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Résumé

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Résumé

La principale cause de décès dans le monde persiste sous forme de maladies cardiovasculaires (MCV). Cependant, la modélisation de la complexité physiologique et biologique du muscle cardiaque, le myocarde, est notoirement difficile à accomplir in vitro. Principalement, les obstacles résident dans le besoin de cardiomyocytes humains (MC) qui sont adultes ou présentent des phénotypes de type adulte et peuvent reproduire avec succès la complexité cellulaire du myocarde et l’architecture 3D complexe. Malheureusement, en raison de préoccupations éthiques et du manque de tissu cardiaque humain primaire dérivé du patient disponible, combinés à la prolifération minimale des MC, l’approvisionnement en MC humaines viables a été une étape limitative pour l’ingénierie des tissus cardiaques. À cette fin, la plupart des recherches ont fait la transition vers la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSTH) comme source principale de MC humaines, ce qui a entraîné l’incorporation à grande échelle de HIPSC-MC dans les essais in vitro pour la modélisation des tissus cardiaques.

Ici, dans ce travail, nous démontrons un protocole pour le développement d’un tissu cardiaque humain dérivé de cellules souches matures 3D dans un dispositif microfluidique. Nous expliquons spécifiquement et démontrons visuellement la production d’un modèle 3D anisotrope de tissu cardiaque sur puce anisotrope à partir de MC dérivés de hiPSC. Nous décrivons principalement un protocole de purification pour sélectionner pour les MC, la co-culture de cellules avec un rapport défini par l’intermédiaire du mélange des MC avec des FC humains (hFC), et la suspension de cette co-culture dans l’hydrogel à base de collagène. Nous démontrons en outre l’injection de l’hydrogel chargé de cellules dans notre dispositif microfluidique bien défini, intégré avec des micropostes elliptiques décalés qui servent de topographie de surface pour induire un degré élevé d’alignement des cellules environnantes et de la matrice d’hydrogel, imitant l’architecture du myocarde natif. Nous envisageons que le modèle de tissu sur puce cardiaque anisotrope 3D proposé convient aux études de biologie fondamentale, à la modélisation des maladies et, grâce à son utilisation comme outil de dépistage, aux tests pharmaceutiques.

Introduction

Les approches d’ingénierie tissulaire ont été largement explorées, ces dernières années, pour accompagner les résultats cliniques in vivo en médecine régénérative et en modélisation des maladies1,2. Un accent significatif a été particulièrement mis sur la modélisation in vitro des tissus cardiaques en raison des difficultés inhérentes à l’approvisionnement en tissu cardiaque primaire humain et à la production de substituts in vitro physiologiquement pertinents, limitant la compréhension fondamentale des mécanismes complexes des maladies cardiovasculaires (MCV)1,3. Les modèles traditionnels ont souvent impliqué des tests de culture monocouche 2D. Cependant, l’importance de la culture de cellules cardiaques dans un environnement 3D pour imiter à la fois le paysage natif du myocarde et les interactions cellulaires complexes a été largement caractérisée4,5. De plus, la plupart des modèles produits jusqu’à présent ont inclus une monoculture de MC différenciées des cellules souches. Cependant, le cœur est composé de plusieurs types de cellules6 au sein d’une architecture 3D complexe7,justifiant le besoin critique d’améliorer la complexité de la composition tissulaire au sein des modèles in vitro 3D pour mieux imiter les constituants cellulaires du myocarde natif.

À ce jour, de nombreuses approches différentes ont été explorées pour produire des modèles 3D biomimétiques du myocarde8. Ces approches vont des configurations expérimentales qui permettent le calcul en temps réel de la force générée, des MC mono-culture ensemencés sur des films minces (réputés films minces musculaires (MTF))9,à la co-culture de cellules cardiaques dans des matrices d’hydrogel 3D suspendues parmi des cantilevers autoportants (tissus cardiaques réputés modifiés (EHTs))10. D’autres approches se sont concentrées sur la mise en œuvre de techniques de micromoldage pour imiter l’anisotropie myocardique, des MC mono-culture dans un hydrogel 3D suspendu parmi des micropostes saillants dans une parcelle tissulaire11,aux MC mono-culture ensemencées parmi des microgrooves dentelés12,13. Il y a des avantages et des inconvénients inhérents à chacune de ces méthodes, par conséquent, il est pertinent d’utiliser la technique qui s’aligne sur l’application prévue et la question biologique correspondante.

