1. Creación de dispositivos microfluídicos (duración aproximada: 1 semana)

  1. fotolitografía
    NOTA: La máscara, diseñada utilizando el archivo CAD (proporcionado como archivo suplementario 1), contiene el diseño del canal microfluídico. Imprima el diseño en una máscara transparente. Luego, realice una fotolitografía estándar con el fotorresister negativo SU8 2075 en una oblea de silicio de 4 pulgadas dentro de una sala limpia.
    1. Limpie una oblea de silicio con alcohol isopropílico (IPA) y seque con nitrógeno. Hornear a 200 °C durante 5 min para deshidratación.
      NOTA: Maneje la oblea con pinzas de oblea.
    2. Coloque la oblea en el recubridor. Deposite 3-4 mL de SU8 en el centro de la oblea, luego gire para formar una capa de 200 μm (es decir, rampa de 15 s a 500 rpm, giro durante 10 s, rampa de 5 s a 1,200 rpm y giro durante 30 s, luego desanpine durante 15 s hasta que se detenga).
    3. Retire la oblea y hornee suavemente durante 7 min a 65 °C, luego 45 min a 95 °C.
    4. Mueva la oblea a un alineador de máscara y coloque la máscara transparente en el soporte de la máscara con un filtro UV. Exponer la oblea a 2 ciclos de 230mJ/cm2,con 30 s de retardo, para una exposición total de 460 mJ/cm2.
    5. Realice un horneado post-exposición en la oblea expuesta en un horno de 50 °C durante la noche.
    6. Apague el horno a la mañana siguiente, y después de que la oblea se haya enfriado a temperatura ambiente, sumérjalo en SU8-developer. Retire la oblea del desarrollador cada 5 minutos y lávela con IPA, luego colótela de nuevo en el desarrollador.
    7. Después de alrededor de 20 minutos, o cuando el IPA se despeje, seque la oblea con nitrógeno del aire y hornee duro en un horno a 150 ° C; tan pronto como el horno alcance los 150 °C, apague pero no abra. Deje la oblea en el horno hasta que haya alcanzado la temperatura ambiente, luego retire la oblea.
    8. Confirme la altura de SU8 con un perfilómetro y las características ópticas con un microscopio de luz. Una vez confirmado, cinta adhesiva dentro de una placa de Petri de plástico de 150 mm.
  2. Litografía blanda
    NOTA: La oblea, pegada a la placa de Petri, necesita ser silanizada para evitar la adherencia del PDMS a las características de SU8.
    1. Invertir la oblea (roscada en una placa de Petri de plástico) sobre una placa de Petri de vidrio del mismo tamaño que contenga 0,4 mL de metiltriclorosilano (MTCS) y exponer la oblea a los vapores durante 4 min. Gire la oblea en posición vertical y coloque la tapa en la placa de Petri.
    2. Mezcle 30 g de base de elastómero de silicona con el agente de curado en una proporción de 10:1. Tome la tapa de la placa de Petri y vierta el polidimetilsiloxano (PDMS) en la oblea, luego desgasificar dentro de un desecador.
    3. Una vez que todas las burbujas hayan desaparecido, coloque la oblea a 80 °C durante 1,5 h para curar el PDMS.
    4. Desprenda cuidadosamente el PDMS y las entradas y salidas de punzón para los puertos de tejido y los canales de medios con un punzón de biopsia de 1 mm y 1,5 mm, respectivamente.
    5. Limpie los canales PDMS con cinta adhesiva para eliminar el polvo. A continuación, remoje los cubrebocas (18 x 18 mm, No.1) en etanol al 70% durante al menos 15 min. Luego, séquelos con toallitas de tejido.
    6. Sujete tanto los cubrebocas como los canales PDMS (lado de la característica expuesto) al plasma (en alto) durante 1 minuto, luego se unen rápidamente y se colocan en un horno de 80 ° C durante la noche para asegurar la unión.
      NOTA: Durante la unión, es esencial aplicar una presión suave en los bordes de los canales PDMS para asegurar un buen sellado entre el PDMS y el vidrio, evitando al mismo tiempo el canal en sí para evitar el colapso del canal.
  3. Preparación del dispositivo
    1. Sumerja los dispositivos PDMS unidos en agua desionizada (DI H2O) y autoclave con el ciclo líquido. A continuación, aspire el líquido de los dispositivos y autoclave de nuevo con el ciclo de gravedad. Luego, deshidrate los dispositivos esterilizados durante la noche a 80 °C.

