JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الأنسجة الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى بعد رأب مفصل الركبة الكلي توفر نموذجا تجريبيا لأبحاث هشاشة العظام مع أقصى قدر من الترجمة السريرية. يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد ومعالجة وعزل الحمض النووي الريبي من سبعة أنسجة ركبة فريدة من نوعها لدعم التحقيق الميكانيكي في هشاشة العظام البشرية.

Abstract

هشاشة العظام (OA) هو مرض مزمن وتنكسي مشترك يصيب الركبة في معظم الأحيان. وبما أنه لا يوجد علاج في الوقت الحالي، فإن رأب مفصل الركبة الكلي (TKA) هو تدخل جراحي شائع. التجارب باستخدام أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية التي تم الحصول عليها من TKA توفر القدرة على التحقيق في آليات المرض في الجسم الحي السابق. في حين كان يعتقد سابقا أن الزراعة العضوية تؤثر أساسا الغضروف، ومن المعروف الآن أن تؤثر على أنسجة متعددة في المفصل. يصف هذا البروتوكول اختيار المريض ومعالجة العينات وتجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة (استنادا إلى نقاء الحمض النووي الريبي وسلامته وعائده) من كل من الأنسجة السبعة الفريدة لدعم التحقيق في آلية المرض في مفصل الركبة. وبرضاء مستنير، تم الحصول على عينات من المرضى الذين يخضعون ل TKA من أجل الزراعة العضوية. تم تشريح الأنسجة وغسلها وتخزينها في غضون 4 ساعة من الجراحة عن طريق تجميد فلاش للجيش الملكي النيبالي أو تثبيت الفورمالين لعلم الأنسجة. وشملت الأنسجة التي تم جمعها الغضروف المفصلي، والعظام تحت الوخز، الغضروف المفصلي، وسادة الدهون infrapatellar، الرباط الصليبي الأمامي، الزليلي، والعضلات المائلة vastus الوسطى. تم اختبار بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي لكل نوع من أنواع الأنسجة. وشملت التعديل الأكثر أهمية طريقة التفكك المستخدمة في الأنسجة المنخفضة الخلية، عالية المصفوفة، والأنسجة الصلبة (تعتبر الغضاريف والعظام والغضروف المفصلي) مقابل الأنسجة الرخوة عالية الخلية نسبيا، منخفضة المصفوفة (تعتبر وسادة الدهون، الرباط، الزليلية، والعضلات). ووجد أن النبض مناسب للأنسجة الصلبة، وأن التجانس مناسب للأنسجة الرخوة. ولوحظ ميل لبعض المواضيع إلى تحقيق قيم أعلى من عدد نزاهة الحمض النووي الريبي (RIN) من الموضوعات الأخرى باستمرار عبر أنسجة متعددة، مما يشير إلى أن العوامل الكامنة مثل شدة المرض قد تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي. توفر القدرة على عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة عن أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية نموذجا ذا صلة فسيولوجية لتجارب التعبير الجيني المتطورة ، بما في ذلك التسلسل ، والتي يمكن أن تؤدي إلى رؤى سريرية تترجم بسهولة أكبر إلى المرضى.

Introduction

الركبة هي أكبر مفصل زليلي في جسم الإنسان ، ويتألف من المفصل التكافلي بين الساق وعظم الفخذ والمفصل الرضفة بين الرضفة وعظم الفخذ1. تصطف العظام في الركبة مع غضروف المفصلي وبدعم من الأنسجة الضامة المختلفة، بما في ذلك الغضروف المفصلي والدهون والأربطة والعضلات، وغشاء الزليلي يلف المفصل كله لإنشاء تجويف مملوء بالسوائل الزليلية1،2،3 ( الشكل1). وظائف الركبة صحية كمفصل المفصلي المحمول الذي يسمح الحركة الاحتكاك في الطائرة الأمامية1،3. في ظل الظروف المرضية ، يمكن أن تصبح الحركة مقيدة ومؤلمة. مرض مفصل الركبة التنكسية الأكثر شيوعا هو هشاشة العظام (OA)4. ومن المعروف أن مجموعة متنوعة من عوامل الخطر مهيأة لتطوير الزراعة العضوية، بما في ذلك كبار السن والسمنة والجنس الأنثوي والصدمات النفسية المشتركة وعلم الوراثة، من بين أمور أخرى5،6. هناك حاليا ما يقدر بنحو 14 مليون شخص في الولايات المتحدة الأمريكية يعانون من أعراض الزراعة العضوية في الركبة ، مع زيادة انتشار بسبب ارتفاع سن السكان ومعدلات السمنة7،8. يعتبر في البداية أن يكون مرض الغضروف، الزراعة العضوية هو الآن يفهم على أنه مرض المفصل كله9. التغيرات المرضية التي لوحظت عادة في الزراعة العضوية تشمل تآكل الغضاريف المفصلية ، وتشكيل العظام ، وسماكة العظام تحت الوخز ، والتهاب الزليلي9،10. نظرا لعدم وجود علاج معروف ل OA ، تركز العلاجات في المقام الأول على إدارة الأعراض (على سبيل المثال ، الألم)11،12، وبمجرد تقدم الزراعة العضوية إلى المرحلة النهائية ، غالبا ما يشار إلى جراحة استبدال المفاصل13.