La capacité d’améliorer la maturation des MC dérivés des cellules souches est essentielle pour l’ingénierie in vitro réussie du tissu myocardique de type adulte et la traduction des résultats suivants en interprétations cliniques. À cette fin, les méthodes de maturation des MC ont été largement explorées, tant en 2D qu’en 3D14,15,16. Par exemple, la stimulation électrique incorporée dans les EHTs, l’alignement forcé des MC avec la topographie de surface, les signaux, les facteurs de croissance de la co-culture et/ou les conditions d’hydrogel 3D, etc., conduisent tous à un changement en faveur de la maturation cm dans au moins l’un des éléments suivants: morphologie cellulaire, manipulation du calcium, structure sarcomérique, expression génique ou force contractile.

Parmi ces modèles, les approches qui utilisent des plateformes microfluidiques conservent certains avantages dans la nature, tels que le contrôle des gradients, l’entrée limitée des cellules et les réactifs minimaux nécessaires. En outre, de nombreuses répétitions biologiques peuvent être générées à la fois à l’aide de plates-formes microfluidiques, servant à mieux disséquer le mécanisme biologique d’intérêt et à augmenter la taille expérimentale de l’échantillon en faveur de la puissance statistique17,18,19. De plus, l’utilisation de la photolithographie dans le processus de fabrication de dispositifs microfluidiques permet la création de caractéristiques précises (p. ex., topographies) aux niveaux micro et nanométrique, qui servent de repères mésoscopiques pour améliorer la structure cellulaire environnante et l’architecture tissulaire au niveau macro18,20,21, 22 pour différentes applications dans la régénération tissulaire et la modélisation des maladies.

Nous avons précédemment démontré le développement d’un nouveau modèle 3D de tissu cardiaque sur puce qui intègre la topographie de surface, sous la forme de micropostes elliptiques innés, pour aligner les cellules cardiaques co-cultivées encapsulées par hydrogel dans un tissu anisotrope interconnecté20. Après 14 jours de culture, les tissus formés dans le dispositif microfluidique sont plus matures dans leur phénotype, leur profil d’expression génique, leurs caractéristiques de manipulation du calcium et leur réponse pharmaceutique par rapport aux contrôles monocouches et isotropes 3D23. Le protocole décrit ici décrit la méthode de création de ce tissu cardiaque humain co-cultivé et aligné (c.-à-d. anisotrope) 3D dans le dispositif microfluidique utilisant des MC dérivés de hiPSC. Plus précisément, nous expliquons les méthodes pour différencier et purifier les HIPSCs vers les MC, la supplémentation des hCF avec des MC pour produire une population établie de co-culture, l’insertion de la population cellulaire encapsulée dans l’hydrogel de collagène dans les dispositifs microfluidiques, et l’analyse ultérieure des tissus construits en 3D par des essais contractiles et immunofluorescentscents. Les micro-tissus 3D qui en résultent conviennent à diverses applications, y compris les études de biologie fondamentale, la modélisation CVD et les tests pharmaceutiques.

Protocole

Effectuer toute la manipulation des cellules et la préparation des réactifs dans une armoire de biosécurité. S’assurer que toutes les surfaces, tous les matériaux et tous les équipements qui entrent en contact avec les cellules sont stériles (c.-à-d. pulvériser de l’éthanol à 70 %). Les cellules doivent être cultivées dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % deCO2. Toute la culture et la différenciation hiPSC sont effectuées dans des plaques à 6 puits.