2. Cultivo de células madre (duración aproximada: 1-2 meses)

  1. Cultura y mantenimiento de hiPSC
    NOTA: Los hiPSCs necesitan ser cultivados durante tres pasajes consecutivos después de la descongelación in vitro antes de la criopreservación o diferenciación. Los hiPSCs se cultivan en medio E8 o mTeSR1, dependiendo de la línea celular, en las placas recubiertas de matriz de membrana basal24.
    1. Para recubrir las placas con matriz de membrana basal de calidad hESC, descongelar una alícuota del medio de la matriz (volumen dependiente del lote, generalmente 200-300 μL; almacenado a -80 °C) agregándolo a 25 mL de DMEM/F-12K sobre hielo. Dispense 1 mL de esta suspensión en cada pozo de una placa de 6 pozos. Deje el plato en la incubadora a 37 °C durante al menos 1 h.
    2. Al descongelarse, modifique el soporte E8 para el cultivo hiPSC agregando 5 μM de Y-2763225 (E8+RI). Utilice este medio durante 24 h después, a continuación, cambie el medio a E8 fresco.
      Nota : para los cambios de medios de rutina, medios E8 sin modificar se utiliza para la referencia cultural hiPSC. Para el mantenimiento regular, los medios E8 deben cambiarse todos los días, aproximadamente 24 h después del cambio de medio anterior.
    3. Pase las células en el día 3 o el día 4, aspire los medios y luego lave cada pozo con 1 mL de 1x solución tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
      NOTA: Asegúrese de que las células son alrededor de 70% confluente. No dejes que crezcan más allá del 70% de confluencia.
    4. Aspirar el DPBS, luego añadir 1 mL de 0,5 mM de EDTA a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante 6-7 min.
    5. Aspirar cuidadosamente EDTA, añadir 1 mL de E8 +RI en cada pozo y explosión contra la superficie con una pipeta de 1 mL (~ 5-10 veces para recoger todas las células). Recoja la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 15 mL.
    6. Cuente la suspensión y el paso de la célula en la densidad deseada de la célula (es decir, ~200 K por pozo) en E8+RI.
    7. Cambie el medio a E8 (sin RI) 24 h después. No deje las células con RI por más de 24 h.
      NOTA: E8 no debe calentarse a 37 °C. Siempre déjelo a temperatura ambiente para calentarlo antes del cultivo celular.
  2. Diferenciación dirigida cardiomiocitos (CM)
    NOTA: Es importante tener en cuenta la existencia de heterogeneidad entre las diferentes líneas de las hiPSCs26,27,por lo que los siguientes pasos pueden necesitar ser optimizados para cada línea celular. Siga los pasos a continuación para la diferenciación de CM.
    1. Preparar RPMI + B27 - insulina añadiendo 10 mL de B27 menos insulina y 5 mL de penicilina/estreptomicina (pluma/estreptomicina) a 500 mL de RPMI 1640.
    2. Preparar RPMI + B27 + insulina añadiendo 10 mL de B27 y 5 mL de pluma/estreptococo a 500 mL de RPMI 1640.
    3. Preparar RPMI menos glucosa + B27 + insulina añadiendo 10 mL de B27, 5 mL de pluma/estreptococo y 4 mM de lactato sódico a 500 mL de RPMI 1640 sin glucosa.