يمكن أن تكون جراحات استبدال المفاصل إما استبدال جزئي أو كلي للركبة ، مع رأب مفصل الركبة الكلي (TKA) بما في ذلك استبدال التعبير التكافلي الكامل والمفصل الرضفة. اعتبارا من عام 2020 ، يتم تنفيذ ما يقرب من 1 مليون TKAs في الولايات المتحدة الأمريكية كل عام14. خلال TKA، جراح العظام resects الجزء العلوي من الهضبة الظنبوبية والكونديلز الفخذ السفلي (الشكل 2A، 2B) لتكون مزودة يزرع الاصطناعية. يساء تفسيرها في بعض الأحيان من قبل المرضى، في TKA، يتم استئصال فقط 8-10 ملم من نهاية كل عظمة، والتي توج في وقت لاحق أو تطفو على السطح، مع المعدن. تشكل بطانة البولي إيثيلين المتشابكة سطح الحامل (أي الحشو) بين الغرستين المعدنيتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استئصال العديد من مكونات الأنسجة الرخوة في المفصل بشكل كامل أو جزئي لتحقيق التوازن السليم للمفاصل. من بين هذه الأنسجة هي الوساطة والحروف المفصلي الجانبي (الشكل 2C)، وسادة الدهون تحتباتيلور (الشكل 2D)، الرباط الصليبي الأمامي (ACL؛ الشكل 2E), الزليلية (الشكل 2F), وs vastus العضلات المائلة (VMO; الشكل 2G) 15.على الرغم من أن TKAs ناجحة عموما لعلاج الزراعة العضوية, حوالي 20٪ من المرضى تقرير تكرار الألم بعد الجراحة16. جنبا إلى جنب مع ارتفاع تكلفة والتوغل النسبي للإجراء، وهذه القيود تشير إلى الحاجة إلى مزيد من البحوث لتحديد العلاجات البديلة للتخفيف من تطور الزراعة العضوية.

لاستكشاف آليات المرض في الزراعة العضوية التي قد تقدم سبلا جديدة للتدخل العلاجي ، يمكن استخدام النظم التجريبية ، بما في ذلك الخلايا ، والنباتات الأنسجة ، والنماذج الحيوانية. وعادة ما يتم استزراع الخلايا في طبقة أحادية وتستمد من الأنسجة البشرية أو الحيوانية الأولية (على سبيل المثال، الشوندروسيتيات المعزولة عن الغضاريف) أو الخلايا الخالدة (على سبيل المثال، ATDC517 و CHON-00118). في حين أن الخلايا يمكن أن تكون مفيدة لمعالجة المتغيرات التجريبية في بيئة الثقافة الخاضعة للرقابة، فإنها لا تلتقط ظروف المفصل الطبيعي التي من المعروف أنها تؤثر على الأنماط الظاهرية للخلايا19. لتلخيص أفضل لسلسلة معقدة من الاتصالات الكيميائية والميكانكية ، وخلايا إلى خلايا الكامنة وراء الزراعة العضوية ، تم العثور على بديل في عينات الأنسجة البشرية أو الحيوانية الأولية ، سواء كانت تستخدم الطازجة أو المستزرعة ex vivo كما explants ، للحفاظ على هيكل الأنسجة والبيئة الدقيقة الخلية20. من أجل دراسة المفصل في الجسم الحي، صغيرة (على سبيل المثال ، الماوس21)وكبيرة (على سبيل المثال ، الحصان22)نماذج حيوانية ل OA (على سبيل المثال ، من خلال الاستقراء الجراحي ، والتغيير الوراثي ، أو الشيخوخة) مفيدة أيضا. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الترجمة من هذه النماذج إلى الأمراض البشرية محدودة بسبب الاختلافات التشريحية والفسيولوجية والأيضية ، من بين أمور أخرى23. وبالنظر إلى مزايا وعيوب النظم التجريبية، فإن نقاط القوة الرئيسية لكونها خاصة بالأنواع والحفاظ على مكانة خارج الخلية التي تقدمها أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية تزيد من الإمكانات التحويلية لنتائج البحوث.