1. Création d’un dispositif microfluidique (durée approximative : 1 semaine)

  1. photolithographie
    REMARQUE: Le masque, conçu à l’aide du fichier CAO (fourni en tant que fichier supplémentaire 1), contient la conception du canal microfluidique. Imprimez le dessin sur un masque transparent. Ensuite, effectuez une photolithographie standard avec la photorésine négative SU8 2075 sur une plaquette de silicium de 4 pouces dans une salle blanche.
    1. Nettoyez une plaquette de silicium avec de l’alcool isopropylique (IPA) et séchez avec de l’azote. Cuire à 200 °C pendant 5 min pour la déshydratation.
      REMARQUE: Manipulez la plaquette avec une pince à épiler.
    2. Placez la plaquette dans le spin-coater. Déposez 3 à 4 mL de SU8 au centre de la plaquette, puis tournez pour former une couche de 200 μm (c’est-à-dire montez de 15 s à 500 tr / min, tournez pendant 10 s, montez de 5 s à 1 200 tr / min et tournez pendant 30 s, puis descendez pendant 15 s jusqu’à ce qu’il soit arrêté).
    3. Retirer la plaquette et cuire au four doux pendant 7 min à 65 °C, puis 45 min à 95 °C.
    4. Déplacez la plaquette sur un aligneur de masque et placez le masque transparent dans le porte-masque avec un filtre UV. Exposer la plaquette à 2 cycles de 230 mJ/cm2, avecunretard de 30 s, pour une exposition totale de 460 mJ/cm2.
    5. Effectuez une cuisson post-exposition sur la plaquette exposée dans un four à 50 °C pendant la nuit.
    6. Éteignez le four le lendemain matin et, une fois la plaquette refroidie à température ambiante, plongez-la dans SU8-developer. Retirez la plaquette du développeur toutes les 5 minutes et lavez-la avec IPA, puis replacez-la dans le développeur.
    7. Après environ 20 min, ou lorsque l’IPA est clair, sécher la plaquette avec de l’azote dans l’air et cuire au four réglé à 150 °C; dès que le four atteint 150 °C, éteignez-le mais ne l’ouvrez pas. Laissez la plaquette dans le four jusqu’à ce qu’elle ait atteint la température ambiante, puis retirez la plaquette.
    8. Confirmez la hauteur de SU8 avec un profilomètre et les caractéristiques optiques avec un microscope optique. Une fois confirmé, collez la plaquette à l’intérieur d’une boîte de Pétri en plastique de 150 mm.
  2. Lithographie douce
    REMARQUE: La plaquette, collée à la boîte de Petri, doit être silanisée pour empêcher l’adhésion du PDMS aux caractéristiques SU8.
    1. Inversez la plaquette (taraudée dans une boîte de Petri en plastique) sur une boîte de Petri en verre de la même taille contenant 0,4 mL de méthyltrichlorosilane (MTCS) et exposez la plaquette aux vapeurs pendant 4 min. Tournez la plaquette verticalement et placez le couvercle sur la boîte de Pétri.
    2. Mélanger 30 g de base d’élastomère de silicone à l’agent de durcissement à un rapport de 10:1. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et versez le polydiméthylsiloxane (PDMS) sur la plaquette, puis dégazez-le dans un dessicateur.
    3. Une fois que toutes les bulles ont disparu, placez la plaquette à 80 °C pendant 1,5 h pour durcir le PDMS.
    4. Décollez soigneusement le PDMS, et poinçonnez les entrées et les prises pour les orifices de tissu et les canaux de support avec un poinçon de biopsie de 1 mm et de 1,5 mm, respectivement.
    5. Nettoyez les canaux PDMS avec du ruban adhésif pour éliminer la poussière. Ensuite, trempez les lamaux de couverture (18 x 18 mm, No.1) dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 15 min. Ensuite, séchez-les avec des lingettes en tissu.
    6. Soumettre à la fois les lamaux de couverture et les canaux PDMS (côté caractéristique exposé) au plasma (mise en hauteur) pendant 1 min, puis se lier rapidement et placer dans un four à 80 ° C pendant la nuit pour sécuriser la liaison.
      REMARQUE: Pendant le collage, il est essentiel d’appliquer une pression douce sur les bords des canaux PDMS pour assurer une bonne étanchéité entre le PDMS et le verre tout en évitant le canal lui-même pour éviter l’effondrement du canal.
  3. Préparation de l’appareil
    1. Submerger les dispositifs PDMS collés dans de l’eau désionisée (DIH2O) et l’autoclave avec le cycle liquide. Ensuite, aspirez le liquide des appareils et autoclavez à nouveau avec le cycle de gravité. Ensuite, déshydratez les appareils stérilisés pendant la nuit à 80 °C.