    4. Una vez que los hiPSCs alcancen una confluencia del 85%, comience la diferenciación (Día 0) reemplazando el medio antiguo con 4 mL del RPMI + B27 - medio de insulina que contiene 10 μM CHIR99021 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos (es decir, agregue 25 μL de 10 mM CHIR99021 en 25 mL de RPMI + B27 - insulina y luego agregue inmediatamente 4 mL por pocillo).
      NOTA: CHIR99021 es un inhibidor de GSK y conduce a la activación de Wnt. La concentración óptima de CHIR99021 y la confluencia inicial varía para cada línea celular28. Compruebe siempre un gradiente de concentración de 6-12 μM CHIR99021 y una serie de densidades de siembra antes del experimento real para determinar las condiciones óptimas para iniciar la diferenciación.
    5. Exactamente 24 h más tarde (Día 1), aspirar el medio y reemplazar con 5 mL de RPMI preguerra + B27 - insulina a cada pozo.
    6. Exactamente 72 h después de la adición de CHIR99021 (Día 3), recoja 2.5 mL del medio gastado de cada pozo de la placa de 6 pozos, totalizar 15 mL del medio gastado en un tubo.
    7. A esto, agregue 15 mL de RPMI fresco + B27 - medio de insulina. Añadir IWP2 a una concentración de 5 μM en el tubo medio combinado (es decir, 1 μL de IWP2 a 5 mM por 1 mL de medio combinado o 30 μL de IWP2 en un total de medios de 30 mL).
    8. Retire ~ 1.5 mL del medio restante por pozo de la placa para que quede 1 mL del medio. Gire la placa vigorosamente para asegurar la eliminación adecuada de los desechos celulares. Luego, aspire el resto del medio viejo y agregue 5 mL del medio combinado que contiene IWP2 por pozo de la placa.
      NOTA: La adición de IWP2 a las células conduce a la inhibición de Wnt.
    9. El día 5, aspire el medio de cada pozo y reemplácelo con 5 mL de RPMI preguerra + B27 - insulina.
    10. Maduración CM: El día 7, día 9 y día 11, aspirar el medio de cada pozo y reemplazarlo con 5 mL de RPMI precalculado + B27 + insulina. El golpe espontáneo debe ser observado alrededor de estos días.
    11. Purificación de CM: En el día 13 y el día 16, comience la inanición de glucosa aspirando el medio de cada pozo, lavando cada pozo con 1 mL de 1x DPBS, y luego agregando 5 mL de RPMI precalentado menos glucosa + B27 + insulina, suplementada con lactato de sodio de 4 mM.
    12. El día 19, aspire el medio gastado y reemplácelo con 5 mL de RPMI precalculado + B27 + insulina a cada pozo para permitir la recuperación celular después de la purificación.
    13. El día 21, replate las células, siguiendo el protocolo de disociación cm descrito a continuación (paso 3.3). Trate de platear 1.5-2 x 106 células por pozo en una placa de 6 pozos. Por ejemplo, si se trata de una diferenciación altamente eficiente, generalmente es bueno expandir los 6 pozos en 9 pozos.
    14. A partir del día 21, aspire el medio de cada pozo y reemplácelo con 4 mL de RPMI + B27 + insulina cada 2-3 días.
      NOTA: Los hiPSC-CMs están listos para uso experimental después del Día 23.