يمكن الحصول على أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية بسهولة بعد TKA ، مما يجعل التردد العالي ل TKAs موردا قيما للبحث. ومن بين التطبيقات التجريبية المحتملة التعبير الجيني والتحليلات النسيجية. لتحقيق إمكانات أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية لهذه النهج البحثية وغيرها ، والخطوط العريضة هي الاعتبارات الرئيسية التالية. أولا، يخضع استخدام عينات المرضى للتنظيم الأخلاقي، ويجب أن تفي البروتوكولات بموافقات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB)24. ثانيا، إن التغاير المتأصل في الأنسجة البشرية المريضة الأولية وتأثير المتغيرات مثل العمر والجنس، من بين أمور أخرى، يخلق الحاجة إلى اختيار دقيق للمرضى (أي تطبيق معايير الأهلية) وتفسير البيانات. ثالثا، يمكن أن تشكل الخصائص البيولوجية الفريدة لمختلف الأنسجة في المفصل (مثل انخفاض الخلايا في الغضاريف والغضروف المفصلي25)تحديات أثناء التجارب (على سبيل المثال، عزل الجودة العالية وكمية الحمض النووي الريبي). ويتناول هذا التقرير هذه الاعتبارات ويقدم بروتوكولا لاختيار المرضى ومعالجة العينات وتجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة (أي تقييم نقاء الحمض النووي الريبي وسلامته؛ الشكل 3) لتشجيع استخدام أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية في مجتمع البحوث.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا واتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية لنظام هنري فورد الصحي (IRB # 13995).

1. اختيار المريض

  1. تحديد المرضى من بين أولئك الذين من المقرر أن يخضع TKA مع جراح العظام.
  2. حدد المرضى بناء على معايير الأهلية المحددة في بروتوكول الدراسة. وتشمل الأمثلة على معايير الإدماج أن تكون في الثامنة عشرة من العمر أو أكثر وأن يكون لديها تشخيص مؤكد لهشاشة العظام في الركبة. ومن الأمثلة على معايير الاستبعاد الخضوع لاستبدال جزئي للركبة أو إجراء تشخيص مؤكد لالتهاب المفاصل الروماتويدي.
  3. اتصل بالمرضى للحصول على موافقة مستنيرة قبل الجراحة.

2. تجهيز العينات (للجيش الملكي النيبالي)

ملاحظة: إجراء جميع معالجة الأنسجة في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية واتباع تقنيات معقمة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة دائما (قفازات النتريل، معطف المختبر، نظارات السلامة) عند معالجة العينات البشرية. يتم إنتاج العديد من شظايا العظام خلال TKA ، وكمية كبيرة من العظام / الغضاريف يحتمل أن تكون متاحة للتشريح. بسبب تطور المرض، قد يكون تنكس الغضاريف المفصلية أكثر حدة على بعض أجزاء العظام، والتي يمكن أخذها في الاعتبار في التصميم التجريبي. فقط الأنسجة التي تفرض الكترووتري لاستئصالها لديها تلف في الحافة الحرارية ، ويتم بذل جهد جراحي متضافر لشراء معظم الأنسجة بمشرط لتقليل الضرر. يجب الحفاظ على الأنسجة المستئصالة رطبة في جميع الأوقات مع برنامج تلفزيوني معقم.