2. Culture de cellules souches (durée approximative: 1-2 mois)

  1. culture et entretien hiPSC
    REMARQUE: Les hiPSCs doivent être cultivés pendant trois passages consécutifs après décongélation in vitro avant cryoconservation ou différenciation. Les hiPSCs sont cultivés en milieu E8 ou mTeSR1, selon la lignée cellulaire, sur les plaques revêtues de matrice de membrane de sous-sol24.
    1. Pour recouvrir les plaques d’une matrice membranaire de sous-sol de qualité HESC, décongeler une partie aliquote du milieu matriciel (volume dépendant du lot, généralement de 200 à 300 μL; stocké à -80 °C) en l’ajoutant à 25 mL de DMEM/F-12K sur la glace. Distribuer 1 mL de cette suspension dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Laisser la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h.
    2. Lors de la décongélation, modifiez le milieu E8 pour la culture hiPSC en ajoutant 5 μM de Y-2763225 (E8+RI). Utilisez ce support pendant 24 h par la suite, puis changez le média en E8 frais.
      Remarque : pour les modifications de média de routine, le média E8 non modifié est utilisé pour la culture hiPSC. Pour une maintenance régulière, le support E8 doit être changé tous les jours, environ 24 h après le changement de support précédent.
    3. Cellules de passage au jour 3 ou au jour 4, aspirer les milieux, puis laver chaque puits avec 1 mL de 1x solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
      REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont d’environ 70% confluent. Ne les laissez pas pousser au-delà de 70% de confluence.
    4. Aspirer le DPBS, puis ajouter 1 mL d’EDTA de 0,5 mM à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 6 à 7 min.
    5. Aspirez soigneusement l’EDTA, ajoutez 1 mL d’E8 + RI dans chaque puits et dynamitez contre la surface avec une pipette de 1 mL (~ 5 à 10 fois pour collecter toutes les cellules). Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 15 mL.
    6. Comptez la suspension et le passage de la cellule à la densité de cellule souhaitée (c.-à-d. ~ 200 K par puits) dans E8 + RI.
    7. Changez le support en E8 (sans RI) 24 h après. Ne laissez pas les cellules avec RI pendant plus de 24 h.
      NOTA: E8 ne doit pas être chauffé à 37 °C. Laissez-le toujours à température ambiante pour le réchauffer avant la culture cellulaire.
  2. Différenciation dirigée par cardiomyocytes (CM)
    Remarque : Il est important de noter l’existence d’hétérogénéité entre les différentes lignes de la hiPSCs26,27, de sorte que les étapes suivantes peuvent avoir besoin d’être optimisées pour chaque lignée cellulaire. Suivez les étapes ci-dessous pour la différenciation CM.
    1. Préparer RPMI + B27 - insuline en ajoutant 10 mL de B27 moins l’insuline et 5 mL de pénicilline/streptomycine (stylo/streptocoque) à 500 mL de RPMI 1640.
    2. Préparer RPMI + B27 + insuline en ajoutant 10 mL de B27 et 5 mL de stylo/streptocoque à 500 mL de RPMI 1640.
    3. Préparer RPMI moins glucose + B27 + insuline en ajoutant 10 mL de B27, 5 mL de stylo/streptocoque, et 4 mM de lactate de sodium à 500 mL de RPMI 1640 sans glucose.