3. Creación de tejido cardíaco 3D dentro del dispositivo microfluídico: (Duración aproximada: 2-3 h)

  1. Cultura hCF
    1. Cultivo de fibroblastos cardíacos ventriculares humanos (hCFs; obtenidos comercialmente de Lonza) en matraces T75 (a 250K células por matraz) en Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Cambiar los medios de comunicación cada dos días, y el paso cuando en 70% confluente. Utilice los hCFs antes del paso 10, ya que pueden comenzar a diferenciarse de miofibroblastos en pasajes altos29.
  2. disociación de hCF
    1. Para disociar los hCFs, primero saque el matraz de la incubadora. Coloque el matraz dentro del gabinete de bioseguridad y comience a aspirar el medio gastado del matraz. A continuación, lave el matraz T75 con 3 mL de 1x DPBS. Cierre la tapa y gire el matraz.
    2. Aspirar el DPBS. Tomar 3 mL de 1x Tripsina-EDTA precalcinada (0.05%) y añadirlo al matraz. Incline el matraz y gire para recubrir la parte inferior. Déjelo en una incubadora de 37 °C durante 4-6 min, revisando el matraz bajo un microscopio para asegurarse de que las células se están separando, como se evidencia a través de la forma de la célula redonda y las células flotantes. Si no es así, vuelva a colocar el matraz en la incubadora durante otro minuto.
    3. Neutralice la acción de la tripsina añadiendo 3 ml de MGF3 preguerra al matraz. A continuación, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo contra la parte inferior del matraz para desalojar los CF.
    4. Recoja la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Tome 10 μL de la suspensión celular y dispense en un hemocitómetro para contar las células con un microscopio.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet celular.
    6. Resuspend el pellet en FGM3 fresco, para hacer un deseado 75 x 106 células/mL. Pase una porción (250K células por matraz T75) o siga el siguiente protocolo para generar tejido cardíaco 3D.
  3. Disociación de CM
    NOTA: Después de la diferenciación y purificación, prepare los MC para su uso en la inyección en dispositivos microfluídicos.
    1. Saque el plato de MC de la incubadora y aspire el medio. Luego lave los pozos con 1 mL de 1x DPBS por pozo de una placa de 6 pozos. Tomar 6 mL de DPBS y pipeta 1 mL por pozo.
    2. Aspirar el DPBS teniendo cuidado de no molestar a las células unidas a la placa. Pipetee 6 mL de solución de desprendimiento de células calientes (por ejemplo, TrypLE express) y agregue 1 mL por pozo. Incubar las células en una incubadora de 37 °C durante 10 min.
    3. Neutralizar la enzima con un volumen igual de RPMI + B27+ insulina (es decir, 1 mL por pocillo) y disociar mecánicamente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra el vaso de cultivo con una pipeta de 1 mL.
    4. Recoja los MC en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrífuga a 300 x g durante 3 min.
    5. Aspirar el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en 5 mL de RPMI + B27 + insulina. Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL para asegurar una mezcla adecuada. Tome 10 μL de la suspensión celular y dispense en un hemocitómetro para determinar el número total de células.
    6. Centrifugar las células de nuevo a 300 x g durante 3 min (para asegurar la eliminación completa de TrypLE), y aspirar el sobrenadante. Luego, agregue un volumen apropiado de RPMI + B27 + insulina para lograr 75 x 106 células / mL.
      NOTA: Si la diferenciación/selección cardiaca no da lugar a un alto CM% (es decir, >80%), según lo evidenciado con immunostaining o cytometry de flujo para las proteínas CM-específicas como cTnT, no considere las células como convenientes para la formación del tejido. El proceso de diferenciación debe optimizarse cuando esto sucede a través del ajuste de las concentraciones de CHIR99021 y la densidad inicial de partida. Si la purificación de CM necesita mejoras, se pueden utilizar otros métodos, como la clasificación para MC con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)30,31,32.
  4. Preparación de colágeno
    NOTA: Prepare colágeno a partir de la alta concentración de cepas de colágeno (que van desde 8-11 mg/mL). El colágeno utilizado para crear la mezcla de célula:hidrogel está en 6 mg/mL, y la concentración final es de 2 mg/mL. Dependiendo del número de dispositivos a inyectar, el volumen de solución de colágeno a hacer debe volver a calcularse.
    1. Mantenga todos los reactivos requeridos en el hielo dentro de una campana de bioseguridad.
      NOTA: El colágeno es un hidrogel termoresponsivo. Por lo tanto, la temperatura debe permanecer baja para evitar la polimerización prematura.
    2. Tomar 75 μL de colágeno común (8 mg/mL) y dispensarlo en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. La solución de colágeno es muy viscosa, así que aspirada lentamente con una pipeta.
    3. Tome 13,85 μL de medio (es decir, RPMI + B27 + insulina) y dispense en el mismo tubo.
    4. A continuación, tomar 10 μL de rojo fenol y añadir a la mezcla y resuspend.