  1. تطهير جميع أسطح العمل والمعدات مع الإيثانول 70٪ ، RNase إزالة التلوث ، والمياه المعالجة DEPC ، ومرة أخرى مع الإيثانول 70 ٪. مسح السائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. ملقط، وقطع العظام، والمشرط هي إما autoclaved أو غارقة في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. الحفاظ على المعدات المغمورة في الإيثانول 70٪ عندما لا تكون قيد الاستخدام الفوري.
  2. ما قبل التسمية ما لا يقل عن ثلاثة cryovials مع اسم عينة لم يتم تحديدها ورقم aliquot لكل الأنسجة (على سبيل المثال، TKA-1 الغضاريف 1).
    1. تحديد كل نوع نسيج من العينة استنادا إلى الاختلافات في الحجم والشكل واللون والملمس كما هو موضح ومبين في الشكل 2. تحديد الغضروف (الشكل 2A السهم), عظم (الشكل 2B السهم), الغضروف المفصلي (الشكل 2C), دونباتيلور لوحة الدهون (الشكل 2D), الرباط الصليبي الأمامي (الشكل 2E), synovium (الشكل 2F), والعضلات المائلة الوسطى الشاسعة (الشكل 2G).
  3. عزل الغضروف المفصلي.
    1. حدد جزء العظام مع الحد الأدنى من تدهور الغضاريف.
    2. باستخدام مشرط No.10، وقطع من خلال عمق الغضاريف قدر الإمكان لتشريح سمك كامل من طبقة الغضاريف.
      ملاحظة: مشرط No.10 سوف تخترق الغضروف فقط، وليس العظام.
    3. باستخدام سمك كامل من الغضروف، تشريح ثلاثة مكعبات 5 ملم.
  4. عزل العظام تحت الوخز.
    1. استخدم نفس قسم العظام الذي تم جمع الغضروف منه.
    2. باستخدام مشرط رقم 10، كشط أي غضروف المتبقية والأنسجة المتبقية من سطح العظام.
    3. عقد جزء العظام إلى قطع مع ملقط واستخدام قطع العظام لقطع ثلاثة مكعبات 5 ملم.
  5. عزل الغضروف المفصلي.
    1. تحديد جزء غير متضرر نسبيا من الغضروف المفصلي الوسيط أو الجانبي.
    2. باستخدام مشرط No.10 والملقط، تشريح ثلاثة مكعبات 5 ملم.
  6. عزل لوحة الدهون تحتباتيار.
    1. باستخدام مشرط No.10 والملقط، وقطع الجزء الأصفر من الأنسجة إلى ثلاثة أجزاء متساوية الحجم ومتجانسة (~ 500 ملغ لكل منهما).
  7. عزل الرباط الصليبي الأمامي (ACL).
    1. باستخدام مشرط No.10 والملقط، تشريح ثلاثة مكعبات 5 ملم.
  8. عزل الزليلية.
    1. باستخدام مشرط No.10 والملقط ، قم بعزل الجزء الخلوي الوردي من الغشاء قدر الإمكان عن طريق كشط الأنسجة الدهنية.
    2. تشريح ثلاثة أجزاء متساوية الحجم ومتجانسة (~ 200 ملغ لكل منهما).
  9. عزل العضلات المائلة الشاسعة الوسيطة (VMO).
    1. باستخدام مشرط No.10 والملقط، وإزالة أي أنسجة دهنية من العينة، وترك فقط أنسجة العضلات الحمراء.
    2. تشريح ثلاثة مكعبات 5 ملم.
      ملاحظة: الحجم الأولي للأنسجة يحد من حجم الأجزاء.
  10. شطف أجزاء الأنسجة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة أي بقايا أو حطام.
  11. لأداء علم الأنسجة، إصلاح كل جزء الأنسجة كما هو موضح في الجزء 3.
  12. لإجراء استخراج الحمض النووي الريبي، وقطع كل من أجزاء الأنسجة الثلاثة إلى قطع أصغر (~ 1-2   مكعبات مم).
    1. نقل القطع الصغيرة إلى 2 مل التبريد، قبعات آمنة بإحكام، تجميد فلاش عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية، ومن ثم نقل إلى تجميد -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل (ما يصل إلى 4 أشهر اختبارها في البروتوكول الحالي). كرر هذا لجميع aliquots من جميع الأنسجة.
    2. الاستمرار في تجانس الأنسجة كما هو موضح في الجزء 4.

3. معالجة العينات (لعلم الأنسجة)

تنبيه: الفورمولين مادة كيميائية خطرة، تستخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي.