    4. Une fois que les HIPSCs atteignent 85% de confluence, commencez la différenciation (jour 0) en remplaçant l’ancien milieu par 4 mL du milieu RPMI + B27 - milieu insulinique contenant 10 μM CHIR99021 à chaque puits d’une plaque de 6 puits (c.-à-d. ajouter 25 μL de CHIR99021 de 10 mM en 25 mL de RPMI + B27 - insuline, puis ajouter immédiatement 4 mL par puits).
      REMARQUE: CHIR99021 est un inhibiteur de GSK et conduit à l’activation de Wnt. La concentration optimale de CHIR99021 et la confluence initiale varient pour chaque lignée cellulaire28. Vérifiez toujours un gradient de concentration de 6-12 μM CHIR99021 et une série de densités d’ensemencement avant l’expérience réelle pour déterminer les conditions optimales pour initier la différenciation.
    5. Exactement 24 h plus tard (Jour 1), aspirer le milieu et remplacer par 5 mL de RPMI pré-feu + B27 - insuline à chaque puits.
    6. Exactement 72 h après l’ajout de CHIR99021 (jour 3), recueillir 2,5 mL du milieu usé de chaque puits de la plaque de 6 puits, totalisant 15 mL du milieu usé dans un tube.
    7. A cela, ajoutez 15 mL de RPMI frais + B27 - milieu insulinodépendant. Ajouter IWP2 à une concentration de 5 μM dans le tube du milieu combiné (c.-à-d. 1 μL d’IWP2 à 5 mM par 1 mL de milieu combiné ou 30 μL d’IWP2 dans un milieu total de 30 mL).
    8. Enlever ~1,5 mL du milieu restant par puits de la plaque de sorte qu’il reste 1 mL du milieu. Faire pivoter vigoureusement la plaque pour assurer une élimination adéquate des débris cellulaires. Ensuite, aspirer le reste de l’ancien milieu et ajouter 5 mL du milieu combiné contenant IWP2 par puits de la plaque.
      REMARQUE: L’ajout de IWP2 aux cellules conduit à l’inhibition de Wnt.
    9. Le jour 5, aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par 5 mL de RPMI pré-feu + B27 - insuline.
    10. Maturation CM: Le jour 7, le jour 9 et le jour 11, aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par 5 mL de RPMI pré-conformé + B27 + insuline. Les coups spontanés doivent être observés autour de ces jours.
    11. Purification CM: Le jour 13 et le jour 16, commencez la famine de glucose en aspirant le milieu de chaque puits, en lavant chaque puits avec 1 mL de 1x DPBS, puis en ajoutant 5 mL de RPMI pré-patiné moins glucose + B27 + insuline, complété avec 4 mM de lactate de sodium.
    12. Le jour 19, aspirez le milieu usé et remplacez-le par 5 mL de RPMI pré-feu + B27 + insuline dans chaque puits pour permettre la récupération cellulaire après purification.
    13. Le jour 21, replaquez les cellules, suivant le protocole de dissociation cm décrit ci-dessous (étape 3.3). Visez à plaquer 1,5-2 x10 6 cellules par puits dans une plaque de 6 puits. Par exemple, s’il s’agit d’une différenciation très efficace, l’expansion générale des 6 puits en 9 puits est bonne.
    14. À partir du jour 21, aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par 4 mL de RPMI + B27 + insuline tous les 2-3 jours.
      REMARQUE: Les hiPSC-CMs sont prêts pour une utilisation expérimentale après le jour 23.