    5. Por último, tomar 1.15 μL de 1N NaOH y añadir a la suspensión.
    6. Usando una punta de pipeta de 200 μL, resuspend la suspensión.
      NOTA: El colágeno común tiene un pH ácido, lo que requiere la adición de NaOH para neutralizar antes de usarlo para encapsular las células cardíacas. El rojo fenol actúa como un indicador de pH; por lo tanto, agregue esto antes de la adición de NaOH. En este punto, la solución de colágeno será amarilla, denotando su acidez. Después de la adición de NaOH, la solución debe volverse naranja a rosa claro, lo que indica su neutralización.
  5. Mezcla de hidrogel y preparación celular
    NOTA: En este paso, se realiza la encapsulación de las células dentro del hidrogel a base de colágeno. Las células, así como todos los precursores de hidrogel, deben colocarse en el hielo durante los próximos pasos.
    1. En este punto, si los CF aún no han sido tripsinizados, guarde la suspensión CM en un tubo centrífugo de 15 mL, con la tapa desenroscado para permitir el flujo de gas, dentro de una incubadora de 37 °C. En paralelo, disociar los CF y recoger a una densidad de 75 x 106 celdas/mL para la carga del dispositivo.
    2. Mezcle los MC suspendidos con los CF en una proporción de 4:1. Tome una alícuota de 8 μL de MC y añádala a un tubo de centrífuga fresco sobre hielo. Luego tome 2 μL de CF y agréguela a la suspensión celular en el tubo de la centrífuga.
    3. Resuspend la suspensión de la célula, agarre 5.6 μL de la suspensión de la célula, y colóquela en un tubo fresco de la microcentrífuga.
    4. Tome 4 μL del colágeno recién preparado en los pasos anteriores y añádalo a una mezcla de 4:1 CM:CF. Añadir 2,4 μL de factor de crecimiento reducido (TFG) matriz de membrana basal, haciendo que la densidad celular final sea de 35 x 106 células/mL para la inyección del dispositivo. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la suspensión de la célula es homogénea.
  6. Inserción de dispositivos
    NOTA: Una vez que la mezcla de célula:hidrogel está preparada, debe insertarse en los dispositivos.
    1. Saque los dispositivos microfluídicos en autoclave del horno de 80 °C y colóquelos en el gabinete de bioseguridad durante al menos 1 h antes de la inserción de la suspensión celular para permitir que los dispositivos se enfríen a temperatura ambiente mientras se mantiene la esterilidad.
    2. Coloque los dispositivos en placas de Petri de 60 x 15 mm, a 3-4 dispositivos por plato. Llene una placa de Petri de 150 x 15 mm con una capa delgada DI H2O para contener 3 de las placas de Petri de 60 x 15 mm. Este paso crea un ambiente humidificado que rodea los dispositivos microfluídicos.
    3. Utilice una nueva punta y resuspend la célula: mezcla de hidrogel a fondo pipeteando la suspensión mientras el tubo permanece en el hielo.
    4. Inserte la punta en el puerto de inyección del dispositivo e inyecte lenta y constantemente 3 μL de la célula: suspensión de hidrogel en la entrada de la región tisular de un dispositivo microfluídico utilizando una punta de pipeta de 20 μL. Una vez que el puerto esté lleno, detenga la inyección y retire la punta. Repita para todos los dispositivos, o la totalidad de la suspensión de hidrogel preparada.
      NOTA: El pequeño volumen de la célula: la suspensión de hidrogel se calienta / se enfría muy rápidamente, por lo que es pertinente mantener la suspensión en el hielo durante el mayor tiempo posible. Al insertar, pipetee la solución del hielo e insértela en los dispositivos lo más rápido posible, ya que el hidrogel puede comenzar a polimerizarse en la punta de la pipeta. Es importante crear pequeños volúmenes de la célula: suspensión de hidrogel a la vez, por lo que si se van a inyectar muchos dispositivos, la celda: suspensión de hidrogel tendrá que hacerse fresca para cada conjunto de 4 dispositivos.
    5. Voltee los dispositivos dentro de sus placas de Petri con pinzas y colóquelos dentro de la gran placa de Petri con agua. Incubar en una incubadora de 37 °C durante 9 min para la polimerización por hidrogel.
    6. Saque los dispositivos de la incubadora, voltee los dispositivos en posición vertical e incube a 37 °C durante 9 minutos para completar la polimerización por hidrogel.
    7. Inyecte RPMI + B27 + insulina en los canales de medios de flanqueo (~ 20 μL por dispositivo). Vuelva a colocar los dispositivos en la incubadora a 37 °C. Cambie los medios dentro de los canales de medios con RPMI + B27 + insulina fresca todos los días. Se ha demostrado que los dispositivos se cultivan de 14 a 21 días20.
      NOTA: Debido al pequeño volumen de medios por chip, para evitar la evaporación de los medios, es importante mantener los dispositivos dentro de una gran placa de Petri llena de DI H2O, que sirve como cámara humidificada. Además, pequeñas gotitas de exceso de RPMI + B27 + insulina se pueden pipetear en la parte superior de las entradas / salidas del canal durante los cambios de medios de rutina.

4. Análisis tisular

  1. Imágenes en vivo
    NOTA: Todas las imágenes en vivo deben realizarse con una incubadora de estadios para mantener 37 °C y un 5% deCO2.
    1. Coloque los dispositivos en una incubadora de etapa controlada ambientalmente. Grabe videos de 30 s de múltiples puntos dentro de cada dispositivo a la velocidad de fotogramas máxima.
    2. Para evaluar la contractilidad del tejido después de extraer las señales de batido, utilice el código MATLAB escrito a medida suplementario para extraer picos (Archivo suplementario 2) para calcular la variabilidad del intervalo entre latidos.
    3. Cambie los medios en los dispositivos en la campana del cultivo celular, luego vuelva a colocarlo en la incubadora de cultivos celulares.
  2. Tinción inmunofluorescente
    1. Preparar PBS-Glicina: Disolver 100 mM de glicina en PBS y añadir 0.02% NaN3 para almacenamiento a largo plazo. Ajuste el pH a 7.4.
    2. Prepare PBS-Tween-20: Agregue 0.05% Tween-20 a PBS y agregue 0.02% NaN3 para almacenamiento a largo plazo. Ajuste el pH a 7.4.
    3. Prepare el búfer IF: Agregue 0.2% Triton X-100, 0.1% BSA y 0.05% Tween-20 a PBS, y agregue 0.02% NaN3 para almacenamiento a largo plazo. Ajuste el pH a 7.4.
    4. Preparar suero de cabra al 10%: Resuspend el suero de cabra liofilizado en 2 mL de PBS para hacer suero 100% de cabra. A continuación, diluir los 2 mL con 18 mL de PBS para hacer un 10% de suero de cabra.
    5. Fije las muestras añadiendo paraformadehído al 4% (PFA) a los canales de tejido e incubando a 37 °C durante 20 min.
    6. Lave las células añadiendo PBS-Glicina a los canales de tejido 2x durante 10 min de incubación a temperatura ambiente.
    7. Lave las células añadiendo PBS -Tween-20 durante 10 min a temperatura ambiente.
    8. Permeabilizar las células mediante la adición de tampón IF a los canales de tejido durante 30 min a temperatura ambiente.
    9. Bloquee las células agregando una solución de suero de cabra al 10% a los canales de tejido durante 1 h a temperatura ambiente.
    10. Diluir los anticuerpos primarios no conjugados en suero de cabra al 10% a las concentraciones deseadas (consulte el Archivo Suplementario 3),añadir a los canales tisulares e incubar las muestras a 4 °C durante la noche.
    11. Al día siguiente, lave las muestras agregando PBS-Tween-20 a los canales de tejido 3x durante 20 minutos cada uno a temperatura ambiente.
      NOTA: A partir del paso 4.2.12, realice todas las tareas en la oscuridad, para que las muestras estén protegidas de la luz.
    12. Diluya los anticuerpos secundarios en PBS-Tween-20 a las concentraciones deseadas, centrífuga a 10,000 x g durante 10 min para recolectar cualquier precipitado, luego agregue a los canales de tejido.
    13. Después de 30 min-1 h, lave las muestras con PBS-Tween-20 3x durante 10 min cada una a temperatura ambiente.
    14. Agregue anti-desvanecimiento o el medio de montaje deseado a los canales de tejido. Luego, las muestras se pueden foto fotor usando microscopía de fluorescencia o con un microscopio confocal, si se desea un aumento más alto. Para visualizar todo el tejido 3D, las imágenes en diferentes planos z se pueden apilar y reconstruir para formar imágenes 3D representativas.

Resultados

Para obtener una población altamente purificada de CMs a partir de hiPSCs, se utiliza una versión modificada que implica una combinación del protocolo de diferenciaciónLian 33 y los pasos de purificación34 de Tohyama (consulte la Figura 1A para la línea de tiempo experimental). Los hiPSCs necesitan ser colonia-como, ~85% confluente, y uniformemente repartidos a través del pozo de la cultura 3-4 días después del paso, en el inicio de la...

Discusión

La formación de un modelo de tejido cardíaco humano in vitro con interacciones célula-célula mejoradas y estructura 3D biomimética es imprescindible para la investigación cardiovascular básica y las correspondientes aplicaciones clínicas1. Este protocolo contorneado explica el desarrollo del tejido cardiaco anisotrópico humano 3D dentro de un dispositivo microfluidic, usando el co-cultivo de CMs célula-derivados del vástago con los CF conectivos encapsulados dentro de un hidrog...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al NSF CAREER Award #1653193, arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872), y al Flinn Foundation Award por proporcionar fuentes de financiamiento para este proyecto. La línea hiPSC, SCVI20, se obtuvo de Joseph C. Wu, MD, PhD en el Stanford Cardiovascular Institute financiado por NIH R24 HL117756. La línea hiPSC, IMR90-4, se obtuvo de WiCell Research Institute55,56.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001can also be made in house
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

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