  1. ملء ما قبل المسمى 15 مل أنابيب مخروطية مع حل 10٪ الفورمالين.
  2. باستخدام ملقط، نقل قسم الأنسجة إلى أنابيب مليئة بالفورمالاتين.
  3. إصلاح الأنسجة في الفورمالاتين لمدة 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة أثناء اهتزاز / التحريض إذا كان ذلك ممكنا.
  4. بعد أسبوع واحد، تجاهل الفورمالين في التخلص من النفايات الكيميائية المناسبة، وشطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل الطازجة التي تحتوي على الإيثانول 70٪ للتخزين على المدى الطويل في 4 درجة مئوية حتى يتم تضمين عينات للقسم.
    ملاحظة: للعظام / الغضاريف فقط، إجراء الشارات على النحو التالي.
  5. بعد أسبوع واحد، تجاهل الفورماتين في التخلص من النفايات الكيميائية المناسبة، وشطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني.
  6. نقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع 45 مل من محلول EDTA 10٪ (pH 7.4).
  7. إذا كان اهتزاز / التحريض غير ممكن، عكس الأنابيب 10-15 مرة واحدة يوميا.
  8. تجاهل حل EDTA واستبداله مرة واحدة أسبوعيا.
    1. مرتين أسبوعيا، اختبر الملمس باستخدام أداة (أي ملعقة) أو إصبع قفاز لتأكيد الشارات عن طريق مراقبة التشوه عند تطبيق الضغط. الوقت اللازم لتكريس أنسجة العظام سوف تختلف بين العينات من 4-6 أسابيع.
  9. مرة واحدة شارات، شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل الطازجة التي تحتوي على الإيثانول 70٪ للتخزين على المدى الطويل في 4 درجة مئوية حتى يتم تضمين عينات للقسم.

4. تجانس الأنسجة

تنبيه: يستخدم البروتوكول الفينول الكيميائي الخطر. يجب أن يتم العمل مع الفينول في غطاء الدخان الكيميائي.

ملاحظة: تنظيف جميع المعدات والأسطح بدقة لاستخدامها مع الإيثانول 70٪ (نقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة)، تليها إزالة التلوث RNase (نقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة)، شطف مع المياه المعالجة DEPC، مسح مع نظيفة، منشفة ورقية خالية من الوبر، ومن ثم إعادة رش أو نقع مع الإيثانول 70٪.

  1. تجانس الأنسجة الصلبة (غضروف مفصلي، عظم تحت الوخز، الغضروف المفصلي)
    1. قبل التجانس، والبرد هاون، والحشرات، وملعقة باستخدام النيتروجين السائل. يجب أن تبقى هذه الباردة قدر الإمكان لمنع ذوبان عينة.
    2. معالجة العينات واحدة في وقت واحد، والحفاظ على عينات أخرى في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.
    3. نقل عينة الأنسجة إلى هاون باستخدام ملعقة مبردة. صب النيتروجين السائل إضافية على رأس الأنسجة والسماح لها لتتبخر. سحق الأنسجة باستخدام الحشرات. إضافة المزيد من النيتروجين السائل مرارا وتكرارا إلى عينة الأنسجة، والسماح لها بالتبخر، ومن ثم الاستمرار في طحن مع الحشرات لجعل مسحوق ناعم.
    4. بعد مسحوق الأنسجة قدر الإمكان، نقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل المبردة مسبقا.
      1. أنابيب ما قبل البرد عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية قبل نقل الأنسجة.
    5. إضافة 1 مل من محلول حمض جوانيدينيوم فينول لكل أنبوب ويبقيه على الجليد.
    6. كرر الخطوات 4.1.3-4.1.5 لكل عينة من الأنسجة الصلبة.
    7. بعد كل نسيج، تنظيف هاون، الحشرات، وملعقة مع الإيثانول 70٪، RNase إزالة التلوث، والمياه المعالجة DEPC، ونقع إضافية في الإيثانول 70٪. مسح أي سائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر.
    8. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة إضافية.
  2. تجانس الأنسجة الرخوة (وسادة الدهون تحتباتيار، ACL، الزليلية، VMO)
    1. تطهير المتجانس عن طريق تشغيل أنابيب الإيثانول 70٪، RNase إزالة التلوث، والمياه المعالجة DEPC، وغسل الإيثانول إضافية 70٪، كل لمدة 30 s. مسح أي سائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. كرر هذا بين كل عينة.
    2. قبل التسمية 5 مل أنابيب أسفل جولة لكل عينة. إضافة 1 مل من محلول حمض جوانيدينيوم فينول لكل أنبوب.
      1. العمل على عينة واحدة في وقت واحد، وحفظ عينات أخرى لمعالجتها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. نقل الأنسجة إلى أنبوب 5 مل المسمى مسبقا مع حمض جوانيدينيوم فينول.
    4. تجانس الأنسجة في نبضات 30 ق، وحفظ على الجليد أثناء وبين البقول. كرر حتى يذوب النسيج بصريا أو لمدة أقصاها خمس نبضات 30 ق.
      ملاحظة: قد لا تتجانس بعض الأنسجة الليفية (أي العضلات) تماما.
    5. احتضان الأنسجة الذائبة على الجليد والانتقال إلى العينة التالية.
      1. تنظيف المتجانس كما هو موضح في الخطوة 4.2.1. ضمان قطع الأنسجة لا تبقى في أسنان التحقيق. إزالة مع ملقط معقمة إذا لزم الأمر.
    6. بعد تجانس جميع العينات، واحتضان على الجليد في حمض جوانيدينيوم فينول لمدة 20 دقيقة إضافية.
    7. نقل العينات من أنابيب القاع المستديرة إلى أنابيب الطرد الدقيق قبل المسمى ومبردة مسبقا 1.5 مل.

5. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة

تنبيه: يستخدم هذا البروتوكول مواد كيميائية خطرة مثل الفينول والكلوروفورم والإيزوبروبانول. أداء كل عمل في غطاء الدخان الكيميائي.

ملاحظة: المعدات والكواشف محجوزة لعمل الحمض النووي الريبي فقط ويجب أن تكون من الدرجة الكيميائية المناسبة للتطبيقات الجزيئية (أي معقمة وخالية من النيوكليز). ينجح هذا البروتوكول في كلا من بروتوكولي تجانس الأنسجة 4.1 و4.2. تنظيف جميع المعدات والأسطح بدقة لاستخدامها مع الإيثانول 70٪ (نقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة)، تليها إزالة التلوث RNase (نقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة). شطف مع المياه المعالجة DEPC، مسح السائل المتبقي مع نظيفة، منشفة ورقية خالية من الوبر، ومن ثم إعادة رش أو نقع مع الإيثانول 70٪.

  1. طرد مركزي أنابيب الطرد المركزي في 10000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه الحطام.
  2. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظة: بالنسبة للأنسجة الدهنية، تكون طبقة الدهون موجودة في بعض الأحيان في الأعلى. تجنب نقل هذا عن طريق ثقب الطبقة على جانب الأنبوب مع طرف ماصة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من محلول حمض جوانيدينيوم فينول لكل عينة. يهز الأنابيب بقوة باليد لمدة 30 ثانية لخلط. ثم، احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. عينات الطرد المركزي في 10000 x ز لمدة 12 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، ستكون ثلاث طبقات قد تشكلت: مرحلة مائي تحتوي على الحمض النووي الريبي، ومرحلة حمض نووي أبيض، ومرحلة بروتين وردي في الأسفل.
  5. نقل ~ 500 ميكرولتر من المرحلة العلوية المائية إلى أنبوب طرد دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: لا تزعج المراحل الفاصلة وكسور البروتين. تخزين هذه المراحل في -80 درجة مئوية لعزل الحمض النووي أو البروتين في المستقبل.
  6. إضافة حجم متساو من حمض جوانيدينيوم فينول الحل إلى المرحلة المائية المنقولة، مزيج عن طريق عكس الأنبوب 8-10 مرات. احتضان أنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من محلول حمض جوانيدينيوم فينول لكل عينة. يهز بقوة باليد لمدة 30 ثانية لخلط ومن ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  8. عينات الطرد المركزي في 10000 x ز لمدة 12 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  9. نقل <500 ميكرولتر من المرحلة المائية إلى أنبوب طرد دقيق جديد، مع الحرص على عدم تلويث العينة بالمراحل الأخرى.
    تنبيه: تجاهل المراحل المتبقية باستخدام أساليب التخلص من المواد الخطرة المناسبة.
  10. إضافة حجم متساو (كمرحلة مائي) من 100٪ isopropanol إلى كل عينة. مزيج عن طريق عكس الأنبوب 8-10 مرات. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    1. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين coprecipitant إلى كل عينة للمساعدة في تحديد موقع بيليه الحمض النووي الريبي بعد الطرد المركزي.
  11. الطرد المركزي العينات في 12000 س ز لمدة 25 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  12. تحديد موقع بيليه في الأنبوب (إذا كان استخدام coprecipitant، وسوف تظهر زرقاء). صب بعناية قبالة supernatant.
  13. غسل بيليه بإضافة 1 مل من الجليد الباردة 75٪ الإيثانول إلى كل عينة، دوامة لطرد بيليه من الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: إعداد الإيثانول 75٪ باستخدام الإيثانول النقي الصف الجزيئي والمياه الخالية من النيوكليز.
  14. جهاز طرد مركزي عند 7000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب بعناية قبالة supernatant.
  15. كرر الخطوتين 5.13 و5.14 مرتين إضافيتين.
  16. دوران سريع (<2000 × غرام لمدة 5 ق) لجلب أي سائل المتبقية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. استخدام ماصة P20 لإزالة أي الإيثانول المتبقية من الجزء السفلي من الأنابيب.
    1. تجنب لمس بيليه الحمض النووي الريبي مع طرف ماصة. تغيير التلميحات بين العينات.
  17. مع قبعات أنبوب مفتوحة، عينات الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: بيليه قد تصبح شفافة كما يجف. ضمان تبخر جميع الإيثانول المتبقية سوف يحسن نقاء الحمض النووي الريبي.
  18. إضافة 25 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز إلى كل أنبوب لإذابة بيليه.
  19. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  20. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط الحمض النووي الريبي.
  21. Aliquot 5 ميكرولتر من العينة في أنبوب جديد لتحليل مراقبة الجودة (الجزء 6). تخزين المتبقية 20 ميكرولتر في -80 درجة مئوية لتعبير الجينات المقايسات.