3. Création de tissu cardiaque 3D dans le dispositif microfluidique: (Durée approximative: 2-3 h)

  1. Culture hCF
    1. Culture de fibroblastes cardiaques ventriculaires humains (hFC; obtenus commercialement à partir de Lonza) dans des fioles T75 (à 250K cellules par flacon) dans le fibroblaste Growth Media-3 (FGM3). Changez le média tous les deux jours, et passez quand à 70% confluent. Utilisez les hFC avant le passage 10, car ils peuvent commencer à se différencier des myofibroblastes aux passages élevés29.
  2. Dissociation hCF
    1. Pour dissocier les hFC, sortez d’abord le ballon de l’incubateur. Placez le ballon à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et commencez à aspirer le support usé du ballon. Ensuite, lavez le ballon T75 avec 3 mL de 1x DPBS. Fermez le bouchon et faire tourbillonner le ballon.
    2. Aspirez le DPBS. Prendre 3 mL de Trypsine-EDTA pré-warmed 1x (0,05%) et l’ajouter au ballon. Inclinez le ballon et tourbillonnez pour enduire le fond. Laissez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 4 à 6 min, en vérifiant le ballon au microscope pour vous assurer que les cellules se détachent, comme en témoignent la forme des cellules rondes et les cellules flottantes. Si ce n’est pas le cas, remettez le ballon dans l’incubateur pendant une minute de plus.
    3. Neutraliser l’action de la trypsine en ajoutant 3 mL de MGF3 pré-contrefaisante au ballon. Ensuite, pipettez la solution de haut en bas contre le fond du ballon pour déloger les FC.
    4. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 15 mL. Prenez 10 μL de la suspension cellulaire et distribuez-la dans un hémocytomètre pour compter les cellules avec un microscope.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 4 min. Aspirez le surnageant en faisant attention à ne pas perturber la pastille cellulaire.
    6. Ressusciter le culot dans FGM3 frais, pour faire un désiré 75 x 106 cellules / mL. Soit passer une portion (250K cellules par flacon T75) ou suivre le protocole ci-dessous pour générer du tissu cardiaque 3D.
  3. Dissociation cm
    NOTA: Après différenciation et purification, préparer les MC pour les utiliser dans l’injection dans des dispositifs microfluidiques.
    1. Sortez l’assiette des MC de l’incubateur et aspirez le support. Ensuite, lavez les puits avec 1 mL de 1x DPBS par puits d’une plaque de 6 puits. Prendre 6 mL de DPBS et pipetter 1 mL par puits.
    2. Aspirer le DPBS en prenant soin de ne pas perturber les cellules fixées à la plaque. Pipetter 6 mL de solution de détachement de cellules chaudes (p. ex. TrypLE express) et ajouter 1 mL par puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C pendant 10 min.
    3. Neutraliser l’enzyme avec un volume égal d’insuline RPMI + B27+ (c.-à-d. 1 mL par puits) et dissocier mécaniquement les cellules en pipetant de haut en bas contre le récipient de culture avec une pipette de 1 mL.
    4. Recueillir les MC dans un tube de centrifugation de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min.
    5. Aspirez le surnageant. Ressusciter la pastille cellulaire dans 5 ml de RPMI + B27 + insuline. Pipetter la solution de haut en bas avec une pipette de 1 mL pour assurer un mélange approprié. Prenez 10 μL de la suspension cellulaire et distribuez-la dans un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
    6. Centrifuger à nouveau les cellules à 300 x g pendant 3 min (pour assurer l’élimination complète de TrypLE), et aspirer le surnageant. Ensuite, ajoutez un volume approprié de RPMI + B27 + insuline pour atteindre 75 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE : Si la différenciation/sélection cardiaque n’entraîne pas un taux élevé de CM % (c.-à-d. >80 %), comme en témoigne l’immunomarquage ou la cytométrie en flux pour les protéines spécifiques à la CM comme le cTnT, ne considérez pas les cellules comme convenant à la formation des tissus. Le processus de différenciation doit être optimisé lorsque cela se produit par l’ajustement des concentrations chir99021 et de la densité de départ initiale. Si la purification cm a besoin d’amélioration, d’autres méthodes peuvent être utilisées, telles que le tri pour les MC avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS)30,31,32.
  4. Préparation de collagène
    REMARQUE: Préparez le collagène à partir de la concentration élevée de stock de collagène (allant de 8-11 mg / mL). Le collagène utilisé pour créer le mélange cellule:hydrogel est à 6 mg/mL, et la concentration finale est de 2 mg/mL. Selon le nombre d’appareils à injecter, le volume de solution de collagène à faire doit être de nouveau calculé.
    1. Conservez tous les réactifs requis sur la glace à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.
      REMARQUE: Le collagène est un hydrogel thermoréactif. Par conséquent, la température doit rester basse pour éviter une polymérisation prématurée.
    2. Prendre 75 μL de collagène (8 mg/mL) et le distribuer dans un tube de microcentrifugation sur de la glace. La solution de collagène est très visqueuse, alors aspirez-la lentement avec une pipette.
    3. Prenez 13,85 μL de milieux (c.-à-d. RPMI + B27 + insuline) et distribuez-le dans le même tube.
    4. Ensuite, prenez 10 μL de rouge de phénol et ajoutez au mélange et ressuscitez.
    5. Enfin, prenez 1,15 μL de NaOH 1N et ajoutez à la suspension.
    6. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, ressuscitez la suspension.
      REMARQUE: Le collagène d’origine a un pH acide, nécessitant l’ajout de NaOH pour neutraliser avant de l’utiliser pour encapsuler les cellules cardiaques. Le rouge de phénol agit comme un indicateur de pH; par conséquent, ajoutez ceci avant l’ajout naOH. À ce stade, la solution de collagène sera jaune, indiquant son acidité. Après l’ajout de NaOH, la solution doit devenir orange à rose clair, indiquant sa neutralisation.
  5. Mélange d’hydrogel et préparation cellulaire
    REMARQUE: Dans cette étape, l’encapsulation des cellules dans l’hydrogel à base de collagène est effectuée. Les cellules, ainsi que tous les précurseurs d’hydrogel, devraient être placés sur la glace au cours des prochaines étapes.
    1. À ce stade, si les FC n’ont pas encore été trypsinisées, entreposer la suspension CM dans un tube à centrifuger de 15 mL, le couvercle étant dévissé pour permettre l’écoulement du gaz, dans un incubateur à 37 °C. En parallèle, dissociez les FC et collectez à une densité de 75 x 106 cellules/mL pour le chargement de l’appareil.
    2. Mélanger les MC suspendus avec les FC à un rapport de 4:1. Prendre une partie aliquote de 8 μL de MC et ajouter à un tube de centrifugation frais sur de la glace. Ensuite, prenez 2 μL de FC et ajoutez-les à la suspension cellulaire dans le tube de centrifugation.
    3. Remettez la suspension cellulaire sous suspension, saisissez 5,6 μL de la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de microcentrifugation frais.
    4. Prenez 4 μL du collagène qui vient d’être préparé dans les étapes ci-dessus et ajoutez-le à un mélange de 4:1 CM:CF. Ajouter 2,4 μL de matrice membranaire de sous-sol à facteur de croissance réduit (DFG), ce qui fait que la densité cellulaire finale est de 35 x 106 cellules/mL pour l’injection de l’appareil. Pipetter le mélange de haut en bas pour s’assurer que la suspension cellulaire est homogène.
  6. Insertion de l’appareil
    REMARQUE: Une fois que le mélange cellule: hydrogel est préparé, il doit être inséré dans les dispositifs.
    1. Sortez les appareils microfluidiques autoclavés du four à 80 °C et placez-les dans l’armoire de biosécurité pendant au moins 1 h avant l’insertion de la suspension cellulaire pour permettre aux appareils de refroidir à température ambiante tout en maintenant la stérilité.
    2. Placez les appareils dans des boîtes de Pétri de 60 x 15 mm, à 3-4 appareils par boîte. Remplissez une boîte de Petri de 150 x 15 mm avec une fine couche DI H2Opour contenir 3 des boîtes de Petri de 60 x 15 mm. Cette étape crée un environnement humidifié entourant les dispositifs microfluidiques.
    3. Utilisez une nouvelle pointe et ressuscitez soigneusement le mélange de cellules et d’hydrogel en pipetant la suspension pendant que le tube reste sur la glace.
    4. Insérez la pointe dans le port d’injection de l’appareil et injectez lentement et régulièrement 3 μL de la suspension de cellule:hydrogel dans l’entrée de la région tissulaire d’un dispositif microfluidique à l’aide d’une pointe de pipette de 20 μL. Une fois le port rempli, arrêtez l’injection et retirez la pointe. Répétez l’opération pour tous les appareils ou l’intégralité de la suspension d’hydrogel préparée.
      REMARQUE: Le petit volume de la suspension de cellule: hydrogel chauffe / refroidit très rapidement, il est donc pertinent de garder la suspension sur la glace aussi longtemps que possible. Lors de l’insertion, pipetter la solution hors de la glace et l’insérer dans les dispositifs le plus rapidement possible, car l’hydrogel peut commencer à polymériser dans l’extrémité de la pipette. Il est important de créer de petits volumes de la suspension cell:hydrogel à la fois, donc si de nombreux appareils doivent être injectés, la suspension cell:hydrogel devra être fraîche pour chaque ensemble de 4 appareils.
    5. Retournez les appareils dans leurs boîtes de Pétri avec une pince à épiler et placez-les à l’intérieur de la grande boîte de Pétri avec de l’eau. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 9 min pour la polymérisation de l’hydrogel.
    6. Sortez les appareils de l’incubateur, retournez les appareils à la verticale et incuber à 37 °C pendant 9 min pour terminer la polymérisation de l’hydrogel.
    7. Injecter RPMI + B27 + insuline dans les canaux de support flanquants (~ 20 μL par appareil). Replacez les appareils dans l’incubateur à 37 °C. Changez les médias dans les canaux médiatiques avec RPMI frais + B27 + insuline tous les jours. Il a été démontré que les dispositifs sont cultivés de 14 à 21 jours20.
      REMARQUE: En raison du petit volume de support par puce, pour éviter l’évaporation du support, il est important de maintenir les appareils dans une grande boîte de Petri remplie de DIH2O,qui sert de chambre humidifiée. De plus, de petites gouttelettes d’excès de RPMI + B27 + insuline peuvent être pipettes sur le dessus des entrées /sorties de canal pendant les changements de média de routine.

4. Analyse tissulaire

  1. Imagerie en direct
    REMARQUE: Toute l’imagerie en direct doit être effectuée avec un incubateur d’étape pour maintenir 37 ° C et 5% de CO2.
    1. Placez les appareils dans un incubateur d’étape contrôlé par l’environnement. Enregistrez des vidéos de 30 s de plusieurs spots dans chaque appareil à la fréquence d’images maximale.
    2. Pour évaluer la contractilité tissulaire après l’extraction des signaux de battement, utilisez le code MATLAB supplémentaire écrit sur mesure pour extraire les pics(fichier supplémentaire 2)pour calculer la variabilité de l’intervalle entre les battements.
    3. Changez le support dans les dispositifs dans la hotte de culture cellulaire, puis replacez-les dans l’incubateur de culture cellulaire.
  2. Coloration immunofluorescente
    1. Préparer le PBS-Glycine : Dissoudre la glycine à 100 mM dans du PBS et ajouter 0,02 % de NaN3 pour un stockage à long terme. Ajuster le pH à 7,4.
    2. Préparez PBS-Tween-20 : ajoutez 0,05 % de Tween-20 au PBS et ajoutez 0,02 % de NaN3 pour le stockage à long terme. Ajuster le pH à 7,4.
    3. Préparer la mémoire tampon IF : ajoutez 0,2 % de Triton X-100, 0,1 % de BSA et 0,05 % de Tween-20 au PBS, puis ajoutez 0,02 % de NaN3 pour le stockage à long terme. Ajuster le pH à 7,4.
    4. Préparer 10% sérum de chèvre: Ressusciter le sérum de chèvre lyophilisé dans 2 mL de PBS pour faire 100% sérum de chèvre. Ensuite, diluez les 2 mL avec 18 mL de PBS pour faire 10% de sérum de chèvre.
    5. Fixer les échantillons en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) aux canaux tissulaires et en incubant à 37 °C pendant 20 min.
    6. Laver les cellules en ajoutant du PBS-Glycine aux canaux tissulaires 2x pendant 10 min d’incubation à température ambiante.
    7. Laver les cellules en ajoutant PBS -Tween-20 pendant 10 min à température ambiante.
    8. Perméabiliser les cellules en ajoutant un tampon IF aux canaux tissulaires pendant 30 min à température ambiante.
    9. Bloquer les cellules en ajoutant 10% solution de sérum de chèvre aux canaux tissulaires pendant 1 h à température ambiante.
    10. Diluer les anticorps primaires non conjugués dans du sérum de chèvre à 10 % aux concentrations souhaitées (voir le fichier supplémentaire 3),ajouter aux canaux tissulaires et incuber les échantillons à 4 °C pendant la nuit.
    11. Le lendemain, lavez les échantillons en ajoutant du PBS-Tween-20 aux canaux tissulaires 3x pendant 20 min chacun à température ambiante.
      REMARQUE: À partir de l’étape 4.2.12, effectuez toutes les tâches dans l’obscurité, de sorte que les échantillons sont protégés de la lumière.
    12. Diluer les anticorps secondaires dans PBS-Tween-20 aux concentrations souhaitées, centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min pour recueillir les précipités, puis ajouter aux canaux tissulaires.
    13. Après 30 min-1 h, laver les échantillons avec pbs-tween-20 3x pendant 10 min chacun à température ambiante.
    14. Ajouter un support de montage anti-fondu ou souhaité aux canaux tissulaires. Ensuite, les échantillons peuvent être microscopés à l’aide d’une microscopie à fluorescence ou d’un microscope confocal, si un grossissement plus élevé est souhaité. Pour visualiser l’ensemble du tissu 3D, les images à différents plans z peuvent être empilées et reconstruites pour former des images 3D représentatives.

Résultats

Pour obtenir une population hautement purifiée de MC à partir de HIPSCs, une version modifiée impliquant une combinaison du protocole de différenciation Lian33 et des étapes de purification de Tohyama34 est utilisée (voir la figure 1A pour la chronologie expérimentale). Les hiPSCs doivent être en forme de colonie, ~ 85% confluents, et répartis uniformément dans tout le puits de culture 3-4 jours après le passage, au début de la diff...

Discussion

La formation d’un modèle de tissu cardiaque humain in vitro avec des interactions cellule-cellule améliorées et une structure 3D biomimétique est impérative pour la recherche cardiovasculaire fondamentale et les applications cliniques correspondantes1. Ce protocole décrit explique le développement du tissu cardiaque anisotrope humain 3D dans un dispositif microfluidique, utilisant la co-culture des MC dérivés de cellules souches avec des FC conjonctifs encapsulés dans un hydro...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous tenons à remercier le NSF CAREER Award #1653193, arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872), et le Flinn Foundation Award pour avoir fourni des sources de financement pour ce projet. La ligne hiPSC, SCVI20, a été obtenue de Joseph C. Wu, MD, PhD au Stanford Cardiovascular Institute financé par NIH R24 HL117756. La ligne hiPSC, IMR90-4, a été obtenue auprès du WiCell Research Institute55,56.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001can also be made in house
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

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