6. مراقبة الجودة

  1. تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحديد سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام جهاز الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تمييع الحمض النووي الريبي ليكون ضمن نطاق حدود الكشف عن رقاقة.

النتائج

سبعة فريدة من نوعها أنسجة مفصل الركبة البشرية متاحة لجمع من المرضى الذين يخضعون ل TKA لOA (الشكل 1). في هذا البروتوكول، تم تحديد كل من هذه الأنسجة ومعالجتها في غضون 4 ساعة من الاستئصال الجراحي(الشكل 2). بعد الخطوات المبينة في الشكل 3، كانت أجزاء من...

Discussion

وقد أثبت البروتوكول المقدم نجاحه في جمع سبعة أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية لاستخراج الحمض النووي الريبي(الجدول 1)والمعالجة النسيجية(الشكل 4). قبل جمع عينات المرضى، من الضروري وضع بروتوكول معتمد من قبل مجلس الهجرة والريب، بالتعاون المثالي مع جراح أو فريق ج...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون المشاركين في الدراسة الذين جعلوا هذا البحث ممكنا وكرسوا هذا التقرير للعلماء الجدد في مجال هشاشة العظام.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf05 402Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificICN19400290Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificBP2818500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificAC327272500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent AlcoholCardinal HealthC4305Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishesThermo Scientific12-556-003Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific14 959 53ASterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)Fisher Scientific10 500 26Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubesCorning352052Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific12 565 271Sterile, nuclease-free.
BioanalyzerAgilentG2939BAFor RNA integrity measurement.
Biosafety CabinetGeneral lab equipment
Bone CuttersFisher Scientific08 990Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume HoodGeneral lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)Thermo Scientific3120032Sterile, nuclease-free.
EDTALife Technologies15-576-02810% solution with dH2O.
ForcepsAny vendorSterilized with 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Liquid NitrogenAny vendor
Liquid Nitrogen DewarGeneral lab equipment
Mortar and PestleAny vendorReserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND-2000For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated waterFisher ScientificSterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)Gibco20 012 050Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tipsAny vendorSterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kitQiagen217204
Refrigerated Centrifuge 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size)Any vendorReserved for RNA work only.
Tissue homogenizerPro Scientific01-01200Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol ReagentFisher Scientific15 596 026Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  27. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  28. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  29. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  30. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  31. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  32. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  33. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  34. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  35. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  36. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  37. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  38. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved